produkt

1. 1.Pozadí

Nitrofurany jsou syntetická širokospektrá antibiotika, která jsou často používána v živočišné výrobě pro své vynikající antibakteriální a farmakokinetické vlastnosti.Byly také používány jako stimulátory růstu při produkci prasat, drůbeže a vodních živočichů.Dlouhodobé studie na laboratorních zvířatech ukázaly, že původní léky a jejich metabolity vykazovaly karcinogenní a mutagenní vlastnosti.To vedlo k zákazu nitrofuranů pro léčbu zvířat používaných k výrobě potravin.Nitrofuranové léky furaltadon, nitrofurantoin a nitrofurazon byly v EU zakázány v roce 1993 a používání furazolidonu bylo zakázáno v roce 1995.

Analýza reziduí nitrofuranových léčiv musí být založena na detekci metabolitů nitrofuranových mateřských léčiv vázaných na tkáň.Vzhledem k tomu, že původní léčiva jsou velmi rychle metabolizována a metabolity nitrofuranu vázané na tkáň se udrží po dlouhou dobu, jsou tyto metabolity používány jako cíl při detekci zneužívání nitrofuranů, mezi které patří metabolit furazolidon (AOZ), metabolit furaltadon (AMOZ ), metabolit nitrofurantoinu (AHD) a metabolit nitrofurazonu (SEM).

AOZ-rezidua se stanovují nejčastěji pomocí LC-MS nebo LC-MS/MS.Enzymové imunoanalýzy ve srovnání s chromatografickými metodami vykazují značné výhody z hlediska citlivosti, detekčního limitu, technického vybavení a časové náročnosti.(Časová cena: 45 minut)

1. 2.Princip testu

Tato souprava ELISA je určena k detekci AOZ na principu nepřímé kompetitivní enzymové imunoanalýzy.Mikrotitrační jamky jsou potaženy záchytným BSA-vázaným antigenem.AOZ ve vzorku soutěží s antigenem potaženým na mikrotitrační destičce o přidanou protilátku.Po přidání enzymového konjugátu se použije chromogenní substrát a signál se měří spektrofotometrem.Absorpce je nepřímo úměrná koncentraci AOZ ve vzorku.

1. 3.Aplikace

Tento kit lze použít při kvantitativní a kvalitativní analýze reziduí AOZ vanima tkáně(svaly, játra atd.), med.

1. 4.Křížové reakce

Metabolit furazolidonu (AOZ)…………………………..100 %

Metabolit furaltadonu (AMOZ)………………………<0,1 %

Nitrofurantoinový metabolit (AHD)…………………………<0,1 %

Nitrofurazonový metabolit (SEM)………………………...<0,1 %

Furazolidon………………………………………….…..…16,3 %

Furaltadon…………………………………………….…<1 %

Nitrofurantoin……………………………………….…….…<1 %

Nitrofurazon………………………………………………..…<1 %

1. 5.Požadované materiály

5.1Vybavení

---- Mikrotitrační destičkový spektrofotometr (450nm/630nm)

---- Rotační výparník nebo nástroje na sušení dusíku

----Homogenizátor / stomacher

----Shaker

----Vortexový mixér

----Odstředivka

----Analytická váha (indukčnost: 0,01g)

----Odměrná pipeta: 10ml

---- Gumová pipetová baňka

----Odměrná baňka: 100ml

----Skleněná baňka: 10ml

---- Polystyrenová centrifugační zkumavka: 2ml, 50ml

----Mikropipety: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul multipipeta

5.2Reagencie

----Ethylacetát (AR)

----n-hexan (nebo n-heptan) (AR)

----Trihydrát hydrogenfosforečnanu draselného

(K₂HPO₄0,3H₂O) (AR)

----Koncentrovaná kyselina chlorovodíková (HCl, AR)

-----Metanol

---- Hydroxid sodný (NaOH, AR)

