produkto

1. 1.Background

Ang Nitrofurans kay sintetikong lapad nga spectrum nga antibiotics, nga sagad gigamit sa paggama sa mananap tungod sa maayo kaayong antibacterial ug pharmacokinetic nga mga kabtangan niini.Gigamit usab kini isip mga tigpasiugda sa pagtubo sa produksyon sa baboy, manok ug tubig.Sa taas nga termino nga mga pagtuon sa mga hayop sa lab nagpakita nga ang mga ginikanan nga tambal ug ang ilang mga metabolite nagpakita sa carcinogenic ug mutagenic nga mga kinaiya.Kini misangpot sa usa ka pagdili sa nitrofurans alang sa pagtambal sa mga mananap nga gigamit alang sa produksyon sa pagkaon.Ang nitrofuran nga mga tambal nga furaltadone, nitrofurantoin ug nitrofurazone gidid-an sa paggamit sa paggama sa mga hayop sa pagkaon sa EU kaniadtong 1993, ug ang paggamit sa furazolidone gidili kaniadtong 1995.

Ang pag-analisa sa nahabilin nga mga tambal nga nitrofuran kinahanglan nga ibase sa pagkakita sa mga metabolite nga gigapos sa tisyu sa mga tambal nga ginikanan nga nitrofuran.Tungod kay ang mga tambal sa ginikanan paspas kaayo nga na-metabolize, ug ang mga tisyu nga gigapos sa nitrofuran metabolites magpabilin sa dugay nga panahon, kini nga mga metabolite gigamit ingon nga target sa pag-ila sa pag-abuso sa mga nitrofurans, nga naglakip sa Furazolidone metabolite (AOZ), Furaltadone metabolite (AMOZ). ), Nitrofurantoin metabolite (AHD) ug Nitrofurazone metabolite (SEM).

Ang AOZ-residues kasagarang gitino sa LC-MS o LC-MS/MS.Enzyme immunoassays, kon itandi sa chromatographic nga mga pamaagi, nagpakita sa igo nga mga bentaha mahitungod sa pagkasensitibo, detection limit, teknikal nga ekipo ug gikinahanglan sa panahon.(Gastos sa oras: 45min)

1. 2.Prinsipyo sa Pagsulay

Kini nga ELISA kit gidesinyo aron mahibal-an ang AOZ base sa prinsipyo sa dili direkta nga kompetisyon nga enzyme immunoassay.Ang mga atabay sa microtiter gitabonan sa pagkuha sa antigen nga nalambigit sa BSA.Ang AOZ sa sample nakigkompetensya sa antigen nga adunay sapaw sa microtiter plate alang sa gidugang nga antibody.Human sa pagdugang sa enzyme conjugate, chromogenic substrate gigamit ug ang signal gisukod sa usa ka spectrophotometer.Ang pagsuyup inversely proporsyonal sa konsentrasyon sa AOZ sa sample.

1. 3.Mga aplikasyon

Kini nga kit mahimong gamiton sa quantitative ug qualitative analysis sa AOZ residue samga tisyu sa anima(kaunuran, atay etc), dugos.

1. 4.Mga cross-reaksyon

Furazolidone metabolite (AOZ) ………………………..100%

Furaltadone metabolite (AMOZ)……………………<0.1%

Nitrofurantoin metabolite (AHD)……………………<0.1%

Nitrofurazone metabolite (SEM)…………………………...<0.1%

Furazolidone…………………………………………………16.3%

Furaltadone……………………………………………………<1%

Nitrofurantoin……………………………………………….…<1%

Nitrofurazone……………………………………………………<1%

1. 5.Mga Materyal nga Gikinahanglan

5.1Mga kahimanan

----Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)

---- Rotary evaporator o nitrogen drying instruments

---- Homogenizer / tiyan

----Tagalog

----Vortex mixer

----Centrifuge

---- Analytical balanse (inductance: 0.01g)

----Migraduwar nga pipette: 10ml

----Goma nga pipette nga bombilya

----Volumetric flask: 100ml

----Glass nga baso: 10ml

----Polystyrene centrifuge tube: 2ml, 50ml

----Micropipettes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Mga reagents

----Ethyl acetate (AR)

----n-hexane (o n-heptane) (AR)

---- Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Concentrated nga hydrochloric acid (HCl, AR)

-----Methanol

----Sodium hydroxide (NaOH, AR)

