Kit di immunoanalisi enzimatica cumpetitiva per l'analisi quantitativa di u metabolitu di Furazolidone (AOZ)
- 1.Sfondate
I nitrofurani sò antibiotici sintetici di spettru largu, chì sò spessu impiegati in a produzzione animale per e so eccellenti proprietà antibacteriale è farmacocinetiche.Eranu ancu stati utilizati cum'è promotori di crescita in a pruduzzioni di porchi, aviculture è acquatiche.In studii longu cù l'animali di labburatoriu indicatu chì e droghe parentali è i so metaboliti mostranu caratteristiche carcinogeniche è mutagene.Questu hà purtatu à una pruibizione di nitrofurani per u trattamentu di l'animali utilizati per a produzzione alimentaria.A droga nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin è nitrofurazone sò stati pruibiti di l'usu in a produzzione di animali alimentari in l'UE in u 1993, è l'usu di furazolidone hè statu pruibitu in u 1995.
L'analisi di i residui di droghe nitrofuran deve esse basatu nantu à a rilevazione di i metaboliti ligati à u tissutu di e droghe parentali nitrofuran.Siccomu i droghe parenti sò metabolizati assai rapidamente, è i metaboliti di nitrofuran ligati à u tissutu si mantenenu per un bellu pezzu, sti metaboliti sò usati cum'è u scopu in a deteczione di l'abusu di nitrofurani, chì includenu u metabolite Furazolidone (AOZ), u metabolite Furaltadone (AMOZ). ), Nitrofurantoin metabolite (AHD) è Nitrofurazone metabolite (SEM).
I residui AOZ sò determinati più comunmente da LC-MS o LC-MS / MS.I immunoassaggi enzimatici, paragunati à i metudi cromatografichi, mostranu vantaghji considerablei in quantu à a sensibilità, u limite di rilevazione, l'equipaggiu tecnicu è u requisitu di tempu.(Costa di tempu: 45 minuti)
- 2.Principiu di prova
Stu kit ELISA hè cuncepitu per detectà AOZ basatu annantu à u principiu di l'immunoassay enzimaticu indirettu cumpetitivu.I pozzi di microtitre sò rivestiti cù l'antigenu ligatu à BSA di cattura.AOZ in sample compite cù l'antigenu rivestitu nantu à u microtiter plate per l'anticorpu aghjuntu.Dopu l'aghjunzione di l'enzyme conjugate, u sustrato cromogenicu hè utilizatu è u signale hè misuratu da un spettrofotometru.L'assorbimentu hè inversamente proporzionale à a concentrazione di AOZ in a mostra.
- 3.Applicazioni
Stu kit pò esse usatu in l'analisi quantitativa è qualitativa di u residu AOZ intessuti anima(musculu, liver etc), meli.
- 4.Reazioni incruciate
Furazolidone metabolite (AOZ) …………..100%
Métabolite de la furaltadone (AMOZ)…………………………<0,1 %
Nitrofurantoin metabolite (AHD) …………………………<0.1%
Nitrofurazone metabolite (SEM) …………………………..<0.1%
Furazolidone…………………………………………….…..…16,3%
Furaltadone…………………………………………………….…<1%
Nitrofurantoina………………………………………….…….…<1%
Nitrofurazone……………………………………………………..…<1%
- 5.Materiali necessarii
5.1Attrezzature
---- Spettrofotometru di piastra di microtitru (450nm / 630nm)
----Evaporatore rotativu o strumenti d'asciugatura di nitrogenu
----Omogeneizzatore / stomacher
---- Shaker
---- Mixer Vortex
----Centrifuga
---- Bilanciu analiticu (induttanza: 0,01 g)
----Pipetta graduata: 10 ml
----Ampoule à pipette en gomma
----Fiaschetta volumetrica: 100 ml
----Fiacone di vetru: 10 ml
---- Tubu da centrifuga in polistirene: 2ml, 50ml
----Micropipette: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250ul-multipipette
5.2Reagenti
----Acetate d'etile (AR)
----n-esano (o n-eptano) (AR)
----Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate
(K2HPO4.3H2O) (AR)
----Acidu cloridicu cuncentratu (HCl, AR)
-----Metanol
----Idrossidu di sodiu (NaOH, AR)
---- Acqua deionizzata
- 6.Cumpunenti di u kit
l Piastra di Microtiter coated with antigen, 96 wells
l Soluzioni standard (6 buttigli, 1 ml / bottiglia)
0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb
l Spiking standard di cuntrollu: (1 ml / bottiglia) .....100 ppb
l Conjugate enzyme cuncintratu 1ml ....... cappucciu rossu
l Enzyme conjugate diluents 10ml………..cap verde
l Substratu A 7ml……….............…....…..…..capu biancu
l Substratu B 7ml………..............…........….…..tappo rossu
l Stop solution 7ml………………………… tappo giallu
l 20 × suluzione di lavà cuncentrata 40ml
……………………………………………….……capu trasparente
l 2×soluzione di estrazione cuncentrata 60ml….cap blu
l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………cap biancu
- 7.Preparazione di reagenti
Soluzione 1: reagent derivativu :
Aghjunghjite 10 ml di metanol à a buttiglia cù 2-Nitrobenzaldehyde è dissolve.(à a cuncentrazione di 10 mM).
Soluzione 2: 0,1 MK2HPO4suluzione:
Pesa 22,8 g K2HPO4.3H2O à 1L di acqua deionized per dissolve.
Soluzione 3: Soluzione 1 M di HCl
Dissolve 8,3 ml d'acidu cloridicu cuncentratu cù acqua deionized à 100 ml.
Soluzione 4:Soluzione 1M NaOH
Dissolve 4g NaOH cù 100 ml d'acqua deionizzata.
Soluzione 5: solution d'extraction :
Dilute 2 × suluzione d'estrazione cuncentrata cù l'acqua deionizzata in u rapportu voluminu di 1: 1.Sta suluzione pò esse cunservata per 1 mese à 4 ℃, chì serà utilizatu per estratti campioni.
Soluzione 6: suluzione di lavà :
Dilute a suluzione 20 × cuncentrata di lavà cù l'acqua deionizzata in a razione di u voluminu di 1:19, chì serà utilizatu per lavà i piatti.Questa suluzione diluita pò esse cunservata per 1 mese à 4 ℃.
- 8.Preparazioni di mostra
8.1Avvisu è precautions prima di l'operazione:
a) Per piacè aduprate punte una volta in l'esperimentu, è cambiate i cunsiglii quandu assorbe diversi reagenti.
b) Assicuratevi chì tutti i strumenti sperimentali sò puliti.
c) u reattivu derivativu pò esse cunservatu à 2-8 ℃ per trè mesi;
d) A suluzione HCl pò esse cunservata à a temperatura di l'ambienti per 3 mesi;
e) A suluzione NaOH pò esse cunservata per 3 mesi à a temperatura di l'ambienti;
f) Mantene i campioni micca trattati in freeze (-20 ℃);
g) I campioni trattati ponu esse cunservati per 24 ore à 2-8 ℃ in a bughjura.
8.2 Campioni di tissuti animali è fegati:
---- Homogenize i campioni cù homogenizer;
----Pesu 1,0 ± 0,05 g di u campione di tissutu omogeneizatu in un tubu di centrifuga di polistirene da 50 ml.Aghjunghjite 4 ml d'acqua deionizzata, 0,5 ml di suluzione 1M HCl è 100 ul di reattivu derivativu (vede a suluzione 1).Agite per 2 minuti.
---- Incubate à 37 ℃ durante a notte (circa 16 ore);
---- Aghjunghjite 5ml 0.1MK2HPO4 (suluzione2), 0,4 ml 1M NaOH (suluzione4) è 5 ml d'acetate di etile.Scuzzulate ferocemente per 30s;
---- Centrifuga à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃) per 10 min, almenu 3000g;
---- Pigliate 2,5 ml di a fase organica supernatante in un tubu di vetru pulitu da 10 ml, asciugate cù gas di nitrogenu 50-60 ℃ o evaporatore rotativu;
---- Scioglie u restu seccu cù 1 ml di n-hexane (o n-heptane), vortex per 30 s, aghjunghje 1 ml di suluzione d'estrazione (suluzione5), vortex 1min, mischjà cumplitamenti.
