produkt

Konkurrencedygtigt enzymimmunoassay-kit til kvantitativ analyse af furazolidon-metabolit (AOZ)

Kort beskrivelse:

Dette ELISA-kit er designet til at detektere AOZ baseret på princippet om indirekte konkurrerende enzymimmunoassay.Mikrotiterbrøndene er coatet med indfangnings-BSA-bundet antigen.AOZ i prøven konkurrerer med antigenet belagt på mikrotiterpladen om det tilsatte antistof.Efter tilsætning af enzymkonjugat anvendes kromogent substrat, og signalet måles med et spektrofotometer.Absorptionen er omvendt proportional med AOZ-koncentrationen i prøven.


Produktdetaljer

Produkt Tags

Konkurrencedygtigt enzymimmunoassay-kit til

Kvantitativ analyse afFurazolidon metabolit(AOZ)

 

  1. 1.Baggrund

Nitrofuraner er syntetiske bredspektrede antibiotika, som ofte anvendes i animalsk produktion på grund af dets fremragende antibakterielle og farmakokinetiske egenskaber.De var også blevet brugt som vækstfremmere i svine-, fjerkræ- og vandproduktion.I langtidsstudier med forsøgsdyr indikerede moderlægemidlerne og deres metabolitter kræftfremkaldende og mutagene egenskaber.Dette har ført til et forbud mod nitrofuraner til behandling af dyr, der anvendes til fødevareproduktion.Nitrofuran-stofferne furaltadon, nitrofurantoin og nitrofurazon blev forbudt i EU i 1993, og brugen af ​​furazolidon blev forbudt i 1995.

Analysen af ​​rester af nitrofuranlægemidler skal baseres på påvisningen af ​​de vævsbundne metabolitter af moderlægemidlerne for nitrofuran.Da moderlægemidlerne metaboliseres meget hurtigt, og de vævsbundne nitrofuranmetabolitter vil bibeholdes i lang tid, bruges disse metabolitter som mål ved påvisning af misbrug af nitrofuraner, som omfatter Furazolidon-metabolit (AOZ), Furaltadon-metabolit (AMOZ). ), Nitrofurantoin-metabolit (AHD) og Nitrofurazon-metabolit (SEM).

AOZ-rester bestemmes oftest af LC-MS eller LC-MS/MS.Enzymimmunoassays, sammenlignet med kromatografiske metoder, viser betydelige fordele med hensyn til følsomhed, detektionsgrænse, teknisk udstyr og tidsbehov.(Tidspris: 45 min)

  1. 2.Test princip

Dette ELISA-kit er designet til at detektere AOZ baseret på princippet om indirekte konkurrerende enzymimmunoassay.Mikrotiterbrøndene er coatet med indfangnings-BSA-bundet antigen.AOZ i prøven konkurrerer med antigenet belagt på mikrotiterpladen om det tilsatte antistof.Efter tilsætning af enzymkonjugat anvendes kromogent substrat, og signalet måles med et spektrofotometer.Absorptionen er omvendt proportional med AOZ-koncentrationen i prøven.

  1. 3.Ansøgninger

Dette sæt kan bruges til kvantitativ og kvalitativ analyse af AOZ-rester ianima væv(muskler, lever osv.), honning.

  1. 4.Krydsreaktioner

Furazolidon metabolit (AOZ) …………………………..100 %

Furaltadon-metabolit (AMOZ)………………………<0,1 %

Nitrofurantoin metabolit (AHD)…………………………<0,1 %

Nitrofurazonmetabolit (SEM)……………………………<0,1 %

Furazolidon………………………………………………………..…16,3 %

Furaltadon……………………………………………………….…<1 %

Nitrofurantoin……………………………………………….…….…<1 %

Nitrofurazon…………………………………………………..…<1 %

  1. 5.Nødvendige materialer

5.1Udstyr

---- Mikrotiterpladespektrofotometer (450nm/630nm)