----Deionized nga tubig

1. 6.Mga sangkap sa Kit

l Microtiter plate nga adunay sapaw sa antigen, 96 ka atabay

l Mga standard nga solusyon (6 ka botelya, 1ml/botelya)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Spiking standard control: (1ml/botelya)........100ppb

l Concentrated enzyme conjugate 1ml........pula nga takup

l Enzyme conjugate diluents 10ml………..berde nga takup

l Substrate A 7ml………………………………………………..puti nga takup

l Substrate B 7ml………………………………………………..pula nga takup

l Ihunong ang solusyon 7ml…………………………………………...yellow cap

l 20×concentrated wash solution 40ml

………………………………….……transparent nga takup

l 2×concentrated extraction solution 60ml….asul nga takup

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………puti nga takup

1. 7.Pag-andam sa mga Reagents

Solusyon 1: derivative nga reagent:

Idugang ang 10ml nga methanol sa botelya nga adunay 2-Nitrobenzaldehyde ug matunaw.(sa konsentrasyon sa 10mM).

Solusyon 2: 0.1MK₂HPO₄solusyon:

Timbang 22.8g K₂HPO₄.3H₂O ngadto sa 1L nga deionized nga tubig aron matunaw.

Solusyon 3: 1M HCl nga solusyon

Dissolve 8.3ml Concentrated hydrochloric acid uban sa deionized nga tubig ngadto sa 100ml.

Solusyon 4:1M NaOH nga solusyon

Dissolve 4g NaOH sa 100ml deionized nga tubig.

Solusyon 5: solusyon sa pagkuha:

Dilute ang 2×concentrated extraction solution sa deionized nga tubig sa volume ratio nga 1:1.Kini nga solusyon mahimong tipigan sulod sa 1 ka bulan sa 4 ℃, nga gamiton sa pagkuha sa mga sample.

Solusyon 6: solusyon sa paghugas:

Dilute ang 20×concentrated wash solution sa deionized nga tubig sa volume nga rasyon nga 1:19, nga gamiton sa paghugas sa mga plato.Kini nga lasaw nga solusyon mahimong tipigan sulod sa 1 ka bulan sa 4 ℃.

1. 8.Sampol nga Pagpangandam

8.1Pahibalo ug pag-amping sa wala pa ang operasyon:

a) Palihug gamita ang usa ka tip sa eksperimento, ug usba ang mga tip kung mosuhop sa lainlaing reagent.

b) Siguruha nga ang tanan nga mga instrumento sa eksperimento limpyo.

c) ang derivative reagent mahimong matipigan sa 2-8 ℃ sulod sa tulo ka bulan;

d) Ang solusyon sa HCl mahimong tipigan sa temperatura sa lawak sulod sa 3 ka bulan;

e) Ang NaOH nga solusyon mahimong matipigan sulod sa 3 ka bulan sa temperatura sa lawak;

f) Itago ang wala matambalan nga mga sample sa freeze (-20 ℃);

g) Ang giatiman nga mga sampol mahimong tipigan sulod sa 24 ka oras sa 2-8 ℃ sa kangitngit.

8.2 Mga sample sa tissue ug atay sa hayop:

----I-homogenize ang mga sample gamit ang homogenizer;

---- Timbang 1.0±0.05g sa homogenized tissue sample ngadto sa 50ml polystyrene centrifuge tube.Idugang ang 4ml nga deionized nga tubig, 0.5ml 1M HCl solution ug 100ul derivative reagent (tan-awa ang solusyon 1).I-uyog kini sulod sa 2 min.

---- Paglumlum sa 37 ℃ tibuok gabii (mga 16h);

---- Idugang ang 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solusyon2), 0.4ml 1M NaOH (solusyon4) ug 5ml ethyl acetate.Pag-uyog pag-ayo sulod sa 30s;

---- Centrifuge sa temperatura sa lawak (20-25 ℃) sulod sa 10min, labing menos 3000g;

---- Dad-a ang 2.5ml sa supernatant organic phase ngadto sa 10ml nga limpyo nga glass tube, uga sa 50-60 ℃ nitrogen gas o rotary evaporator;

---- Dissolve ang uga nga nahabilin sa 1ml n-hexane (o n-heptane), vortex sa 30s, idugang ang 1ml nga solusyon sa pagkuha (solusyon5), vortex 1min, isagol sa hingpit.

