المنتج

1. 1.خلفية

النيتروفوران عبارة عن مضادات حيوية اصطناعية واسعة الطيف ، تستخدم كثيرًا في الإنتاج الحيواني لخصائصها الممتازة المضادة للبكتيريا والحركية الدوائية.كما تم استخدامها كمحفزات للنمو في إنتاج الخنازير والدواجن والأحياء المائية.أشارت الدراسات طويلة المدى مع حيوانات المختبر إلى أن الأدوية الأم ومستقلباتها أظهرت خصائص مسرطنة ومطفرة.وقد أدى ذلك إلى حظر استخدام النيتروفوران في معالجة الحيوانات المستخدمة في إنتاج الغذاء.تم حظر استخدام عقاقير النيتروفوران فورالتادون ونتروفورانتوين ونتروفورازون في الإنتاج الحيواني الغذائي في الاتحاد الأوروبي في عام 1993 ، كما تم حظر استخدام فيورازوليدون في عام 1995.

يجب أن يستند تحليل بقايا عقاقير النيتروفوران إلى الكشف عن نواتج الأيض المرتبطة بالأنسجة للأدوية الأم للنيتروفيوران.نظرًا لأن الأدوية الأم يتم استقلابها بسرعة كبيرة ، وستحتفظ مستقلبات النيتروفوران المرتبطة بالأنسجة لفترة طويلة ، يتم استخدام هذه المستقلبات كهدف في الكشف عن تعاطي النيتروفوران ، بما في ذلك مستقلب الفورازوليدون (AOZ) ، ومستقلب فورالتادون (AMOZ) ) ، مستقلب النيتروفورانتوين (AHD) ومستقلب النيتروفورازون (SEM).

يتم تحديد بقايا AOZ بشكل شائع بواسطة LC-MS أو LC-MS / MS.تُظهر المقايسات المناعية للإنزيمات ، مقارنة بالطرق الكروماتوغرافية ، مزايا كبيرة فيما يتعلق بالحساسية وحدود الكشف والمعدات التقنية ومتطلبات الوقت.(تكلفة الوقت: 45 دقيقة)

1. 2.مبدأ الاختبار

تم تصميم مجموعة ELISA هذه لاكتشاف AOZ بناءً على مبدأ المقايسة المناعية للإنزيم التنافسي غير المباشر.إن الآبار الدقيقة مغطاة بمستضد مرتبط بـ BSA.يتنافس AOZ في العينة مع المستضد المطلي على لوحة microtiter للجسم المضاد المضاف.بعد إضافة الإنزيم المتقارن ، يتم استخدام الركيزة الصبغية ويتم قياس الإشارة بواسطة مقياس الطيف الضوئي.يتناسب الامتصاص عكسياً مع تركيز AOZ في العينة.

1. 3.التطبيقات

يمكن استخدام هذه المجموعة في التحليل الكمي والنوعي لبقايا AOZ فيأنيما(عضلات ، كبد ، إلخ) ، عسل.

1. 4.ردود الفعل المتصالبة

مستقلب الفورازوليدون (AOZ) …………………… .. 100٪

مستقلب فورالتادون (AMOZ) ……………………………> 0.1٪

مستقلب النيتروفورانتوين (AHD) ................................... <0.1٪

مستقلب النيتروفورازون (SEM) ............................. ... ... <0.1٪

فيورازوليدون ..................................... ...... 16.3٪

فورالتادون ……………………………………………… ..… <1٪

Nitrofurantoin …………………………………… .. …….… <1٪

نتروفورازون ………………………………………… ..… <1٪

1. 5.المواد المطلوبة

5.1المعدات

---- مقياس الطيف الضوئي ذو الألواح الدقيقة (450 نانومتر / 630 نانومتر)

---- مبخر دوار أو أدوات تجفيف النيتروجين

---- الخالطون / المعدة

---- شاكر

---- خلاط دوامة

----جهاز الطرد المركزي

---- ميزان تحليلي (الحث: 0.01 جرام)

---- ماصة متدرجة: 10 مللي

---- لمبة ماصة مطاطية

---- دورق حجمي: 100 مللي

---- دورق زجاجي: 10 مللي

---- أنبوب البوليسترين الطرد المركزي: 2 مل ، 50 مل

---- الماصات الدقيقة: 20ul-200ul ، 100ul-1000ul ،

250ul متعدد الماصة

5.2الكواشف

---- خلات الإيثيل (AR)

---- n- الهكسان (أو n- هيبتان) (AR)

---- ثلاثي فوسفات الهيدروجين ثنائي البوتاسيوم

(K₂HPO₄.3H₂س) (عربي)

