proizvod

1. 1.Pozadina

Nitrofurani su sintetički antibiotici širokog spektra, koji se često koriste u životinjskoj proizvodnji zbog svojih odličnih antibakterijskih i farmakokinetičkih svojstava.Također su korišteni kao promotori rasta u proizvodnji svinja, peradi i vode.Dugotrajne studije na laboratorijskim životinjama pokazale su da su izvorni lijekovi i njihovi metaboliti pokazali kancerogena i mutagena svojstva.To je dovelo do zabrane nitrofurana za liječenje životinja koje se koriste za proizvodnju hrane.Nitrofuranski lijekovi furaltadon, nitrofurantoin i nitrofurazon zabranjeni su za upotrebu u proizvodnji hrane za životinje u EU 1993. godine, a upotreba furazolidona je zabranjena 1995. godine.

Analiza ostataka nitrofuranskih lijekova treba se zasnivati ​​na detekciji metabolita matičnih lijekova nitrofurana vezanih za tkivo.Budući da se osnovni lijekovi vrlo brzo metaboliziraju, a metaboliti nitrofurana vezani za tkivo će se zadržati dugo vremena, ovi metaboliti se koriste kao meta u otkrivanju zloupotrebe nitrofurana, što uključuje metabolit furazolidona (AOZ), metabolit furaltadona (AMOZ). ), metabolit nitrofurantoina (AHD) i metabolit nitrofurantoina (SEM).

AOZ-ostaci se najčešće određuju pomoću LC-MS ili LC-MS/MS.Enzimski imunotestovi, u poređenju sa hromatografskim metodama, pokazuju značajne prednosti u pogledu osetljivosti, granice detekcije, tehničke opreme i vremenskog zahteva.(Vremenski trošak: 45 min)

1. 2.Princip testa

Ovaj ELISA komplet je dizajniran za otkrivanje AOZ na osnovu principa indirektno-kompetitivnog enzimskog imunoeseja.Jažice za mikrotitar su obložene antigenom vezanim za hvatanje BSA.AOZ u uzorku se takmiči sa antigenom obloženim na mikrotitarskoj ploči za dodano antitelo.Nakon dodavanja enzimskog konjugata, koristi se hromogeni supstrat i signal se meri spektrofotometrom.Apsorpcija je obrnuto proporcionalna koncentraciji AOZ u uzorku.

1. 3.Prijave

Ovaj komplet se može koristiti u kvantitativnoj i kvalitativnoj analizi ostatka AOZ uanima tkiva(mišići, jetra itd.), med.

1. 4.Unakrsne reakcije

Metabolit furazolidona (AOZ)……………………..100%

Metabolit furaltadona (AMOZ)……………………<0,1%

Metabolit nitrofurantoina (AHD)……………………<0,1%

Metabolit nitrofurazona (SEM)………………………<0,1%

Furazolidon…………………………………………………..…16,3%

Furaltadon…………………………………………………………<1%

Nitrofurantoin……………………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon……………………………………………………..…<1%

1. 5.Potrebni materijali

5.1Oprema

---- Spektrofotometar mikrotitarske ploče (450nm/630nm)

----Rotacijski isparivač ili instrumenti za sušenje dušika

----Homogenizator / stomacher

----Shaker

----Vortex mikser

----Centrifuga

----Analitička vaga (induktivnost: 0,01g)

----Gradirana pipeta: 10ml

----Gumena sijalica za pipetu

----Vulumetrijska boca: 100 ml

----Staklena boca: 10 ml

----Cijev za centrifugiranje od polistirena: 2ml, 50ml

----Mikropipete: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multippeta

5.2Reagensi

----Etil acetat (AR)

----n-heksan (ili n-heptan) (AR)

----Dikalijum hidrogenfosfat trihidrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Koncentrirana hlorovodonična kiselina (HCl, AR)

-----Metanol

----Natrijum hidroksid (NaOH, AR)