---- Centrifuge sa temperatura sa lawak (20-25^oC) sulod sa 5min, labing menos 3000g;

---- Kuhaa ang supernatant organic phase;pagkuha sa 50μl sa substrate nga bahin sa tubig alang sa pagsulay.

8.4 Dugos

---- motimbang og 1.0±0.05g sa homogenized honey sample ngadto sa 50ml polystyrene centrifuge tube;

----Idugang ang 4ml deionized nga tubig, 0.5ml 1M HCl (solusyon3) ug 100μl derivative reagent (solusyon1);bug-os nga pag-uyog sa 2 min;

---- Incubate sa 37 ℃ tibuok gabii (mga 16h);

----Idugang ang 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solusyon2), 0.4ml 1M NaOH (solusyon4) ug 5ml ethyl acetate, pag-uyog pag-ayo sa 30s;

---- Centrifuge sa temperatura sa lawak (20-25 ℃) alang sa 10min, labing menos 3000g;

---- Dad-a ang 2.5ml sa supernatant organic phase ngadto sa 10ml nga limpyo nga bildo nga tubo, uga sa 50-60 ℃ nitrogen gas o rotary evaporator;

----Dissolve ang uga nga salin nga adunay 1ml n-hexane (o n-heptane), vortex sa 30s, idugang ang 1ml nga solusyon sa pagkuha (solusyon5), vortex 1min, isagol sa hingpit.

----Centrifuge sa temperatura sa lawak (20-25^oC) sulod sa 10min, labing menos 3000g;

----Kuhaa ang supernatant organic phase;pagkuha sa 50μl sa substrate nga bahin sa tubig alang sa pagsulay.

1. 9.Proseso sa pagsulay

9.1Matikdi sa dili pa ang assay

9.1.1 Siguruha nga ang tanan nga mga reagents ug microwell anaa sa temperatura sa kwarto (20-25 ℃).

9.1.2 Ibalik ang tanan nga nahabilin nga mga reagents sa 2-8 ℃ pagkahuman dayon gamiton.

9.1.3 Ang paghugas sa mga microwell sa husto usa ka importante nga lakang sa proseso sa pagsulay;kini mao ang importante nga butang sa reproducibility sa ELISA analysis.

9.1.4 Likayi ang kahayag ug tabuni ang mga microwell sa panahon sa paglumlum.

9.2 Mga Lakang sa Pagsusi

9.2.1 Kuhaa ang tanan nga mga reagents sa temperatura sa kwarto (20-25 ℃) sa sobra sa 30min, homogenize sa dili pa gamiton.

9.2.2 Kuhaa ang mga microwell nga gikinahanglan ug ibalik ang nahabilin sa zip-lock bag sa 2-8 ℃ dayon.

9.2.3 Ang concentrated wash solution ug concentrated extraction solution kinahanglang ipainit pag-usab nga anaa sa temperatura sa lawak sa dili pa gamiton.

9.2.4Numero:Ginumero ang matag posisyon sa microwell ug ang tanan nga mga sumbanan ug mga sample kinahanglan nga ipadagan sa doble.Irekord ang mga sumbanan ug mga sampol nga posisyon.

9.2.5Pagtunaw sa konsentrado nga solusyon sa antibody: dilute ang concentrated enzyme solution sa enzyme conjugate diluents sa volume ratio nga 1:10(1 fold concentrated enzyme solution: 10 folds enzyme conjugate diluents).

9.2.6Idugang ang standard nga solusyon / sample ug enzyme conjugate solution: idugang ang 50µl nga standard nga solusyon o giandam nga sample sa katugbang nga mga atabay, idugang ang 50µl enzyme conjugate solution.Hinay-hinay nga pag-mix pinaagi sa pag-uyog sa plato nga mano-mano ug paglumlom sa 30min sa 25 ℃ nga adunay tabon.

9.2.7Hugasan: Hinayhinay kuhaa ang tabon ug ibubo ang likido gikan sa mga atabay ug hugasan ang mga microwell gamit ang 250µl nga lasaw nga solusyon sa paghugas (solusyon6) sa agwat sa 10s alang sa 4-5 ka beses.Absorb ang nahabilin nga tubig gamit ang absorbent nga papel (ang nahabilin nga bula sa hangin mahimong mawagtang gamit ang wala magamit nga tip).

9.2.8Pagkolor: Idugang ang 50µl substrate solution A ug 50ul substrate solution B sa matag atabay.Hinay-hinay nga pag-mix pinaagi sa pag-uyog sa plato nga mano-mano ug paglumlom sa 15min sa 25 ℃ nga adunay taklob (tan-awa ang 12.8).

