ምርት

1. 1.ዳራ

Nitrofurans በጣም ጥሩ ፀረ-ባክቴሪያ እና ፋርማሲኬቲክ ባህሪ ስላለው በእንስሳት ምርት ውስጥ በተደጋጋሚ ጥቅም ላይ የሚውሉ ሰራሽ ሰፊ-ስፔክትረም አንቲባዮቲኮች ናቸው።እንዲሁም በአሳማ፣ በዶሮ እርባታ እና በውሃ ውስጥ ምርት ውስጥ የእድገት አራማጆች ሆነው ያገለግሉ ነበር።በላብራቶሪ እንስሳት ላይ የረዥም ጊዜ ጥናቶች እንደሚያመለክቱት የወላጅ መድሃኒቶች እና ሜታቦሊቲዎቻቸው የካርሲኖጂካዊ እና የ mutagenic ባህሪያትን ያሳያሉ።ይህም ለምግብነት የሚውሉ እንስሳትን ለማከም ናይትሮፊራንን መከልከልን አስከትሏል.በ 1993 የኒትሮፊራን መድኃኒቶች furaltadone ፣ nitrofurantoin እና nitrofurazone በአውሮፓ ህብረት ውስጥ በምግብ እንስሳት ምርት ውስጥ ጥቅም ላይ እንዳይውሉ ታግደዋል እና በ 1995 ፉራዞሊዶን መጠቀም የተከለከለ ነው።

የኒትሮፊራን መድሐኒቶች ቅሪት ትንተና የኒትሮፊራን ወላጅ መድኃኒቶች ቲሹ የታሰሩ ሜታቦላይቶችን በመለየት ላይ የተመሠረተ መሆን አለበት።ወላጅ መድኃኒቶች በጣም በፍጥነት ተፈጭቶ ናቸው, እና ቲሹ የታሰሩ nitrofuran metabolites ለረጅም ጊዜ የሚቆይ በመሆኑ, እነዚህ metabolites Furazolidone metabolite (AOZ), Furaltadone metabolite (AMOZ) ያካትታሉ ይህም nitrofurans ያለውን አላግባብ ያለውን ማወቂያ ውስጥ ዒላማ ሆኖ ጥቅም ላይ ይውላሉ. , Nitrofurantoin metabolite (AHD) እና Nitrofurazone metabolite (SEM).

የ AOZ-ቅሪቶች በአብዛኛው የሚወሰኑት በ LC-MS ወይም LC-MS/MS ነው።የኢንዛይም በሽታ መከላከያ ዘዴዎች ከ chromatographic ዘዴዎች ጋር ሲነፃፀሩ የስሜታዊነት ፣ የመለየት ገደብ ፣ የቴክኒክ መሣሪያዎች እና የጊዜ ፍላጎትን በተመለከተ ትልቅ ጥቅሞችን ያሳያሉ።(የጊዜ ወጪ፡ 45 ደቂቃ)

1. 2.የሙከራ መርህ

ይህ የ ELISA ኪት በተዘዋዋሪ-ተፎካካሪ ኢንዛይም immunoassay መርህ ላይ በመመስረት AOZን ለመለየት የተነደፈ ነው።የማይክሮቲተር ጉድጓዶች ከ BSA ጋር በተገናኘ አንቲጂን ተሸፍነዋል።AOZ በናሙና ውስጥ ለተጨመረው ፀረ እንግዳ አካል በማይክሮቲተር ጠፍጣፋ ላይ ከተሸፈነው አንቲጂን ጋር ይወዳደራል።የኢንዛይም ኮንጁጌት ከተጨመረ በኋላ ክሮሞጂካዊ ንጥረ ነገር ጥቅም ላይ ይውላል እና ምልክቱ የሚለካው በ spectrophotometer ነው.መምጠጥ በናሙናው ውስጥ ካለው የ AOZ ክምችት ጋር የተገላቢጦሽ ነው.

1. 3.መተግበሪያዎች

ይህ ኪት በ AOZ ቀሪዎች ውስጥ በቁጥር እና በጥራት ትንተና ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል።አኒማ ቲሹዎች(ጡንቻ, ጉበት ወዘተ), ማር.

