məhsul

1. 1.Fon

Nitrofuranlar, əla antibakterial və farmakokinetik xüsusiyyətlərinə görə heyvan istehsalında tez-tez istifadə olunan sintetik geniş spektrli antibiotiklərdir.Onlar həmçinin donuz, quşçuluq və su istehsalında böyümə stimullaşdırıcıları kimi istifadə edilmişdir.Laboratoriya heyvanları ilə aparılmış uzunmüddətli tədqiqatlar göstərmişdir ki, ana dərmanlar və onların metabolitləri kanserogen və mutagen xüsusiyyətlər göstərmişdir.Bu, qida istehsalı üçün istifadə edilən heyvanların müalicəsi üçün nitrofuranların qadağan edilməsinə səbəb oldu.1993-cü ildə AB-də nitrofuran preparatları furaltadon, nitrofurantoin və nitrofurazonun qida heyvan istehsalında istifadəsi qadağan edildi və furazolidonun istifadəsi 1995-ci ildə qadağan edildi.

Nitrofuran preparatlarının qalıqlarının təhlili nitrofuranın əsas dərmanlarının toxuma ilə əlaqəli metabolitlərinin aşkarlanmasına əsaslanmalıdır.Əsas dərmanlar çox sürətlə metabolizə olunduğundan və toxuma ilə əlaqəli nitrofuran metabolitləri uzun müddət saxlandığından, bu metabolitlər Furazolidon metaboliti (AOZ), Furaltadon metaboliti (AMOZ) daxil olmaqla nitrofuranların sui-istifadəsinin aşkarlanmasında hədəf kimi istifadə olunur. ), Nitrofurantoin metaboliti (AHD) və Nitrofurazon metaboliti (SEM).

AOZ-qalıqları ən çox LC-MS və ya LC-MS/MS ilə müəyyən edilir.Ferment immunoanalizi, xromatoqrafik üsullarla müqayisədə, həssaslıq, aşkarlama həddi, texniki avadanlıq və vaxt tələbi ilə bağlı əhəmiyyətli üstünlüklər göstərir.(Vaxt dəyəri: 45 dəqiqə)

1. 2.Test prinsipi

Bu ELISA dəsti dolayı rəqabətli ferment immunoassay prinsipi əsasında AOZ-ni aşkar etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur.Mikrotitr quyuları tutma BSA ilə əlaqəli antigenlə örtülmüşdür.Nümunədəki AOZ əlavə edilmiş antikor üçün mikrotitr lövhəsi ilə örtülmüş antigenlə rəqabət aparır.Ferment konjugatı əlavə edildikdən sonra xromogen substrat istifadə olunur və siqnal spektrofotometrlə ölçülür.Absorbsiya nümunədəki AOZ konsentrasiyası ilə tərs mütənasibdir.

1. 3.Proqramlar

Bu dəst AOZ qalıqlarının kəmiyyət və keyfiyyət analizində istifadə edilə biləranima toxumaları(əzələ, qaraciyər və s.), bal.

1. 4.Çarpaz reaksiyalar

Furazolidon metaboliti (AOZ)……………………..100%

Furaltadon metaboliti (AMOZ)……………………<0,1%

Nitrofurantoin metaboliti (AHD)……………………<0,1%

Nitrofurazon metaboliti (SEM)………………………<0,1%

Furazolidon…………………………………….…..…16,3%

Furaltadon………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon…………………………………………..…<1%

1. 5.Tələb olunan materiallar

5.1Avadanlıqlar

----Mikrotitr lövhə spektrofotometri (450nm/630nm)

---- Fırlanan buxarlandırıcı və ya azot qurutma cihazları

----Homogenizator / mədə

----Şəkər

----Vortex qarışdırıcı

----Sentrifuqa

---- Analitik tarazlıq (induktivlik: 0,01 q)

----Məqsədli pipet: 10ml

----Rezin pipet lampası

---- Həcmli kolba: 100ml

---- Şüşə kolba: 10ml

----Polistirol sentrifuqa borusu: 2ml, 50ml

----Mikropipetlər: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipet

5.2Reagentlər

----Etil asetat (AR)

----n-heksan (və ya n-heptan) (AR)

----Dipotassium hidrogen fosfat trihidrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Konsentratlı xlor turşusu (HCl, AR)

-----Metanol

----Natrium hidroksid (NaOH, AR)