---- حمض الهيدروكلوريك المركز (حمض الهيدروكلوريك ، AR)

----- الميثانول

---- هيدروكسيد الصوديوم (NaOH ، AR)

----الماء منزوع الأيونات

1. 6.مكونات الطقم

ل صفيحة ميكروترية مغلفة بمستضد ، 96 بئراً

ل الحلول القياسية (6 زجاجات ، 1 مل / زجاجة)

0ppb ، 0.025ppb ، 0.075ppb ، 0.225ppb ، 0.675ppb ، 2.025ppb

l التحكم القياسي في السفع: (1 مل / زجاجة) ....….100 جزء في المليون

ل إنزيم مركّز متقارن 1 مل ...… .. غطاء أحمر

ل مخففات الإنزيم 10 مل ……… .. غطاء أخضر

ل الركيزة أ 7 مل ……… ..............… ....… ..… .. غطاء أبيض

ل الركيزة ب 7 مل ……… ..............… ........….… .. غطاء أحمر

ل وقف الحل 7 مل .............................. غطاء أصفر

ل 20 × محلول غسيل مركز 40 مل

…………………………………… .. …… غطاء شفاف

ل 2 × محلول استخلاص مركز 60 مل .. غطاء أزرق

ل 2 - نيتروبنزالديهايد 15.1 ملغ ………………. غطاء أبيض

1. 7.تحضير الكواشف

المحلول 1: كاشف مشتق:

أضف 10 مل من الميثانول إلى الزجاجة التي تحتوي على 2-Nitrobenzaldehyde وتذوب.(بتركيز 10 ملم).

المحلول 2: 0.1 ميجا بايت₂HPO₄المحلول:

وزن 22.8 جرام ك₂HPO₄.3H₂O إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات ليذوب.

المحلول 3: محلول حمض الهيدروكلوريك 1M

قم بإذابة 8.3 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز مع الماء منزوع الأيونات إلى 100 مل.

الحل 4:1 م محلول هيدروكسيد الصوديوم

قم بإذابة 4 جم من هيدروكسيد الصوديوم في 100 مل من الماء منزوع الأيونات.

الحل 5: حل الاستخراج:

تمييع 2 × محلول استخلاص مركز بماء منزوع الأيونات بنسبة حجم 1: 1.يمكن حفظ هذا المحلول لمدة شهر واحد عند 4 درجات مئوية ، والتي سيتم استخدامها لاستخراج العينات.

المحلول 6: محلول غسيل:

قم بتخفيف محلول الغسيل المركز 20 × بالماء منزوع الأيونات بكمية حجم 1:19 ، والتي سيتم استخدامها لغسل الأطباق.يمكن حفظ هذا المحلول المخفف لمدة شهر عند 4 ℃.

1. 8.تحضيرات العينة

8.1ملاحظات و احتياطات قبل العملية:

أ) يرجى استخدام نصائح لمرة واحدة في التجربة ، وتغيير النصائح عند امتصاص كاشف مختلف.

ب) تأكد من أن جميع الأدوات التجريبية نظيفة.

ج) يمكن حفظ الكاشف المشتق عند 2-8 ℃ لمدة ثلاثة أشهر ؛

د) يمكن حفظ محلول حمض الهيدروكلوريك في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 أشهر ؛

ه) يمكن حفظ محلول NaOH لمدة 3 أشهر في درجة حرارة الغرفة ؛

و) الاحتفاظ بالعينات غير المعالجة في حالة التجميد (-20 درجة مئوية) ؛

ز) يمكن حفظ العينات المعالجة لمدة 24 ساعة عند 2-8 ℃ في الظلام.

8.2 عينات الأنسجة الحيوانية والكبد:

---- تجانس العينات مع الخالط.

---- الوزن 1.0 ± 0.05 جم من عينة الأنسجة المتجانسة في أنبوب طرد مركزي من البوليسترين سعة 50 مل.أضف 4 مل من الماء منزوع الأيونات ، 0.5 مل 1 م من محلول حمض الهيدروكلوريك وكاشف مشتق 100ul (انظر الحل 1).رجها لمدة 2 دقيقة.

---- احتضان عند 37 ℃ بين عشية وضحاها (حوالي 16 ساعة) ؛

---- أضف 5 مللي 0.1MK₂HPO₄ (المحلول2) ، 0.4 مل 1 م هيدروكسيد الصوديوم (المحلول4) و 5 مل أسيتات الإيثيل.رج بقوة لمدة 30 ثانية.

---- جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة (20-25 ℃) لمدة 10 دقائق ، 3000 جم على الأقل ؛

---- خذ 2.5 مل من الطور العضوي الطاف في أنبوب زجاجي نظيف 10 مل ، جافًا مع 50-60 غاز نيتروجين أو مبخر دوار ؛

---- قم بإذابة البقايا الجافة باستخدام 1 مل من n-hexane (أو n- هيبتان) ، دوامة لمدة 30 ثانية ، أضف محلول استخلاص 1 مل (المحلول5) ، دوامة 1 دقيقة ، تخلط تماما.

---- جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة (20-25^oج) لمدة 5 دقائق ، 3000 جم على الأقل ؛

---- إزالة المرحلة العضوية طاف.خذ 50 ميكرولتر من مرحلة الماء الركيزة للمقايسة.

8.4 العسل

---- وزن 1.0 ± 0.05 جم من عينة العسل المتجانس في أنبوب طرد مركزي من البوليسترين سعة 50 مل ؛

---- أضف 4 مل ماء منزوع الأيونات ، 0.5 مل 1 م حمض الهيدروكلوريك (المحلول3) وكاشف مشتق 100 ميكرولتر (المحلول1) ؛هز تماما لمدة 2 دقيقة ؛

---- احتضان عند 37 ℃ بين عشية وضحاها (حوالي 16 ساعة) ؛

---- أضف 5 مللي 0.1MK₂HPO₄ (المحلول2) ، 0.4 مل 1 م هيدروكسيد الصوديوم (المحلول4) و 5 مللي أسيتات الإيثيل ، يُرج بقوة لمدة 30 ثانية ؛

---- جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة (20-25 ℃) لمدة 10 دقائق ، 3000 جم على الأقل ؛

---- خذ 2.5 مل من الطور العضوي الطاف في أنبوب زجاجي نظيف 10 مل ، جافًا مع 50-60 غاز نيتروجين أو مبخر دوار ؛

---- قم بإذابة البقايا الجافة باستخدام 1 مل من n-hexane (أو n- هيبتان) ، دوامة لمدة 30 ثانية ، أضف محلول استخلاص 1 مل (المحلول5) ، دوامة 1 دقيقة ، تخلط تماما.

---- جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة (20-25^oج) لمدة 10 دقائق ، 3000 جم على الأقل ؛

---- إزالة المرحلة العضوية طاف.خذ 50 ميكرولتر من مرحلة الماء الركيزة للمقايسة.

1. 9.عملية الفحص

9.1لاحظ قبل الفحص

9.1.1 تأكد من أن جميع الكواشف والميكروويلات كلها في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية).

9.1.2 أعد جميع الكواشف المتبقية إلى 2-8 ℃ فورًا بعد الاستخدام.

9.1.3 يعد غسل ميكروويلس بشكل صحيح خطوة مهمة في عملية الفحص ؛إنه العامل الحيوي في استنساخ تحليل ELISA.

9.1.4 تجنب الضوء وقم بتغطية الميكروويلات أثناء الحضانة.

9.2 خطوات الفحص

9.2.1 إخراج جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لأكثر من 30 دقيقة ، وتجانسها قبل الاستخدام.

9.2.2 قم بإخراج الميكروويلات اللازمة وأعد الباقي إلى كيس السحاب بدرجة حرارة 2-8 ℃ على الفور.

9.2.3 يجب إعادة تسخين محلول الغسل المركز ومحلول الاستخلاص المركز ليكون في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

9.2.4عدد:يجب ترقيم كل مواقع ميكروويل وجميع المعايير والعينات في نسختين.سجل المعايير والمواقف العينات.

9.2.5تمييع محلول الجسم المضاد المركز: قم بتخفيف محلول الإنزيم المركز بمخففات الإنزيم المتقارن بنسبة حجم 1:10 (1 أضعاف محلول الإنزيم المركّز: 10 أضعاف مخففات الإنزيم المتقارن).

9.2.6أضف محلولًا قياسيًا / عينة ومحلول إنزيم متقارن: أضف 50 مايكرولتر من المحلول القياسي أو العينة المعدة إلى الآبار المقابلة ، أضف 50 ميكرولتر من محلول الإنزيم المتقارن.امزج بلطف عن طريق هز اللوحة يدويًا واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع الغطاء.

9.2.7غسل: انزع الغطاء برفق واسكب السائل من الآبار واشطف الميكروويلات بمحلول غسيل مخفف سعة 250 ميكرولتر (المحلول6) بفاصل 10 ثوانٍ لمدة 4-5 مرات.قم بامتصاص الماء المتبقي بورق ماص (يمكن التخلص من فقاعة الهواء المتبقية بطرف غير مستخدم).