1. 4.ተሻጋሪ ምላሽ

Furazolidone metabolite (AOZ) ………………………………….. 100%

Furaltadone metabolite (AMOZ) …………………………………………………

ናይትሮፉራንቶይን ሜታቦላይት (ኤኤችዲ) ………………………………….

ናይትሮፊራዞን ሜታቦላይት (ሴም) …………………………………………………

Furazolidone …………………………………………………………………………… 16.3%

Furaltadone …………………………………………………………………………………………………………

ኒትሮፉራንቶይን …………………………………………………. <1%

ናይትሮፉራዞን …………………………………………………………………………………………………

1. 5.የሚያስፈልጉ ቁሳቁሶች

5.1መሳሪያዎች

---- የማይክሮቲተር ፕሌትስ ስፔክሮፖቶሜትር (450nm/630nm)

---- Rotary evaporator ወይም ናይትሮጅን ማድረቂያ መሳሪያዎች

---- ሆሞጀኒዘር / የሆድ ዕቃ

----ሻከር

---- የቮርቴክስ ማደባለቅ

---- ሴንትሪፉጅ

---- የትንታኔ ሚዛን (ኢንደክሽን፡ 0.01ግ)

----የተመረቀ pipette: 10ml

---- የጎማ ፓይፕ አምፖል

----የቮልሜትሪክ ብልቃጥ: 100ml

----የመስታወት ብልቃጥ: 10ml

---- የ polystyrene ሴንትሪፉጅ ቱቦ: 2ml, 50ml

---- ማይክሮፒፔትስ፡ 20ul-200ul፣ 100ul-1000ul፣

250ul-multipipette

5.2ሬጀንቶች

---- ኤቲል አሲቴት (ኤአር)

----n-hexane (ወይም n-heptane) (AR)

---- ዲፖታሲየም ሃይድሮጂን ፎስፌት ትራይሃይድሬት

(K₂HPO₄.3ህ₂ኦ) (አር)

----የተጠራቀመ ሃይድሮክሎሪክ አሲድ (HCl፣ AR)

---ሜታኖል

---- ሶዲየም ሃይድሮክሳይድ (NaOH, AR)

---- ዲዮኒዝድ ውሃ

1. 6.Kit ክፍሎች

l ማይክሮቲተር ጠፍጣፋ በአንቲጂን የተሸፈነ, 96 ጉድጓዶች

l መደበኛ መፍትሄዎች (6 ጠርሙሶች ፣ 1 ml / ጠርሙስ)

0ppb፣0.025ppb፣0.075ppb፣0.225ppb፣0.675ppb፣2.025ppb

l ስፒኪንግ መደበኛ መቆጣጠሪያ: (1ml / ጠርሙስ) .......100 ፒ.ቢ

l ኮንሰንትሬትድ ኢንዛይም conjugate 1ml ...... ቀይ ቆብ

l ኢንዛይም conjugate diluents 10ml ………………. አረንጓዴ ካፕ

l Substrate A 7ml ………………………………………………………. ነጭ ካፕ

l Substrate B 7ml ………………………………………………………. ቀይ ካፕ

l የማቆሚያ መፍትሄ 7ml………………………………………………………

l 20 × የተከማቸ ማጠቢያ መፍትሄ 40ml

……………………………………………………………………………………

l 2× የተከማቸ የማውጣት መፍትሄ 60ml….ሰማያዊ ካፕ

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………………. ነጭ ካፕ

1. 7.Reagents ዝግጅት

መፍትሄ 1የመነጨ reagent:

2-Nitrobenzaldehyde ባለው ጠርሙስ ውስጥ 10 ሚሊ ሜትር ሜታኖል ይጨምሩ እና ይቀልጡት።(በ 10 ሚ.ሜ ክምችት).

መፍትሄ 2: 0.1MK₂HPO₄መፍትሄ፡-

ክብደት 22.8g ኪ₂HPO₄.3ህ₂ከኦ እስከ 1 ሊትር የተቀላቀለ ውሃ ለመቅለጥ።

መፍትሄ 3: 1M HCl መፍትሄ

8.3 ሚሊር የተከማቸ ሃይድሮክሎሪክ አሲድ ይቀልጡ ከተጣራ ውሃ ጋር እስከ 100 ሚሊ ሊትር.