---- Deionlaşdırılmış su

1. 6.Kit Komponentləri

l Antigenlə örtülmüş mikrotitr lövhəsi, 96 quyu

l Standart məhlullar (6 şüşə, 1ml/şüşə)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Süpürgə standart nəzarəti: (1ml/şüşə)........100ppb

l Konsentratlı ferment konjugatı 1ml....... qırmızı qapaq

l Enzim konjugatı seyrelticilər 10ml………..yaşıl qapaq

l Substrat A 7ml…………………………..…..ağ qapaq

l Substrat B 7ml………………………………..qırmızı qapaq

l Stop məhlulu 7ml……………………………sarı qapaq

l 20×konsentratlı yuma məhlulu 40ml

…………………………………….………………….……şəffaf papaq

l 2×konsentratlı ekstraksiya məhlulu 60ml….mavi qapaq

l 2-Nitrobenzaldehid 15,1 mq………………ağ qapaq

1. 7.Reagentlərin hazırlanması

Həll 1: törəmə reagent:

2-Nitrobenzaldehid olan şüşəyə 10 ml metanol əlavə edin və həll edin.(10 mM konsentrasiyada).

Həll 2: 0.1MK₂HPO₄həll:

Çəkisi 22,8 q K₂HPO₄.3H₂O-dan 1L-ə qədər deionlaşdırılmış su həll etmək üçün.

Həll 3: 1M HCl məhlulu

8,3 ml konsentratlı xlorid turşusunu həll edin deionlaşdırılmış su ilə 100 ml.

Həll 4:1M NaOH məhlulu

4 q NaOH-u 100 ml deionlaşdırılmış su ilə həll edin.

Həll 5: ekstraksiya həlli:

2 x konsentratlı ekstraksiya məhlulunu 1:1 həcm nisbətində deionlaşdırılmış su ilə seyreltin.Bu məhlul 4 ℃ temperaturda 1 ay saxlanıla bilər ki, bu da götürülmüş nümunələr üçün istifadə olunacaq.

Həll 6: yuma məhlulu:

Plitələrin yuyulması üçün istifadə olunacaq 1:19 həcm nisbətində 20x konsentratlı yuma məhlulunu deionlaşdırılmış su ilə seyreltin.Bu seyreltilmiş məhlul 4°C temperaturda 1 ay saxlanıla bilər.

1. 8.Hazırlıq nümunələri

8.1Əməliyyatdan əvvəl xəbərdarlıq və ehtiyat tədbirləri:

a) Təcrübədə birdəfəlik ipuçlarından istifadə edin və müxtəlif reagentləri udarkən ucları dəyişdirin.

b) Bütün eksperimental alətlərin təmiz olduğundan əmin olun.

c) törəmə reagent üç ay ərzində 2-8°C temperaturda saxlanıla bilər;

d) HCl məhlulu otaq temperaturunda 3 ay saxlanıla bilər;

e) NaOH məhlulu otaq temperaturunda 3 ay saxlanıla bilər;

f) Təmizlənməmiş nümunələri dondurucuda (-20 ℃) ​​saxlayın;

g) Təmizlənmiş nümunələr qaranlıqda 2-8 ℃ temperaturda 24 saat saxlanıla bilər.

8.2 Heyvan toxuması və qaraciyər nümunələri:

----Nümunələri homogenizatorla homogenləşdirin;

---- 1,0±0,05 q homojenləşdirilmiş toxuma nümunəsini 50 ml polistirol sentrifuqa borusuna çəkin.4ml deionlaşdırılmış su, 0.5ml 1M HCl məhlulu və 100ul törəmə reagent əlavə edin (bax. məhlul 1).2 dəqiqə silkələyin.

---- Gecədə 37 ℃ temperaturda inkubasiya edin (təxminən 16 saat);

---- 5ml 0.1MK əlavə edin₂HPO₄ (həll2), 0.4ml 1M NaOH (həll4) və 5 ml etil asetat.30 saniyə şiddətlə silkələyin;

---- Otaq temperaturunda (20-25 ℃) 10 dəqiqə, ən azı 3000 q sentrifuqa;

---- 2,5 ml supernatant üzvi fazasını 10 ml təmiz şüşə boruya götürün, 50-60 ℃ azot qazı və ya fırlanan buxarlandırıcı ilə qurudun;

---- Quru qalığı 1 ml n-heksan (və ya n- heptan) ilə həll edin, 30 saniyə burulğan edin, 1 ml ekstraksiya məhlulu əlavə edin (həll5), burulğan 1 dəqiqə, tamamilə qarışdırın.

---- Otaq temperaturunda sentrifuqa edin (20-25^oC) 5 dəqiqə ərzində, ən azı 3000 q;

---- Supernatant üzvi fazanı çıxarın;analiz üçün substrat su fazasından 50μl götürün.