9.2.8تلوين: أضف 50 مايكرولتر من محلول الركيزة أ و 50 مايكرولتر من محلول الركيزة ب لكل بئر.امزج بلطف عن طريق هز اللوحة يدويًا واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع غطاء (انظر 12.8).

9.2.11يقيس: أضف 50 مايكرولتر من محلول الإيقاف لكل بئر.امزج بلطف عن طريق هز اللوحة يدويًا وقياس الامتصاص عند 450 نانومتر (يقترح القياس بطول موجة مزدوج 450/630 نانومتر. اقرأ النتيجة في غضون 5 دقائق بعد إضافة محلول التوقف.)

10 نتائج

10.1نسبة الامتصاص

يتم تقسيم القيم المتوسطة لقيم الامتصاص التي تم الحصول عليها للمعايير والعينات على قيمة الامتصاصية للمعيار الأول (المعيار الصفري) ومضروبة في 100٪.وبذلك يصبح المعيار الصفري مساويًا لـ 100٪ وقيم الامتصاصية مقتبسة في النسب المئوية.

=

ب- معيار الامتصاص (أو العينة)

B0 —— معيار الامتصاص الصفري

10.2المنحنى القياسي

---- لرسم منحنى قياسي: خذ قيمة الامتصاص للمعايير كمحور ص ، شبه لوغاريتمي لتركيز محلول AOZ القياسي (جزء في البليون) كمحور س.

---- يتم ضرب تركيز AOZ لكل عينة (جزء في البليون) ، والذي يمكن قراءته من منحنى المعايرة ، في عامل التخفيف المقابل لكل عينة متبوعة ، ويتم الحصول على التركيز الفعلي للعينة.

من فضلك لاحظ:

تم تطوير برامج خاصة لجميع عمليات تقليل البيانات ، والتي يمكن توفيرها عند الطلب.

عامل التخفيف……………………………………… .. …… 2

10.الحساسية والدقة والدقة

حساسية: 0.025ppb

حد الكشف:

الأنسجة (العضلات والكبد) ............................................ 0.1 جزء في المليون

عسل------------------------------------------------- -0.1 جزء في المليون

صحة:

الأنسجة الحيوانية (العضلات والكبد) .......... 100 ± 20٪

العسل ……………………………… .. ………… .... 100 ± 20٪

دقة:السيرة الذاتية لمجموعة ELISA أقل من 10٪.

11.تنويه

12.1 سيتم تقليل القيم المتوسطة لقيم الامتصاص التي تم الحصول عليها للمعايير والعينات إذا لم يتم تنظيم الكواشف والعينات لدرجة حرارة الغرفة (20-25).

12.2 لا تدع الميكروويلات تجف بين الخطوات لتجنب التكاثر غير الناجح وقم بتشغيل الخطوة التالية مباشرة بعد النقر على حامل الميكروويلس.

12.3 خض كل مادة كاشفة برفق قبل الاستخدام.

12.4 حافظ على بشرتك بعيدًا عن محلول التوقف لأنه 0.5 مللي أمبير في الساعة₂SO₄المحلول.

12.5 لا تستخدم مجموعات قديمة.لا تتبادل الكواشف من دفعات مختلفة ، وإلا ستسقط الحساسية.

12.6 حالة التخزين: احتفظ بمجموعات ELISA عند 2-8 ℃ ، لا تجمد.ختم لوحات microwell الراحة ، وتجنب أشعة الشمس المباشرة خلال جميع الحضانات.يوصى بتغطية ألواح الميكروتيتر.

12.7 يجب التخلي عن محلول الركيزة إذا تحول الألوان.يمكن أن تتدهور الكواشف إذا كانت قيمة الامتصاص (450/630 نانومتر) لمعيار الصفر أقل من 0.5 (A450 نانومتر <0.5).

12.8 يحتاج تفاعل التلوين إلى 15 دقيقة بعد إضافة محلول الركيزة ؛يمكنك إطالة وقت الحضانة إلى 20 دقيقة أو أكثر إذا كان اللون فاتحًا للغاية بحيث يتعذر تحديده ، ولا تتجاوزي 25 دقيقة ، بل على العكس ، اختصري وقت الحضانة بشكل صحيح.

12.9 درجة حرارة التفاعل المثلى هي 25.سيؤدي ارتفاع درجة الحرارة أو انخفاضها إلى تغيرات في قيم الحساسية والامتصاص.

12.حالة التخزين وفترة التخزين

حالة التخزين: 2-8 ℃.

فترة التخزين: 12 شهرا.