መፍትሄ 4፡1M NaOH መፍትሄ

4ጂ ናኦኤች በ100ሚሊ ዲዮኒዝድ ውሃ ይፍቱ።

መፍትሄ 5የማውጣት መፍትሄ

በ 1: 1 የድምፅ ሬሾ ውስጥ 2 × የተከማቸ የማውጣት መፍትሄ በዲዮኒዝድ ውሃ ይቀንሱ.ይህ መፍትሄ ለ 1 ወር በ 4 ℃ ውስጥ ሊከማች ይችላል ፣ ይህም ናሙናዎችን ለማውጣት ያገለግላል ።

መፍትሄ 6የማጠቢያ መፍትሄ

በ 1:19 የድምፅ መጠን ውስጥ 20 × የተከማቸ ማጠቢያ መፍትሄን በዲዮኒዝድ ውሃ ይቀንሱ, ይህም ሳህኖቹን ለማጠብ ያገለግላል.ይህ የተዳከመ መፍትሄ ለ 1 ወር በ 4 ℃ ውስጥ ሊከማች ይችላል.

1. 8.የናሙና ዝግጅት

8.1ከስራ በፊት ማስጠንቀቂያዎች እና ጥንቃቄዎች፡-

ሀ) እባክዎን በሙከራው ውስጥ የአንድ ጊዜ ጠቃሚ ምክሮችን ይጠቀሙ እና የተለያዩ ሪአጀንትን በሚስቡበት ጊዜ ምክሮቹን ይለውጡ።

ለ) ሁሉም የሙከራ መሳሪያዎች ንጹህ መሆናቸውን ያረጋግጡ።

ሐ) የመነጩ reagent ከ2-8 ℃ ለሶስት ወራት ሊቆይ ይችላል ።

መ) የ HCl መፍትሄ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 3 ወራት ሊቆይ ይችላል;

ሠ) የ NaOH መፍትሄ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 3 ወራት ሊቆይ ይችላል;

ረ) ያልታከሙ ናሙናዎችን በበረዶ ውስጥ ያስቀምጡ (-20 ℃);

ሰ) የታከሙ ናሙናዎች ለ 24 ሰአት በ 2-8 ℃ በጨለማ ውስጥ ሊቀመጡ ይችላሉ.

8.2 የእንስሳት ቲሹ እና የጉበት ናሙናዎች;

---- ናሙናዎችን በሆሞጂኒዘር (homogenizer) ያድርጉ;

----ክብደት 1.0±0.05g ግብረ-ሰዶማዊ ቲሹ ናሙና ወደ 50ml polystyrene centrifuge tube.4ml የተዳከመ ውሃ፣ 0.5ml 1M HCl መፍትሄ እና 100ul ዲሪቭቲቭ ሪአጀንት ይጨምሩ (መፍትሔ 1 ይመልከቱ)።ለ 2 ደቂቃ ያናውጡት።

---- በአንድ ሌሊት በ 37 ℃ (16 ሰአታት አካባቢ) መክተት;

---- 5ml 0.1MK ይጨምሩ₂HPO₄ (መፍትሄ2)፣ 0.4ml 1ሚ ናኦኤች (መፍትሄ4) እና 5 ml ethyl acetate.ለ 30 ዎቹ አጥብቀው ይንቀጠቀጡ;

---- ሴንትሪፉጅ በክፍል ሙቀት (20-25 ℃) ለ 10 ደቂቃ, ቢያንስ 3000 ግራም;

---- 2.5ml ከግዙፉ የኦርጋኒክ ደረጃ ወደ 10ml ንጹህ የመስታወት ቱቦ ይውሰዱ፣ ከ50-60℃ ናይትሮጅን ጋዝ ወይም ሮታሪ ትነት ማድረቅ።

---- የደረቀውን የተረፈውን በ 1ml n-hexane (ወይም n-heptane)፣ አዙሪት ለ30ዎች፣ 1ml የማውጣት መፍትሄ (መፍትሄ) ይጨምሩ።መፍትሄ5) ፣ አዙሪት 1 ደቂቃ ፣ ሙሉ በሙሉ ይቀላቅሉ።