8.4 Bal

----homogenləşdirilmiş bal nümunəsinin 1,0±0,05 qramını 50 ml polistirol santrifüj borusuna çəkin;

---- 4ml deionlaşdırılmış su, 0.5ml 1M HCl əlavə edin (həll3) və 100μl törəmə reagent (həll1);2 dəqiqə tamamilə silkələyin;

---- Gecədə 37 ℃ temperaturda inkubasiya edin (təxminən 16 saat);

---- 5ml 0.1MK əlavə edin₂HPO₄ (həll2), 0.4ml 1M NaOH (həll4) və 5 ml etil asetat, 30 saniyə şiddətlə silkələyin;

----Otaq temperaturunda (20-25 ℃) 10 dəqiqə, ən azı 3000 q sentrifuqa;

---- 2,5 ml supernatant üzvi fazasını 10 ml təmiz şüşə boruya götürün, 50-60 ℃ azot qazı və ya fırlanan buxarlandırıcı ilə qurudun;

---- Quru qalığı 1 ml n-heksan (və ya n- heptan) ilə həll edin, 30 saniyə burulğan edin, 1 ml ekstraksiya məhlulu əlavə edin (həll5), burulğan 1 dəqiqə, tamamilə qarışdırın.

----Otaq temperaturunda sentrifuqa edin (20-25^oC) 10 dəqiqə, ən azı 3000 q;

---- Süpernatant üzvi fazanı çıxarın;analiz üçün substrat su fazasından 50μl götürün.

1. 9.Təhlil prosesi

9.1Təhlildən əvvəl xəbərdarlıq edin

9.1.1 Bütün reagentlərin və mikro quyuların hamısının otaq temperaturunda (20-25 ℃) olduğundan əmin olun.

9.1.2 İstifadədən dərhal sonra bütün qalan reagentləri 2-8 ℃ temperatura qaytarın.

9.1.3 Mikro quyuların düzgün yuyulması analiz prosesində mühüm addımdır;bu, ELISA analizinin təkrar istehsalı üçün vacib amildir.

9.1.4 İnkubasiya zamanı işıqdan çəkinin və mikroquyuları örtün.

9.2 Təhlil addımları

9.2.1 Bütün reagentləri otaq temperaturunda (20-25 ℃) 30 dəqiqədən çox çıxarın, istifadə etməzdən əvvəl homojenləşdirin.

9.2.2 Lazım olan mikro quyuları çıxarın və qalanlarını dərhal 2-8 ℃ temperaturda kilidli çantaya qaytarın.

9.2.3 Konsentratlaşdırılmış yuma məhlulu və konsentratlı ekstraksiya məhlulu istifadə etməzdən əvvəl otaq temperaturunda olmaq üçün yenidən qızdırılmalıdır.

9.2.4Nömrə:Hər bir mikroquyuğun mövqeləri nömrələnmiş və bütün standartlar və nümunələr iki nüsxədə işlənməlidir.Standartları və nümunə mövqelərini qeyd edin.

9.2.5Konsentratlı antikor məhlulunun seyreltilməsi: konsentratlaşdırılmış ferment məhlulunu 1:10 həcm nisbətində ferment konyuqat həllediciləri ilə seyreltin (1 qat qatılaşdırılmış ferment məhlulu: 10 qat ferment konyuqat seyrelticiləri).

9.2.6Standart məhlul / nümunə və ferment konjugatı məhlulu əlavə edin: 50µl standart məhlul və ya hazırlanmış nümunəni müvafiq quyulara əlavə edin, 50µl ferment konjugat məhlulu əlavə edin.Plitəni əl ilə silkələməklə yavaş-yavaş qarışdırın və qapaq ilə 25 ℃ temperaturda 30 dəqiqə inkubasiya edin.

9.2.7Yuyun: Qapağı yumşaq bir şəkildə çıxarın və mayeni quyulardan tökün və mikro quyuları 250 µl seyreltilmiş yuma məhlulu ilə yuyun (həll6) 10 saniyə aralığında 4-5 dəfə.Qalıq suyu uducu kağızla udun (qalan hava qabarcığını istifadə olunmamış uc ilə çıxarmaq olar).

9.2.8Rənglənmə: Hər quyuya 50µl substrat məhlulu A və 50ul substrat məhlulu B əlavə edin.Plitəni əl ilə silkələməklə yumşaq qarışdırın və qapaq ilə 25°C temperaturda 15 dəqiqə inkubasiya edin (bax 12.8).