---- Centrifugare à a temperatura di l'ambienti (20-25oC) per 5 minuti, almenu 3000 g;
---- Eliminate a fase organica supernatante;piglià 50μl di a fase acqua di sustrato per l'analisi.
8.4 Meli
----pesà 1.0±0.05g di u campione di miele omogeneizatu in un tubu di centrifuga di polistirene 50ml;
----Aghjunghje 4ml d'acqua deionizzata, 0.5ml 1M HCl (suluzione3) è 100μl di reattivu derivatu (suluzione1);scuzzulate completamente per 2 minuti;
----Incubate à 37 ℃ durante a notte (circa 16 ore);
----Aghjunghje 5ml 0.1MK2HPO4 (suluzione2), 0,4 ml 1M NaOH (suluzione4) è 5ml acetate d'etile, agitate ferocemente per 30s;
----Centrifugare à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃) per 10 min, almenu 3000 g;
---- Pigliate 2,5 ml di a fase organica supernatante in un tubu di vetru pulitu da 10 ml, seccu cù gas di nitrogenu 50-60 ℃ o evaporatore rotativu;
----Dissolve u restu seccu cù 1 ml di n-hexane (o n-heptane), vortex per 30s, aghjunghje 1 ml di suluzione d'estrazione (suluzione5), vortex 1min, mischjà cumplitamenti.
----Centrifugare à a temperatura di l'ambienti (20-25oC) per 10 minuti, almenu 3000 g;
----Eliminà a fase organica supernatante;piglià 50μl di a fase acqua di sustrato per l'analisi.
- 9.Prucessu di analisi
9.1Avvisu prima di analisi
9.1.1 Assicuratevi chì tutti i reagenti è i microwells sò tutti à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃).
9.1.2 Ritorna tutti i reagenti di u restu à 2-8 ℃ immediatamente dopu l'usu.
9.1.3 Lavà i microwells currettamente hè un passu impurtante in u prucessu di analisi;hè u fattore vitale per a riproducibilità di l'analisi ELISA.
9.1.4 Evite u lume è copre i microwells durante l'incubazione.
9.2 Passi di analisi
9.2.1 Pigliate tutti i reagenti à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃) per più di 30 min, homogenize prima di l'usu.
9.2.2 Scuprite i micropozzi necessarii è rinviate u restu in u saccu zip-lock à 2-8 ℃ immediatamente.
9.2.3 A suluzione di lavatu cuncentrata è a suluzione d'estrazione cuncentrata deve esse rinfriscata per esse à a temperatura di l'ambienti prima di l'usu.
9.2.4numeru:Numerate ogni pusizioni di micropozzetti è tutti i standard è i campioni duveranu esse eseguiti in duplicatu.Registrate i standard è e pusizioni di campioni.
9.2.5Diluzione di suluzione cuncentrata di anticorpi: dilute a suluzione enzimatica cuncentrata cù diluenti di conjugate enzyme in u rapportu voluminu di 1: 10 (soluzione enzyme cuncentrata 1 volta: 10 volte diluenti conjugate enzyme).
9.2.6Aghjunghjite a suluzione standard / campione è a suluzione di conjugate enzyme: aghjunghje 50 µl di suluzione standard o campione preparatu à i pozzetti currispondenti, aghjunghje 50 µl di soluzione di coniugatu enzimaticu.Imbulighjate delicatamente scuzzulate a piastra manualmente è incubate per 30 minuti à 25 ℃ cù a tappa.
9.2.7Lavà: Retirer délicatement le couvercle et verser le liquide hors des puits et laver les micropoits avec 250 µl de solution de lavage diluée (suluzione6) à intervallu di 10s per 4-5 volte.Assorbe l'acqua residuale cù carta assorbente (a bolla di l'aire di restu pò esse eliminata cù una punta inutilizata).
