продукт

Комплект за конкурентен ензимен имуноанализ за количествен анализ на метаболит Фуразолидон (AOZ)

Кратко описание:

Този комплект ELISA е предназначен за откриване на AOZ въз основа на принципа на индиректно-конкурентен ензимен имуноанализ.Микротитърните ямки са покрити с улавящ BSA-свързан антиген.AOZ в пробата се конкурира с антигена, покрит върху микротитърната плака за добавеното антитяло.След добавянето на ензимен конюгат се използва хромогенен субстрат и сигналът се измерва със спектрофотометър.Абсорбцията е обратно пропорционална на концентрацията на AOZ в пробата.


Подробности за продукта

Продуктови етикети

Комплект за конкурентен ензимен имуноанализ за

Количествен анализ наФуразолидон метаболит(AOZ)

 

  1. 1.Заден план

Нитрофураните са синтетични широкоспектърни антибиотици, които често се използват в животновъдството заради отличните си антибактериални и фармакокинетични свойства.Те също така са били използвани като стимулатори на растежа в производството на свине, птици и водни животни.Дългосрочни проучвания с лабораторни животни показват, че изходните лекарства и техните метаболити показват канцерогенни и мутагенни характеристики.Това доведе до забрана на нитрофураните за лечение на животни, използвани за производство на храни.Нитрофурановите лекарства фуралтадон, нитрофурантоин и нитрофуразон бяха забранени за употреба в производството на храни за животни в ЕС през 1993 г., а употребата на фуразолидон беше забранена през 1995 г.

Анализът на остатъците от нитрофуранови лекарства трябва да се основава на откриването на тъканно свързаните метаболити на нитрофурановите изходни лекарства.Тъй като изходните лекарства се метаболизират много бързо и тъканно-свързаните нитрофуранови метаболити ще се запазят за дълго време, тези метаболити се използват като цел при откриването на злоупотреба с нитрофурани, които включват метаболит Фуразолидон (AOZ), метаболит Фуралтадон (AMOZ). ), метаболит на нитрофурантоин (AHD) и метаболит на нитрофуразон (SEM).

AOZ-остатъците се определят най-често чрез LC-MS или LC-MS/MS.Имуноензимните анализи, в сравнение с хроматографските методи, показват значителни предимства по отношение на чувствителност, граница на откриване, техническо оборудване и изискване за време.(Време: 45 минути)

  1. 2.Принцип на теста

Този комплект ELISA е предназначен за откриване на AOZ въз основа на принципа на индиректно-конкурентен ензимен имуноанализ.Микротитърните ямки са покрити с улавящ BSA-свързан антиген.AOZ в пробата се конкурира с антигена, покрит върху микротитърната плака за добавеното антитяло.След добавянето на ензимен конюгат се използва хромогенен субстрат и сигналът се измерва със спектрофотометър.Абсорбцията е обратно пропорционална на концентрацията на AOZ в пробата.

  1. 3.Приложения

Този комплект може да се използва при количествен и качествен анализ на остатък от AOZ вживотински тъкани(мускул, черен дроб и др.), мед.

  1. 4.Кръстосани реакции

Фуразолидон метаболит (AOZ)……………………..100%

Фуралтадон метаболит (AMOZ)……………………<0,1%

Нитрофурантоинов метаболит (AHD)……………………<0,1%

Нитрофуразонов метаболит (SEM)…………………...<0,1%

Фуразолидон……………………………………….…..…16,3%

Фуралтадон…………………………………………….…<1%

Нитрофурантоин……………………………………….…….…<1%

Нитрофуразон……………………………………………..…<1%

  1. 5.Необходими материали

5.1Оборудване

----Спектрофотометър за микротитърна плака (450nm/630nm)

---- Ротационен изпарител или инструменти за сушене на азот

----Хомогенизатор /стомашник

----Шейкър

----Вортекс миксер

---- Центрофуга

---- Аналитична везна (индуктивност: 0,01g)