----Deionizovaná voda

1. 6.Součásti sady

l Mikrotitrační destička potažená antigenem, 96 jamek

l Standardní roztoky (6 lahviček, 1ml/lahev)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Standardní kontrola nástřiku: (1ml/lahev)....….100 ppb

l Koncentrovaný enzymový konjugát 1ml.......červené víčko

l Ředidla enzymových konjugátů 10ml………..zelený uzávěr

l Substrát A 7ml…………………………………..…..bílý uzávěr

l Substrát B 7ml………………………………………..…..červený uzávěr

l Stop roztok 7ml…………………………………žlutý uzávěr

l 20×koncentrovaný promývací roztok 40ml

…………………………………..……průhledný uzávěr

l 2×koncentrovaný extrakční roztok 60ml….modrý uzávěr

l 2-Nitrobenzaldehyd 15,1 mg………………bílý uzávěr

1. 7.Příprava činidel

Řešení 1: derivátové činidlo:

Přidejte 10 ml methanolu do lahvičky obsahující 2-nitrobenzaldehyd a rozpusťte.(při koncentraci 10 mM).

Řešení 2: 0,1 MK₂HPO₄řešení:

Váha 22,8g K₂HPO₄0,3H₂0 až 1 l deionizované vody k rozpuštění.

Řešení 3: 1M roztok HC1

Rozpusťte 8,3 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové deionizovanou vodou na 100 ml.

Řešení 4:1M roztok NaOH

Rozpusťte 4 g NaOH ve 100 ml deionizované vody.

Řešení 5: extrakční roztok:

2× koncentrovaný extrakční roztok nařeďte deionizovanou vodou v objemovém poměru 1:1.Tento roztok lze uchovat po dobu 1 měsíce při teplotě 4 °C, která bude použita k extrahování vzorků.

Řešení 6: mycí roztok:

20× koncentrovaný promývací roztok nařeďte deionizovanou vodou v objemovém poměru 1:19, která bude použita k promývání destiček.Tento zředěný roztok lze uchovat po dobu 1 měsíce při 4 °C.

1. 8.Vzorové přípravky

8.1Upozornění a bezpečnostní opatření před provozem:

a) V experimentu použijte jednorázové špičky a při absorbování jiného činidla je vyměňte.

b) Ujistěte se, že všechny experimentální přístroje jsou čisté.

c) derivační činidlo může být uchováno při 2-8 °C po dobu tří měsíců;

d) Roztok HCl lze uchovávat při teplotě místnosti po dobu 3 měsíců;

e) Roztok NaOH lze uchovávat 3 měsíce při teplotě místnosti;

f) Uchovávejte neošetřené vzorky v mrazu (-20 °C);

g) Ošetřené vzorky mohou být uchovány po dobu 24 hodin při 2-8 °C ve tmě.

8.2 Vzorky živočišné tkáně a jater:

----Homogenizujte vzorky pomocí homogenizátoru;

---- Navažte 1,0 ± 0,05 g homogenizovaného vzorku tkáně do 50 ml polystyrenové centrifugační zkumavky.Přidejte 4 ml deionizované vody, 0,5 ml 1M roztoku HCl a 100 ul derivačního činidla (viz roztok 1).Protřepávejte 2 min.

---- Inkubujte při 37 °C přes noc (asi 16 hodin);

---- Přidejte 5 ml 0,1 MK₂HPO₄ (řešení2), 0,4 ml 1M NaOH (řešení4) a 5 ml ethylacetátu.Silně protřepávejte po dobu 30 s;

---- Centrifugujte při pokojové teplotě (20-25℃) po dobu 10 minut, alespoň 3000 g;

---- Vezměte 2,5 ml supernatantu organické fáze do 10 ml čisté skleněné zkumavky, vysušte 50-60 °C plynným dusíkem nebo rotačním odpařovačem;

---- Suchý zbytek rozpusťte v 1 ml n-hexanu (nebo n-heptanu), vortexujte 30 s, přidejte 1 ml extrakčního roztoku (řešení5), vortexujte 1 min, zcela promíchejte.