9.2.8Culorazione: Ajouter 50 µl de solution de substrat A et 50 µl de solution de substrat B à chaque puits.Imbulighjate delicatamente scuzzulate a piastra manualmente è incubate per 15 minuti à 25 ℃ cù una coperta (vede 12.8).
9.2.11Misura: Ajouter 50 µl de solution stop à chaque puits.Imbulighjate delicatamente scuzzulate a piastra manualmente è misurà l'assorbanza à 450 nm (Suggerì a misura cù a doppia lunghezza d'onda di 450/630nm. Leghjite u risultatu in 5 minuti dopu l'aggiunta di suluzione stop.)
10 Risultati
10.1Assorbanza percentuale
I valori medii di i valori di assorbanza ottenuti per i standard è i campioni sò divisi da u valore di assorbanza di u primu standard (standard zero) è multiplicate da 100%.U standard zero hè dunque fattu uguali à 100% è i valori di assorbanza sò citati in percentuali.
=
B - standard di assorbanza (o campione)
B0 ——assorbanza zero standard
10.2Curva Standard
----Per disegnà una curva standard: Pigliate u valore di assorbanza di i standard cum'è l'asse y, semi-logaritmica di a cuncentrazione di a suluzione standard AOZ (ppb) cum'è l'assi x.
---- A cuncentrazione AOZ di ogni mostra (ppb), chì pò esse leghje da a curva di calibrazione, hè multiplicata da u fattore di diluzione currispundente di ogni mostra seguita, è a cuncentrazione attuale di mostra hè ottenuta.
Per piacè nutate:
Un software speciale hè statu sviluppatu per tutte e riduzzione di dati, chì pò esse furnitu nantu à dumanda.
Fattore di diluzione…………………………………………………2
10.Sensibilità, accuratezza è precisione
Sensibilità: 0,025 ppb
Limite di rilevazione:
Tissu (musculu, fegatu) ………………………… 0,1 ppb
Miele------------------------------------------------- -0,1 ppb
Precisione:
Tessuti animali (musculu è fegato)…………………100±20%
Miele………………………………………..………….. 100±20%
Precisione:CV di u kit ELISA hè menu di 10%.
11.Avvisu
12.1 I valori medii di i valori di assorbanza ottenuti per i normi è i campioni seranu ridotti se i reagenti è i campioni ùn sò micca stati regulati à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃).
12.2 Ùn permettenu micca chì i micropozzi si seccanu trà i passi per evità una riproducibilità senza successu è operate u passu prossimu immediatamente dopu à toccu u titularu di i micropozzi.
12.3 Agite ogni reattivu delicatamente prima di l'usu.
12.4 Mantene a vostra pelle luntanu da a suluzione di stop perchè hè u 0.5MH2SO4suluzione.
12.5 Ùn aduprate micca i kit obsoleti.Ùn scambiate micca i reagenti di diversi lotti, altrimenti abbandunà a sensibilità.
12.6 Cundizione di almacenamiento: Mantene i kit ELISA à 2-8 ℃, ùn congelate micca.Sigillate i piatti di micropozzetti di riposu, Evite a luce diretta di u sole durante tutte l'incubazioni.Hè ricumandemu di copre i platti di microtitre.
12.7 A suluzione di u sustratu deve esse abbandunatu s'ellu cambia i culori.I reagenti ponu esse deteriorati se u valore di assorbanza (450/630nm) di u standard zero hè menu di 0.5 (A450nm <0.5).
12.8 A reazione di colorazione necessita 15min dopu l'aghjunzione di suluzione di sustrato;Pudete allargà u tempu d'incubazione à 20min o più se u culore hè troppu chjaru per esse determinatu, ùn mai più di 25min. À u cuntrariu, accurtà u tempu d'incubazione bè.
12.9 A temperatura di reazione ottima hè 25 ℃.A temperatura più alta o più bassa porta à i cambiamenti di i valori di sensibilità è di assorbanza.
12.Condizioni di almacenamentu è u periodu di almacenamentu
Cundizione di almacenamentu: 2-8 ℃.
Periudu di almacenamiento: 12 mesi.