---- ሴንትሪፉጅ በክፍል ሙቀት (20-25^oሐ) ለ 5 ደቂቃዎች, ቢያንስ 3000 ግራም;

---- ከፍተኛውን የኦርጋኒክ ደረጃን ያስወግዱ;ለመገምገም 50μl የንዑስ ፕላስተር ውሃ ክፍል ይውሰዱ።

8.4 ማር

---- 1.0 ± 0.05 ግራም ተመሳሳይ የሆነ የማር ናሙና ወደ 50 ሚሊ ሜትር የ polystyrene ሴንትሪፉጅ ቱቦ;

----4ml የተዳከመ ውሃ፣ 0.5ml 1M HClመፍትሄ3) እና 100μl ተዋጽኦ reagent (መፍትሄ1);ለ 2 ደቂቃዎች ሙሉ በሙሉ መንቀጥቀጥ;

----በሌሊት 37 ℃ ላይ (16 ሰአታት ገደማ) ላይ ማብቀል;

----5ml 0.1MK ይጨምሩ₂HPO₄ (መፍትሄ2)፣ 0.4ml 1ሚ ናኦኤች (መፍትሄ4) እና 5ml ethyl acetate, ለ 30 ዎች አጥብቀው ይንቀጠቀጡ;

--- ሴንትሪፉጅ በክፍል ሙቀት (20-25 ℃) ለ 10 ደቂቃ, ቢያንስ 3000 ግራም;

----2.5ml ከከፍተኛው የኦርጋኒክ ደረጃ ወደ 10ml ንጹህ የመስታወት ቱቦ ይውሰዱ፣ ከ50-60℃ ናይትሮጅን ጋዝ ወይም ሮታሪ ትነት ማድረቅ;

----የደረቀውን የተረፈውን በ1ml n-hexane (ወይም n-heptane)፣ አዙሪት ለ 30ዎች፣ 1ml የማውጣት መፍትሄ (መፍትሄ) ይጨምሩ።መፍትሄ5) ፣ አዙሪት 1 ደቂቃ ፣ ሙሉ በሙሉ ይቀላቅሉ።

---- ሴንትሪፉጅ በክፍል ሙቀት (20-25^oሐ) ለ 10 ደቂቃዎች, ቢያንስ 3000 ግራም;

---- ከመጠን በላይ የሆነ የኦርጋኒክ ደረጃን ያስወግዱ;ለመገምገም 50μl የንዑስ ፕላስተር ውሃ ክፍል ይውሰዱ።

1. 9.የመተንተን ሂደት

9.1ከመመርመሩ በፊት አስተውል

9.1.1 ሁሉም ሬጀንቶች እና ማይክሮዌልች ሁሉም በክፍል ሙቀት (20-25 ℃) መሆናቸውን ያረጋግጡ።

9.1.2 ከተጠቀሙ በኋላ ሁሉንም የቀሩትን ሬጀንቶች ወደ 2-8 ℃ ይመልሱ።

9.1.3 ማይክሮዌልን በትክክል ማጠብ በምርመራው ሂደት ውስጥ አስፈላጊ እርምጃ ነው;የ ELISA ትንታኔን እንደገና ለማራባት ወሳኝ ነገር ነው.

9.1.4 መብራቱን ያስወግዱ እና ማይክሮዌልቶችን በክትባት ጊዜ ይሸፍኑ.

9.2 የመመርመሪያ ደረጃዎች

9.2.1 ሁሉንም ሬጀንቶች በክፍል ሙቀት (20-25 ℃) ከ 30 ደቂቃ በላይ ይውሰዱ ፣ ከመጠቀምዎ በፊት ተመሳሳይነት ያድርጉ።

9.2.2 የሚፈለጉትን ማይክሮዌልች አውጥተው ቀሪውን ወደ ዚፕ መቆለፊያ ቦርሳ ከ2-8℃ ወዲያውኑ ይመልሱ።

9.2.3 የተከማቸ ማጠቢያ መፍትሄ እና የተከማቸ የማውጣት መፍትሄ ከመጠቀምዎ በፊት በክፍል ሙቀት ውስጥ መሆን አለበት.