----Градуирана пипета: 10 ml

----Гумена груша за пипета

----Меромерна колба: 100 ml

----Стъклена колба: 10 мл

----Епруветка за центрофуга от полистирол: 2ml, 50ml

----Микропипети: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250 ul-мултипипета

5.2Реактиви

---- Етил ацетат (AR)

----n-хексан (или n-хептан) (AR)

---- Дикалиев хидроген фосфат трихидрат

(K2HPO4.3H2O) (AR)

----Концентрирана солна киселина (HCl, AR)

-----Метанол

----Натриев хидроксид (NaOH, AR)

----Дейонизирана вода

  1. 6.Компоненти на комплекта

l Микротитърна плака, покрита с антиген, 96 ямки

l Стандартни разтвори (6 бутилки, 1 ml/бутилка)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Стандартна контрола за добавка: (1 ml/бутилка).......100ppb

l Концентриран ензимен конюгат 1 ml.......червена капачка

l Ензимни конюгатни разредители 10 ml………..зелена капачка

l Субстрат A 7ml………............................…....…..…..бяла капачка

l Субстрат B 7ml………………………….…..червена капачка

l Стоп разтвор 7ml……………………………жълта капачка

l 20 × концентриран разтвор за измиване 40 ml

…………………………………….……прозрачна капачка

l 2 × концентриран разтвор за екстракция 60 ml….синя капачка

l 2-нитробензалдехид 15,1 mg………………бяла капачка

  1. 7.Приготвяне на реагенти

Решение 1: производен реагент:

Добавете 10 ml метанол към бутилката с 2-нитробензалдехид и разтворете.(при концентрация 10mM).

Решение 2: 0.1MK2HPO4решение:

Тегло 22,8g K2HPO4.3H2O до 1 L дейонизирана вода за разтваряне.

Решение 3: 1M разтвор на HCl

Разтворете 8,3 ml концентрирана солна киселина с дейонизирана вода до 100 мл.

Решение 4:1М разтвор на NaOH

Разтворете 4 g NaOH със 100 ml дейонизирана вода.

Решение 5: екстракционен разтвор:

Разредете 2 × концентриран екстракционен разтвор с дейонизирана вода в обемно съотношение 1:1.Този разтвор може да се съхранява за 1 месец при 4 ℃, който ще се използва за екстрахирани проби.

Решение 6: разтвор за измиване:

Разредете 20 × концентрирания промивен разтвор с дейонизирана вода в обемно съотношение 1:19, който ще се използва за измиване на плаките.Този разреден разтвор може да се съхранява 1 месец при 4 ℃.

  1. 8.Приготвяне на проби

8.1Забележка и предпазни мерки преди работа:

а) Моля, използвайте еднократни накрайници в експеримента и сменете накрайниците, когато абсорбирате различен реагент.

b) Уверете се, че всички експериментални инструменти са чисти.

в) производният реагент може да се съхранява при 2-8 ℃ в продължение на три месеца;

d) Разтворът на HCl може да се съхранява при стайна температура в продължение на 3 месеца;

д) Разтворът на NaOH може да се съхранява в продължение на 3 месеца при стайна температура;

f) Съхранявайте необработените проби в замръзване (-20 ℃);

ж) Обработените проби могат да се съхраняват за 24 часа при 2-8 ℃ на тъмно.

8.2 Проби от животинска тъкан и черен дроб:

----Хомогенизирайте пробите с хомогенизатор;

---- Претеглете 1,0±0,05 g от хомогенизираната тъканна проба в 50 ml полистиролова центрофужна епруветка.Добавете 4 ml дейонизирана вода, 0,5 ml 1M разтвор на HCl и 100 ul производен реагент (вижте разтвор 1).Разклатете го за 2 минути.