----Dejonizovana voda

1. 6.Kit Components

l Mikrotitarska ploča obložena antigenom, 96 jažica

l Standardni rastvori (6 boca, 1ml/boca)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Standardna kontrola sipanja: (1ml/boca)........100ppb

l Koncentrovani enzimski konjugat 1ml.......crveni poklopac

l Enzimski konjugati razblaživači 10ml………..zeleni poklopac

l Supstrat A 7ml………..............…..…..…..bijeli poklopac

l Supstrat B 7ml…………..…........….…..crveni poklopac

l Stop rastvor 7ml……………………………žuti poklopac

l 20×koncentrovani rastvor za pranje 40ml

……………………………………………………….……prozirna kapa

l 2×koncentrovani rastvor za ekstrakciju 60ml….plavi poklopac

l 2-nitrobenzaldehid 15,1mg………………bijeli poklopac

1. 7.Priprema reagensa

Rješenje 1: derivatni reagens:

Dodajte 10 ml metanola u bocu sa 2-nitrobenzaldehidom i rastvorite.(u koncentraciji od 10 mM).

Rješenje 2: 0.1MK₂HPO₄rješenje:

Težina 22,8 g K₂HPO₄.3H₂O na 1 l dejonizirane vode da se otopi.

Rješenje 3: 1M rastvor HCl

Otopiti 8,3 ml koncentrovane hlorovodonične kiseline dejonizovanom vodom do 100ml.

Rješenje 4:1M rastvor NaOH

Rastvorite 4 g NaOH sa 100 ml dejonizovane vode.

Rješenje 5: rješenje za ekstrakciju:

Razrijediti 2×koncentrovani rastvor za ekstrakciju dejonizovanom vodom u volumnom odnosu 1:1.Ovaj rastvor se može čuvati 1 mesec na 4℃, koji će se koristiti za ekstrahovanje uzoraka.

Rješenje 6: otopina za pranje:

Razblažite 20×koncentrovani rastvor za ispiranje dejonizovanom vodom u volumnom omjeru 1:19, koja će se koristiti za pranje ploča.Ovaj razrijeđeni rastvor može se čuvati 1 mjesec na 4℃.

1. 8.Pripreme uzoraka

8.1Napomena i mjere opreza prije operacije:

a) Koristite jednokratne vrhove u eksperimentu i promijenite vrhove kada apsorbirate drugačiji reagens.

b) Uvjerite se da su svi eksperimentalni instrumenti čisti.

c) derivatni reagens može se čuvati na 2-8℃ tri mjeseca;

d) rastvor HCl se može čuvati na sobnoj temperaturi 3 meseca;

e) Rastvor NaOH može se čuvati 3 mjeseca na sobnoj temperaturi;

f) Netretirane uzorke držati u zamrzavanju (-20℃);

g) Tretirani uzorci se mogu čuvati 24h na 2-8℃ u mraku.

8.2 Uzorci životinjskog tkiva i jetre:

----Homogenizirati uzorke homogenizatorom;

----Ubacite 1,0±0,05 g homogenizovanog uzorka tkiva u epruvetu za centrifugiranje od polistirena od 50 ml.Dodajte 4 ml dejonizovane vode, 0,5 ml 1M rastvora HCl i 100 ul derivata reagensa (vidi rastvor 1).Protresite 2 min.

---- Inkubirati na 37℃ preko noći (oko 16h);

---- Dodati 5ml 0,1MK₂HPO₄ (rješenje2), 0,4 ml 1M NaOH (rješenje4) i 5 ml etil acetata.Snažno tresite 30s;

---- Centrifugirati na sobnoj temperaturi (20-25℃) 10 min, najmanje 3000 g;

---- Uzmite 2,5 ml organske faze supernatanta u čistu staklenu epruvetu od 10 ml, osušite sa dušikom od 50-60℃ ili rotacionim isparivačem;

---- Otopite suhi ostatak sa 1ml n-heksana (ili n-heptana), mešajte 30s, dodajte 1ml rastvora za ekstrakciju (rješenje5), vrtite 1 min, potpuno promiješajte.