---- Centrifugujte při pokojové teplotě (20-25^oC) po dobu 5 minut, alespoň 3000 g;

---- Odstraňte supernatant organickou fázi;odeberte 50 μl substrátové vodné fáze pro analýzu.

8.4 Zlato

---- navažte 1,0 ± 0,05 g homogenizovaného vzorku medu do 50 ml polystyrenové centrifugační zkumavky;

---- Přidejte 4 ml deionizované vody, 0,5 ml 1M HCl (řešení3) a 100 μl derivačního činidla (řešení1);úplně protřepejte po dobu 2 minut;

---- Inkubujte při 37 °C přes noc (asi 16 hodin);

----Přidejte 5ml 0,1MK₂HPO₄ (řešení2), 0,4 ml 1M NaOH (řešení4) a 5 ml ethylacetátu, prudce protřepávejte po dobu 30 s;

---- Centrifugujte při pokojové teplotě (20-25 ℃) po dobu 10 minut, alespoň 3000 g;

---- Odeberte 2,5 ml supernatantu organické fáze do 10 ml čisté skleněné zkumavky, vysušte 50-60 °C plynným dusíkem nebo rotačním odpařovačem;

---- Suchý zbytek rozpusťte v 1 ml n-hexanu (nebo n-heptanu), vortexujte 30 s, přidejte 1 ml extrakčního roztoku (řešení5), vortexujte 1 min, zcela promíchejte.

---- Centrifugujte při pokojové teplotě (20-25^oC) po dobu 10 minut, alespoň 3000 g;

---- Odstraňte supernatant organickou fázi;odeberte 50 μl substrátové vodné fáze pro analýzu.

1. 9.Proces testu

9.1Upozornění před testem

9.1.1 Ujistěte se, že všechna činidla a mikrojamky mají pokojovou teplotu (20-25 °C).

9.1.2 Ihned po použití vraťte všechna zbývající činidla na 2-8 °C.

9.1.3 Správné promytí mikrojamek je důležitým krokem v procesu testu;je to zásadní faktor pro reprodukovatelnost analýzy ELISA.

9.1.4 Během inkubace se vyhněte světlu a zakryjte mikrojamky.

9.2 Kroky testu

9.2.1 Všechny reagencie vyjměte při pokojové teplotě (20-25 °C) na více než 30 minut, před použitím je homogenizujte.

9.2.2 Vyjměte potřebné mikrojamky a zbytek okamžitě vraťte do sáčku se zipem při 2-8 °C.

9.2.3 Koncentrovaný promývací roztok a koncentrovaný extrakční roztok by se měly před použitím znovu zahřát na pokojovou teplotu.

9.2.4Číslo:Každá pozice mikrojamek očíslovaná a všechny standardy a vzorky by měly být zpracovány v duplikátech.Zaznamenejte pozice standardů a vzorků.

9.2.5Ředění koncentrovaného roztoku protilátky: zřeďte koncentrovaný roztok enzymu ředidly enzymového konjugátu v objemovém poměru 1:10 (1násobek koncentrovaného roztoku enzymu: 10násobek ředidel enzymového konjugátu).

9.2.6Přidejte standardní roztok/vzorek a roztok enzymového konjugátu: přidejte 50 µl standardního roztoku nebo připraveného vzorku do odpovídajících jamek, přidejte 50 µl roztoku enzymového konjugátu.Jemně promíchejte ručním protřepáním destičky a inkubujte 30 minut při 25 °C s krytem.

9.2.7Umýt: Opatrně sejměte kryt a vylijte tekutinu z jamek a opláchněte mikrojamky 250 µl zředěného promývacího roztoku (řešení6) v intervalu 10s 4-5krát.Absorbujte zbytkovou vodu savým papírem (zbytkové vzduchové bubliny lze odstranit nepoužitou špičkou).