---- Инкубирайте при 37 ℃ за една нощ (около 16 часа);

---- Добавете 5 ml 0,1 MK2HPO4 (решение2), 0,4 ml 1M NaOH (решение4) и 5 ​​ml етилацетат.Разклатете яростно за 30s;

---- Центрофугирайте при стайна температура (20-25 ℃) за 10 минути, най-малко 3000 g;

---- Вземете 2,5 ml от супернатантната органична фаза в 10 ml чиста стъклена епруветка, изсушете с 50-60 ℃ азотен газ или ротационен изпарител;

---- Разтворете сухия остатък с 1 ml n-хексан (или n-хептан), разбъркайте на вортекс за 30 s, добавете 1 ml разтвор за екстракция (решение5), вортексирайте 1 минута, разбъркайте напълно.

---- Центрофугирайте при стайна температура (20-25oВ) за 5 минути, поне 3000 g;

---- Отстранете супернатантната органична фаза;вземете 50 μl от водната фаза на субстрата за анализ.

 

8.4 Мед

----претеглят се 1,0±0,05 g от хомогенизираната медена проба в 50 ml полистиролова центрофужна епруветка;

----Добавете 4 ml дейонизирана вода, 0,5 ml 1M HCl (решение3) и 100 μl производен реагент (решение1);разклатете напълно за 2 минути;

----Инкубирайте при 37 ℃ за една нощ (около 16 часа);

----Добавете 5ml 0.1MK2HPO4 (решение2), 0,4 ml 1M NaOH (решение4) и 5 ​​ml етил ацетат, разклатете яростно в продължение на 30 s;

---- Центрофугирайте при стайна температура (20-25 ℃) за 10 минути, най-малко 3000 g;

---- Вземете 2,5 ml от супернатантната органична фаза в 10 ml чиста стъклена епруветка, изсушете с 50-60 ℃ азотен газ или ротационен изпарител;

----Разтворете сухия остатък с 1 ml n-хексан (или n-хептан), разбъркайте на вортекс за 30 s, добавете 1 ml разтвор за екстракция (решение5), вортексирайте 1 минута, разбъркайте напълно.

---- Центрофугирайте при стайна температура (20-25oВ) за 10 минути, поне 3000 g;

----Отстранете супернатантната органична фаза;вземете 50 μl от водната фаза на субстрата за анализ.

  1. 9.Процес на анализ

9.1Забележка преди анализ

9.1.1 Уверете се, че всички реагенти и микроямки са на стайна температура (20-25 ℃).

9.1.2 Върнете всички останали реагенти до 2-8 ℃ веднага след употреба.

9.1.3 Правилното измиване на микроямките е важна стъпка в процеса на анализ;това е жизненоважен фактор за възпроизводимостта на ELISA анализа.

9.1.4 Избягвайте светлината и покривайте микроямките по време на инкубацията.

9.2 Стъпки на анализа

9.2.1 Извадете всички реагенти на стайна температура (20-25 ℃) за повече от 30 минути, хомогенизирайте преди употреба.

9.2.2 Извадете необходимите микроямки и незабавно върнете останалите в торбичката с цип при 2-8 ℃.

9.2.3 Концентрираният разтвор за промиване и концентрираният разтвор за екстракция трябва да се затоплят отново до стайна температура преди употреба.

9.2.4Номер:Номерираните позиции на всяка микроямка и всички стандарти и проби трябва да бъдат пуснати в два екземпляра.Запишете позициите на стандартите и пробите.

9.2.5Разреждане на концентриран разтвор на антитяло: разредете концентрирания ензимен разтвор с разредители на ензимен конюгат в обемно съотношение 1:10 (1 пъти концентриран ензимен разтвор: 10 пъти разредители на ензимен конюгат).

9.2.6Добавете стандартен разтвор/проба и разтвор на ензимен конюгат: добавете 50 µl стандартен разтвор или приготвена проба към съответните ямки, добавете 50 µl разтвор на ензимен конюгат.Разбъркайте внимателно чрез разклащане на плаката ръчно и инкубирайте за 30 минути при 25 ℃ с капак.

9.2.7Мия: Внимателно отстранете капака и излейте течността от ямките и изплакнете микроямките с 250 µl разреден промивен разтвор (решение6) на интервал от 10s за 4-5 пъти.Попийте остатъчната вода с абсорбираща хартия (останалото въздушно мехурче може да се отстрани с неизползван накрайник).