---- Centrifugirajte na sobnoj temperaturi (20-25^oC) 5 min, najmanje 3000 g;

---- Ukloniti supernatant organske faze;uzmite 50 μl vodene faze supstrata za analizu.

8.4 Med

----izmeriti 1,0±0,05 g homogenizovanog uzorka meda u epruvetu za centrifugu od polistirena od 50 ml;

----Dodajte 4ml dejonizovane vode, 0,5ml 1M HCl (rješenje3) i 100 μl derivatnog reagensa (rješenje1);potpuno protresti 2 min;

----Inkubirajte na 37℃ preko noći (oko 16h);

----Dodajte 5ml 0,1MK₂HPO₄ (rješenje2), 0,4 ml 1M NaOH (rješenje4) i 5ml etil acetata, žestoko mućkati 30s;

----Centrifugirajte na sobnoj temperaturi (20-25℃) 10 min, najmanje 3000g;

----Uzmite 2,5ml organske faze supernatanta u čistu staklenu epruvetu od 10ml, osušite gasom azota na 50-60℃ ili rotacionim isparivačem;

----Otopiti suhi ostatak sa 1ml n-heksana (ili n-heptana), mućkati 30s, dodati 1ml rastvora za ekstrakciju (rješenje5), vrtite 1 min, potpuno promiješajte.

----Centrifugirajte na sobnoj temperaturi (20-25^oC) 10 min, najmanje 3000g;

----Ukloniti supernatant organske faze;uzmite 50 μl vodene faze supstrata za analizu.

1. 9.Proces analize

9.1Napomena prije analize

9.1.1 Uverite se da su svi reagensi i mikrojažice na sobnoj temperaturi (20-25℃).

9.1.2 Vratite sve ostale reagense na 2-8℃ odmah nakon upotrebe.

9.1.3 Pravilno pranje mikro-jažica je važan korak u procesu analize;to je vitalni faktor za ponovljivost ELISA analize.

9.1.4 Izbjegavajte svjetlost i pokrijte mikrojažice tokom inkubacije.

9.2 Koraci analize

9.2.1 Izvadite sve reagense na sobnoj temperaturi (20-25℃) duže od 30 minuta, homogenizirajte prije upotrebe.

9.2.2 Izvadite potrebne mikro jažice, a ostatak odmah vratite u vrećicu sa zatvaračem na 2-8 ℃.

9.2.3 Koncentrovani rastvor za pranje i koncentrovani rastvor za ekstrakciju treba ponovo da se zagreju da budu na sobnoj temperaturi pre upotrebe.

9.2.4Broj:Numerisana svaka pozicija mikrojažica i svi standardi i uzorci treba da se rade u duplikatu.Zabilježite standarde i položaje uzoraka.

9.2.5Razblaživanje koncentrovanog rastvora antitela: razblažite koncentrovani rastvor enzima sa razblaživačima konjugata enzima u volumnom odnosu 1:10 (1 puta koncentrirani rastvor enzima: 10 puta razblaživači konjugata enzima).

9.2.6Dodati standardni rastvor/uzorak i rastvor konjugata enzima: dodati 50 µl standardnog rastvora ili pripremljenog uzorka u odgovarajuće jažice, dodati 50 µl rastvora konjugata enzima.Lagano promiješajte ručnim protresanjem ploče i inkubirajte 30 minuta na 25 ℃ sa poklopcem.

9.2.7Oprati: Lagano uklonite poklopac i izlijte tečnost iz jažica i isperite mikrojažice sa 250 µl razblaženog rastvora za pranje (rješenje6) u intervalu od 10s 4-5 puta.Apsorbirajte preostalu vodu upijajućim papirom (ostatak mjehurića zraka se može eliminirati neiskorištenim vrhom).