9.2.8Zbarvení: Přidejte 50 ul substrátového roztoku A a 50 ul substrátového roztoku B do každé jamky.Jemně promíchejte ručním kýváním destičky a inkubujte 15 minut při 25 °C s krytem (viz 12.8).

9.2.11Opatření: Do každé jamky přidejte 50 µl zastavovacího roztoku.Jemně promíchejte ručním kýváním destičky a změřte absorbanci při 450 nm (doporučuje se měření s duální vlnovou délkou 450/630 nm. Výsledek odečtěte do 5 minut po přidání stop roztoku.)

10 Výsledek

10.1Procentuální absorbance

Průměrné hodnoty hodnot absorbance získané pro standardy a vzorky se vydělí hodnotou absorbance prvního standardu (nulový standard) a vynásobí se 100 %.Nulový standard se tedy rovná 100 % a hodnoty absorbance jsou uvedeny v procentech.

=

B ——absorbční standard (nebo vzorek)

B0 ——norma nulové absorbance

10.2Standardní křivka

----K nakreslení standardní křivky: Vezměte hodnotu absorbance standardů jako osu y, semilogaritmickou koncentraci standardního roztoku AOZ (ppb) jako osu x.

----Koncentrace AOZ každého vzorku (ppb), kterou lze odečíst z kalibrační křivky, se vynásobí odpovídajícím faktorem ředění každého sledovaného vzorku a získá se skutečná koncentrace vzorku.

Všimněte si prosím:

Pro všechny redukce dat byl vyvinut speciální software, který může být poskytnut na vyžádání.

Faktor ředění………………………………………….. 2

10.Citlivost, přesnost a preciznost

Citlivost: 0,025 ppb

Detekční limit:

Tkáň (sval, játra)………………………………0,1 ppb

Miláček------------------------------------------------- -0,1 ppb

Přesnost:

Živočišná tkáň (svaly a játra)……………………100±20 %

Med………………………………………………….. 100±20 %

Přesnost:CV soupravy ELISA je menší než 10 %.

11.Oznámení

12.1 Střední hodnoty hodnot absorbance získané pro standardy a vzorky budou sníženy, pokud reagencie a vzorky nebyly regulovány na pokojovou teplotu (20-25 °C).

12.2 Nenechávejte mikrojamky mezi jednotlivými kroky zaschnout, abyste předešli neúspěšné reprodukovatelnosti, a další krok proveďte ihned po klepnutí na držák mikrojamek.

12.3 Před použitím každé činidlo jemně protřepejte.

12.4 Udržujte pokožku mimo dosah roztoku na zastavení, protože je 0,5 MHz₂SO₄řešení.

12.5 Nepoužívejte zastaralé soupravy.Nevyměňujte reagencie z různých šarží, jinak by se snížila citlivost.

12.6 Podmínky skladování: Uchovávejte soupravy ELISA při 2-8 °C, nezmrazujte.Mikrotitrační destičky uzavřete, vyhněte se přímému slunečnímu záření během všech inkubací.Doporučuje se mikrotitrační destičky zakrýt.

12.7 Roztok substrátu by měl být opuštěn, pokud se barví.Reagencie se mohou znehodnotit, pokud je hodnota absorbance (450/630 nm) nulového standardu menší než 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Barevná reakce vyžaduje 15 minut po přidání roztoku substrátu;Inkubační dobu můžete prodloužit na 20 minut nebo více, pokud je barva příliš světlá na to, aby ji bylo možné určit, nikdy nepřekračujte 25 minut. Naopak inkubační dobu náležitě zkraťte.

12.9 Optimální reakční teplota je 25℃.Vyšší nebo nižší teplota povede ke změnám hodnot citlivosti a absorbance.

12.Podmínky skladování a doba skladování

Skladovací podmínky: 2-8℃.

Doba skladování: 12 měsíců.