9.2.11Sukda: Idugang ang 50µl nga stop solution sa matag atabay.Hinay-hinay nga pag-mix pinaagi sa pag-uyog sa plato nga mano-mano ug sukda ang absorbance sa 450nm (Gisugyot niini ang pagsukod gamit ang dual-wavelength nga 450/630nm. Basaha ang resulta sulod sa 5min human sa pagdugang sa stop solution.)

10 Resulta

10.1Porsiyento nga pagsuyop

Ang kahulogan nga mga bili sa mga bili sa pagsuyop nga nakuha alang sa mga sumbanan ug sa mga sampol gibahin sa kantidad sa pagsuyop sa unang sumbanan (zero standard) ug gipadaghan sa 100%.Ang zero standard gihimo nga katumbas sa 100% ug ang absorbance values ​​gikutlo sa porsyento.

=

B ——standard sa pagsuyup (o sample)

B0 ——absorbance zero standard

10.2Standard Curve

----Aron magdrowing og standard curve: Kuhaa ang absorbance value sa mga standard isip y-axis, semi logarithmic sa konsentrasyon sa AOZ standard solution (ppb) isip x-axis.

----Ang AOZ nga konsentrasyon sa matag sample (ppb), nga mabasa gikan sa calibration curve, gipadaghan sa katugbang nga dilution factor sa matag sample nga gisundan, ug ang aktuwal nga konsentrasyon sa sample makuha.

Palihug timan-i:

Espesyal nga software ang naugmad alang sa tanang data reduction, nga mahimong ihatag sa hangyo.

Dilution nga hinungdan………………………………………………………2

10.Pagkasensitibo, katukma ug katukma

Pagkasensitibo: 0.025ppb

Limitado sa pagkakita:

Tisu (kaunuran, atay)………………………………0.1ppb

Dugos------------------------------------------------- -0.1ppb

Katukma:

Tisyu sa mananap (kaunuran ug atay)…………………………100±20%

Dugos…………………………………………………… 100±20%

Katukma:Ang CV sa ELISA kit dili mubu sa 10%.

11.Matikdi

12.1 Ang mean values ​​sa absorbance values ​​nga nakuha para sa standards ug samples mapakunhod kung ang mga reagents ug sample wala pa ma-regulate sa room temperature (20-25℃).

12.2 Ayaw tugoti ang microwell nga mamala sa taliwala sa mga lakang aron malikayan ang dili malampuson nga pag-reproducibility ug operate ang sunod nga lakang pagkahuman dayon sa pag-tap sa microwells holder.

12.3 Hinayhinay nga pag-uyog ang matag reagent sa dili pa gamiton.

12.4 Ipahilayo ang imong panit gikan sa stop solution kay kini ang 0.5MH₂SO₄solusyon.

12.5 Ayaw gamita ang mga kit nga wala na sa petsa.Ayaw ibaylo ang mga reagents sa lain-laing mga batch, o kung dili kini makahulog sa pagkasensitibo.

12.6 Kondisyon sa pagtipig: Hupti ang mga ELISA kit sa 2-8 ℃, ayaw pag-freeze.Seal rest microwell plates, Likayi ang tul-id nga kahayag sa adlaw sa tanang paglumlum.Girekomenda ang pagtabon sa mga plato sa microtiter.

12.7 Ang substrate nga solusyon kinahanglan nga biyaan kung kini mahimong kolor.Ang mga reagents mahimong madaot kung ang absorbance value (450/630nm) sa zero standard mas ubos kay sa 0.5 (A450nm<0.5).

12.8 Ang kolor nga reaksyon kinahanglan 15min human sa pagdugang sa substrate solusyon;Mahimo nimong lugwayan ang oras sa paglumlum ngadto sa 20min o labaw pa kung ang kolor hayag kaayo aron mahibal-an., Dili molapas sa 25min. Sa sukwahi, mub-an ang oras sa paglumlum sa husto.

12.9 Ang labing maayo nga temperatura sa reaksyon mao ang 25 ℃.Ang mas taas o mas ubos nga temperatura mosangpot sa mga kausaban sa pagkasensitibo ug pagsuyop nga mga bili.

12.Kondisyon sa pagtipig ug panahon sa pagtipig

Kahimtang sa pagtipig: 2-8 ℃.

Panahon sa pagtipig: 12 ka bulan.