9.2.8Оцветяване: Добавете 50 µl субстратен разтвор A и 50 ul субстратен разтвор B към всяка ямка.Разбъркайте внимателно, като разклатите плаката ръчно и инкубирайте за 15 минути при 25 ℃ с капак (вижте 12.8).

9.2.11Измерете: Добавете 50µl стоп разтвор към всяка ямка.Разбъркайте внимателно, като разклатите плаката ръчно и измерете абсорбцията при 450 nm (Предлага се измерване с двойна дължина на вълната от 450/630 nm. Прочетете резултата в рамките на 5 минути след добавяне на стоп разтвора. )

10 Резултати

10.1Процентна абсорбция

Средните стойности на стойностите на абсорбцията, получени за стандартите и пробите, се разделят на стойността на абсорбция на първия стандарт (нулев стандарт) и се умножават по 100%.По този начин нулевият стандарт се прави равен на 100% и стойностите на абсорбция се цитират в проценти.

=

B ——стандарт за абсорбция (или проба)

B0 ——стандарт за нулева абсорбция

10.2Стандартна крива

----За да начертаете стандартна крива: Вземете стойността на абсорбцията на стандартите като y-ос, полулогаритмична на концентрацията на стандартния разтвор на AOZ (ppb) като х-ос.

----Концентрацията на AOZ на всяка проба (ppb), която може да бъде разчетена от кривата на калибриране, се умножава по съответния фактор на разреждане на всяка следвана проба и се получава действителната концентрация на пробата.

Моля отбележете:

За всички редукции на данни е разработен специален софтуер, който може да бъде предоставен при поискване.

Фактор на разреждане………………………………………..……2

10.Чувствителност, точност и прецизност

Чувствителност: 0,025ppb

Граница на откриване:

Тъкан (мускул, черен дроб)…………………………0,1ppb

Пчелен мед------------------------------------------------- -0,1ppb

Точност:

Животинска тъкан (мускулна и черен дроб)…………………100±20%

Мед…………………………………..………….... 100±20%

Точност:CV на комплекта ELISA е по-малко от 10%.

11.Забележете

12.1 Средните стойности на стойностите на абсорбцията, получени за стандартите и пробите, ще бъдат намалени, ако реагентите и пробите не са регулирани до стайна температура (20-25 ℃).

12.2 Не позволявайте микроямките да изсъхнат между стъпките, за да избегнете неуспешна възпроизводимост, и започнете следващата стъпка веднага след като докоснете държача на микроямките.

12.3 Разклатете внимателно всеки реагент преди употреба.

12.4 Пазете кожата си от стоп разтвора, тъй като той е 0,5MH2SO4решение.

12.5 Не използвайте остарелите комплекти.Не разменяйте реагентите от различни партиди, в противен случай това ще намали чувствителността.

12.6 Условия на съхранение: Съхранявайте комплектите ELISA при 2-8 ℃, не замразявайте.Запечатайте микроямковите плаки, избягвайте пряка слънчева светлина по време на всички инкубации.Препоръчва се покриване на микротитърните плаки.

12.7 Субстратният разтвор трябва да се изостави, ако оцвети.Реагентите може да се влошат, ако стойността на абсорбцията (450/630nm) на нулевия стандарт е по-малка от 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Реакцията на оцветяване се нуждае от 15 минути след добавянето на субстратния разтвор;Можете да удължите времето за инкубация до 20 минути или повече, ако цветът е твърде светъл, за да бъде определен. Никога не превишавайте 25 минути. Напротив, съкратете времето за инкубация правилно.

12.9 Оптималната реакционна температура е 25 ℃.По-висока или по-ниска температура ще доведе до промени в стойностите на чувствителността и абсорбцията.

12.Условия на съхранение и срок на съхранение

Условия на съхранение: 2-8 ℃.

Срок на съхранение: 12 месеца.

 

 


  • Предишен:
  • Следващия:

  • Напишете вашето съобщение тук и ни го изпратете

    Свързани продукти