9.2.11Ölçmək: Hər quyuya 50µl stop məhlulu əlavə edin.Lövhəni əl ilə silkələməklə yumşaq bir şəkildə qarışdırın və uduculuğu 450nm-də ölçün (Bu, 450/630nm ikili dalğa uzunluğu ilə ölçülməyi təklif edir. Dayanma məhlulu əlavə edildikdən sonra 5 dəqiqə ərzində nəticəni oxuyun. )

10 Nəticələr

10.1Emicilik faizi

Standartlar və nümunələr üçün alınmış absorbans qiymətlərinin orta qiymətləri birinci standartın (sıfır standart) absorbsiya qiymətinə bölünür və 100%-ə vurulur.Beləliklə, sıfır standartı 100%-ə bərabər tutulur və absorbans dəyərləri faizlə ifadə edilir.

=

B ——udma standartı (və ya nümunə)

B0 ——udma sıfır standartı

10.2Standart əyri

----Standart əyri çəkmək üçün: Standartların udma dəyərini y oxu kimi, AOZ standart məhlulunun konsentrasiyasının (ppb) yarı loqarifmikini x oxu kimi götürün.

----Kalibrləmə əyrisindən oxuna bilən hər bir nümunənin AOZ konsentrasiyası (ppb) izlənilən hər bir nümunənin müvafiq seyreltmə əmsalı ilə vurulur və nümunənin faktiki konsentrasiyası əldə edilir.

Diqqət yetirin:

Bütün məlumatların azaldılması üçün xüsusi proqram təminatı hazırlanmışdır ki, bu da sorğu ilə təmin edilə bilər.

Seyreltmə faktoru…………………………………………………2

10.Həssaslıq, dəqiqlik və dəqiqlik

Həssaslıq: 0,025 ppb

Aşkarlama limiti:

Doku (əzələ, qaraciyər)…………………………0.1ppb

Bal------------------------------------------------- -0,1 ppb

Dəqiqlik:

Heyvan toxuması (əzələ və qaraciyər)…………………100±20%

Bal…………………………………………………….. 100±20%

Dəqiqlik:ELISA dəstinin CV-si 10%-dən azdır.

11.Xəbərdarlıq

12.1 Reagentlər və nümunələr otaq temperaturuna (20-25 ℃) qədər tənzimlənmədikdə, standartlar və nümunələr üçün alınmış absorbans dəyərlərinin orta dəyərləri azalacaq.

12.2 Uğursuz təkrarlanmanın qarşısını almaq üçün mikro quyuların addımlar arasında qurumasına icazə verməyin və mikroquyuların saxlayıcısına toxunduqdan dərhal sonra növbəti addımı işə salın.

12.3 İstifadə etməzdən əvvəl hər bir reagenti yumşaq silkələyin.

12.4 Dərinizi dayandırıcı məhluldan uzaq tutun, çünki o, 0,5 MH-dir₂SO₄həll.

12.5 Vaxtı keçmiş dəstlərdən istifadə etməyin.Müxtəlif partiyaların reagentlərini dəyişdirməyin, əks halda həssaslığı aşağı salacaq.

12.6 Saxlama şəraiti: ELISA dəstlərini 2-8 ℃ temperaturda saxlayın, dondurmayın.Mikro quyu boşqablarını bağlayın, bütün inkubasiyalar zamanı düz günəş işığından çəkinin.Mikrotitr plitələrinin örtülməsi tövsiyə olunur.

12.7 Substrat məhlulu rənglərə çevrilərsə, ondan imtina edilməlidir.Sıfır standartın udma dəyəri (450/630nm) 0,5-dən (A450nm<0,5) az olarsa, reagentlər pisləşə bilər.

12.8 Rənglənmə reaksiyası substrat məhlulu əlavə edildikdən sonra 15 dəqiqə tələb olunur;Rəng müəyyən etmək üçün çox açıqdırsa, inkubasiya müddətini 20 dəqiqəyə və ya daha çox uzata bilərsiniz. Heç vaxt 25 dəqiqədən çox olmamalıdır. Əksinə, inkubasiya müddətini düzgün şəkildə qısaltın.

12.9 Optimal reaksiya temperaturu 25℃-dir.Yüksək və ya aşağı temperatur həssaslıq və absorbans dəyərlərinin dəyişməsinə səbəb olacaq.

12.Saxlama şəraiti və saxlama müddəti

Saxlama şəraiti: 2-8 ℃.

Saxlama müddəti: 12 ay.