9.2.8Coloration: Dodajte 50 µl rastvora supstrata A i 50 µl rastvora supstrata B u svaku jažicu.Lagano promiješajte ljuljajući ploču ručno i inkubirajte 15 minuta na 25 ℃ sa poklopcem (pogledajte 12.8).

9.2.11Mjera: Dodajte 50 µl otopine za zaustavljanje u svaku jažicu.Lagano promiješajte ručno ljuljajući ploču i izmjerite apsorbanciju na 450 nm (Preporučeno je mjerenje s dvostrukom talasnom dužinom od 450/630 nm. Očitajte rezultat u roku od 5 minuta nakon dodavanja stop rastvora.)

10 Rezultati

10.1Procenat apsorpcije

Srednje vrijednosti vrijednosti apsorpcije dobijene za standarde i uzorke podijeljene su vrijednošću apsorpcije prvog standarda (nulti standard) i pomnožene sa 100%.Nulti standard je stoga jednak 100%, a vrijednosti apsorpcije su navedene u procentima.

=

B ——standard apsorpcije (ili uzorak)

B0 ——standard nulte apsorpcije

10.2Standard Curve

----Da biste nacrtali standardnu ​​krivu: Uzmite vrijednost apsorbancije standarda kao y-osu, polulogaritamsku koncentraciju standardne otopine AOZ (ppb) kao x-os.

----Koncentracija AOZ svakog uzorka (ppb), koja se može očitati iz kalibracijske krivulje, množi se odgovarajućim faktorom razrjeđenja svakog uzorka koji se prati, i dobija se stvarna koncentracija uzorka.

Molimo primijetite:

Za sve redukcije podataka razvijen je poseban softver koji se može dobiti na zahtjev.

Faktor razblaženja…………………………………………..……2

10.Osetljivost, tačnost i preciznost

Osjetljivost: 0,025ppb

Granica detekcije:

Tkivo (mišić, jetra)…………………………0,1ppb

med------------------------------------------------- -0.1ppb

tačnost:

Životinjsko tkivo (mišići i jetra)…………………100±20%

Med…………………………………………………….. 100±20%

Preciznost:CV ELISA kompleta je manji od 10%.

11.Biljeska

12.1 Srednje vrijednosti vrijednosti apsorbancije dobivene za standarde i uzorke će biti smanjene ako reagensi i uzorci nisu regulirani na sobnu temperaturu (20-25℃).

12.2 Ne dozvolite da se mikrojažice osuše između koraka kako biste izbjegli neuspješnu ponovljivost i pokrenite sljedeći korak odmah nakon dodirivanja držača mikrojažica.

12.3 Prije upotrebe lagano protresti svaki reagens.

12.4 Držite kožu dalje od rješenja za zaustavljanje jer je to 0,5MH₂SO₄rješenje.

12.5 Ne koristite komplete zastarjele.Nemojte mijenjati reagense različitih serija, inače će pasti osjetljivost.

12.6 Uvjeti skladištenja: ELISA komplete čuvajte na 2-8℃, nemojte zamrzavati.Zapečatite mikro jažice za odmor, izbegavajte direktnu sunčevu svetlost tokom svih inkubacija.Preporučuje se pokrivanje mikrotitarskih ploča.

12.7 Rastvor supstrata treba napustiti ako poprimi boju.Reagensi se mogu pogoršati ako je vrijednost apsorbancije (450/630nm) nulte standarda manja od 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Za reakciju bojenja potrebno je 15 minuta nakon dodavanja rastvora supstrata;Možete produžiti vrijeme inkubacije na 20 min ili više ako je boja presvijetla da bi se odredila. Nikada ne prelazite 25 min. Naprotiv, skratite vrijeme inkubacije na odgovarajući način.

12.9 Optimalna temperatura reakcije je 25℃.Viša ili niža temperatura će dovesti do promjena vrijednosti osjetljivosti i apsorpcije.

12.Stanje skladištenja i rok skladištenja

Uvjeti skladištenja: 2-8℃.

Rok skladištenja: 12 meseci.