9.2.4ቁጥር፡-በእያንዳንዱ የማይክሮዌል አቀማመጥ የተቆጠሩ እና ሁሉም ደረጃዎች እና ናሙናዎች በሁለት ቅጂዎች መከናወን አለባቸው።ደረጃዎችን እና የናሙና ቦታዎችን ይመዝግቡ።

9.2.5የተከማቸ ፀረ እንግዳ አካላት መፍትሄን ማቅለጥበ 1:10 (1 እጥፍ የተጠናከረ የኢንዛይም መፍትሄ: 10 folds ኢንዛይም conjugate diluents) ውስጥ የተከማቸ የኢንዛይም መፍትሄን ከኢንዛይም conjugate ፈሳሾች ጋር ያርቁ።

9.2.6መደበኛ መፍትሄ / ናሙና እና የኢንዛይም ውህደት መፍትሄ ይጨምሩ: 50µl መደበኛ መፍትሄ ወይም የተዘጋጀ ናሙና ወደ ተጓዳኝ ጉድጓዶች ይጨምሩ፣ 50µl የኢንዛይም ኮንጁጌት መፍትሄ ይጨምሩ።ሳህኑን በእጅ በማወዛወዝ በቀስታ ይቀላቅሉ እና ለ 30 ደቂቃዎች በ 25 ℃ ሽፋን ይሸፍኑ።

9.2.7ማጠብ: ሽፋኑን በቀስታ ያስወግዱ እና ፈሳሹን ከጉድጓድ ውስጥ ያፈስሱ እና ማይክሮዌሎችን በ 250µl የተበጠበጠ ማጠቢያ መፍትሄ ያጠቡ (መፍትሄ6) በ 10 ሰከንድ መካከል ለ 4-5 ጊዜ.የተረፈውን ውሃ በሚስብ ወረቀት (የተቀረው የአየር አረፋ ጥቅም ላይ ባልዋለ ጫፍ ሊወገድ ይችላል)።

9.2.8ቀለም መቀባትበእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 50µl substrate መፍትሄ A እና 50ul substrate solution B ይጨምሩ።ሳህኑን በእጅ በማወዛወዝ በቀስታ ይቀላቅሉ እና ለ 15 ደቂቃዎች በ 25 ℃ ከሽፋኑ ጋር (12.8 ይመልከቱ)።

9.2.11ለካበእያንዳንዱ ጉድጓድ ላይ 50µl የማቆሚያውን መፍትሄ ይጨምሩ።ሳህኑን በእጅ በማወዛወዝ በቀስታ ያዋህዱ እና የመምጠጥ መጠኑን በ 450 nm ይለኩ (በ 450/630 nm ባለሁለት-ሞገድ ርዝመት እንዲለካ ሀሳብ አቅርቧል። የማቆሚያ መፍትሄ ከተጨመረ በኋላ ውጤቱን በ 5 ደቂቃ ውስጥ ያንብቡ።)

10 ውጤቶች

10.1መቶኛ መምጠጥ

ለመመዘኛዎቹ የተገኙት የመምጠጥ እሴቶች አማካኝ እሴቶች እና ናሙናዎች በመጀመሪያው ስታንዳርድ (ዜሮ ስታንዳርድ) የመምጠጥ ዋጋ የተከፋፈሉ እና በ 100% ተባዝተዋል።የዜሮ መስፈርቱ ከ 100% ጋር እኩል ነው እና የመምጠጥ እሴቶቹ በመቶኛ ይጠቀሳሉ።

=

B —— የመጠጣት ደረጃ (ወይም ናሙና)

B0 ——የመምጠጥ ዜሮ መስፈርት

10.2መደበኛ ኩርባ

---- ደረጃውን የጠበቀ ኩርባ ለመሳል፡ የመመዘኛዎችን የመምጠጥ ዋጋ እንደ y-ዘንግ፣ ከፊል ሎጋሪዝም የ AOZ መደበኛ መፍትሄ (ppb) ትኩረት እንደ x-ዘንግ ይውሰዱ።

---- ከካሊብሬሽን ከርቭ የሚነበበው የእያንዳንዱ ናሙና (ppb) የ AOZ ክምችት በእያንዳንዱ ናሙና በሚከተለው ተጓዳኝ የማሟሟት ሁኔታ ተባዝቶ ትክክለኛው የናሙና ክምችት ተገኝቷል።

እባክዎን ያስተውሉ፡

ለሁሉም የውሂብ ቅነሳ ልዩ ሶፍትዌር ተዘጋጅቷል፣ ይህም በጥያቄ ሊቀርብ ይችላል።

የማሟሟት ሁኔታ…………………………………………………………………………………

10.ትብነት, ትክክለኛነት እና ትክክለኛነት

ስሜታዊነት: 0.025 ፒፒቢ

የማወቅ ገደብ፡

ቲሹ (ጡንቻ፣ ጉበት) ………………………………………………… 0.1ppb

ማር ---- -0.1 ፒ.ቢ

ትክክለኛነት፡

የእንስሳት ቲሹ (ጡንቻ እና ጉበት) ………………………………… 100 ± 20%

ማር ………………………………………………………………………………………… 100±20%

ትክክለኛነት፡የELISA ኪት ሲቪ ከ10% በታች ነው።

11.ማስታወቂያ

12.1 ለመመዘኛዎቹ የተገኙት የመምጠጥ እሴቶቹ አማካኝ እሴቶች እና ናሙናዎቹ ወደ ክፍል የሙቀት መጠን (20-25 ℃) ካልተቀናጁ ናሙናዎቹ ይቀንሳሉ።

12.2 ያልተሳካ መራባትን ለማስወገድ ማይክሮዌል በደረጃዎች መካከል እንዲደርቅ አይፍቀዱ እና የማይክሮዌል መያዣውን ከነካ በኋላ ወዲያውኑ ቀጣዩን እርምጃ ይውሰዱ።

12.3 ከመጠቀምዎ በፊት እያንዳንዱን ሬጀንት በቀስታ ያናውጡ።

12.4 ቆዳዎን ከማቆሚያው መፍትሄ ያርቁ ምክንያቱም 0.5MH ነው₂SO₄መፍትሄ.

12.5 ኪቶቹን ጊዜው ያለፈበት አይጠቀሙ።የተለያዩ ባች ሪጀንተሮችን አትለዋወጡ፣ አለበለዚያ ስሜቱ ይቀንሳል።

12.6 የማከማቻ ሁኔታ፡ የELISA ኪትቹን ከ2-8℃ ያቆዩት፣ አይቀዘቅዙ።የማይክሮዌል ንጣፎችን ያሽጉ ፣ በሁሉም ማቀፊያዎች ጊዜ ቀጥተኛ የፀሐይ ብርሃንን ያስወግዱ።የማይክሮቲተር ንጣፎችን መሸፈን ይመከራል.

12.7 የንዑስ መፍትሄ ቀለሞችን ከቀየሩ መተው አለበት.የዜሮ ደረጃው የመምጠጥ ዋጋ (450/630nm) ከ0.5 (A450nm<0.5) ያነሰ ከሆነ ሬጀንቶቹ ሊበላሹ ይችላሉ።

12.8 የከርሰ ምድር መፍትሄ ከተጨመረ በኋላ የቀለም ምላሽ 15 ደቂቃ ያስፈልገዋል;ቀለሙን ለመለየት በጣም ቀላል ከሆነ የመታቀፉን ጊዜ ወደ 20 ደቂቃ ወይም ከዚያ በላይ ማራዘም ይችላሉ., ከ 25 ደቂቃ አይበልጡ. በተቃራኒው, የመታቀፉን ጊዜ በትክክል ያሳጥሩ.

12.9 ጥሩው የምላሽ ሙቀት 25 ℃ ነው።ከፍ ያለ ወይም ዝቅተኛ የሙቀት መጠን ወደ ስሜታዊነት እና የመሳብ እሴቶች ለውጦች ይመራል።

12.የማከማቻ ሁኔታ እና የማከማቻ ጊዜ

የማከማቻ ሁኔታ: 2-8 ℃.

የማከማቻ ጊዜ: 12 ወራት.