---- Rotationsfordamper eller nitrogentørringsinstrumenter

---- Homogenisator / mavemiddel

----Shaker

----Hvirvelblander

---- Centrifuge

----Analytisk balance (induktans: 0,01g)

---- Graduerede pipette: 10ml

---- Gummi pipette pære

----Volumetrisk kolbe: 100ml

----Glaskolbe: 10ml

----Polystyren centrifugerør: 2ml, 50ml

----Mikropipetter: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Reagenser

---- Ethylacetat (AR)

----n-hexan (eller n-heptan) (AR)

---- Dikaliumhydrogenphosphattrihydrat

(K2HPO4.3H2O) (AR)

----Koncentreret saltsyre (HCl, AR)

-----Methanol

---- Natriumhydroxid (NaOH, AR)

----Deioniseret vand

  1. 6.Sættets komponenter

l Mikrotiterplade belagt med antigen, 96 brønde

l Standardopløsninger (6 flasker, 1 ml/flaske)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Spiking standard kontrol: (1ml/flaske)....….100 ppb

l Koncentreret enzymkonjugat 1ml……..rød hætte

l Enzymkonjugatfortyndere 10ml………..grøn hætte

l Substrat A 7ml………………………………………………………..…..hvid hætte

l Substrat B 7ml……………………………………………….…..rød hætte

l Stopopløsning 7ml………………………………… gul hætte

l 20×koncentreret vaskeopløsning 40ml

………………………………………….……gennemsigtig hætte

l 2×koncentreret ekstraktionsopløsning 60ml….blå hætte

l 2-Nitrobenzaldehyd 15,1mg………………hvid hætte

  1. 7.Forberedelse af reagenser

Løsning 1: afledt reagens:

Tilsæt 10 ml methanol til flasken med 2-nitrobenzaldehyd og opløs.(ved en koncentration på 10 mM).

Løsning 2: 0,1 MK2HPO4løsning:

Vejer 22,8g K2HPO4.3H2O til 1L deioniseret vand for at opløses.

Løsning 3: 1 M HCl-opløsning

Opløs 8,3 ml koncentreret saltsyre med deioniseret vand til 100 ml.

Løsning 4:1 M NaOH opløsning

Opløs 4 g NaOH med 100 ml deioniseret vand.

Løsning 5: ekstraktionsopløsning:

Fortynd 2×koncentreret ekstraktionsopløsning med deioniseret vand i volumenforholdet 1:1.Denne opløsning kan opbevares i 1 måned ved 4 ℃, som vil blive brugt til at udtrække prøver.

Løsning 6: vaskeopløsning:

Fortynd den 20×koncentrerede vaskeopløsning med deioniseret vand i volumenforholdet 1:19, som skal bruges til at vaske pladerne.Denne fortyndede opløsning kan opbevares i 1 måned ved 4 ℃.

  1. 8.Prøveforberedelser

8.1Bemærkning og forholdsregler før brug:

a) Brug venligst engangsspidser i eksperimentet, og skift spidserne, når du absorberer forskellige reagenser.

b) Sørg for, at alle eksperimentelle instrumenter er rene.

c) derivatreagenset kan konserveres ved 2-8 ℃ i tre måneder;

d) HCl-opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur i 3 måneder;

e) NaOH-opløsningen kan bevares i 3 måneder ved stuetemperatur;

f) Opbevar ubehandlede prøver i frys (-20 ℃);

g) Behandlede prøver kan opbevares i 24 timer ved 2-8 ℃ i mørke.

8.2 Dyrevævs- og leverprøver:

---- Homogeniser prøverne med homogenisator;

---- Vægt 1,0±0,05 g af den homogeniserede vævsprøve i 50 ml polystyren centrifugerør.Tilsæt 4 ml deioniseret vand, 0,5 ml 1 M HCl-opløsning og 100 ul derivatreagens (se opløsning 1).Ryst det i 2 min.

---- Inkuber ved 37 ℃ natten over (ca. 16 timer);

---- Tilføj 5ml 0,1MK2HPO4 (løsning2), 0,4 ml 1 M NaOH (løsning4) og 5 ml ethylacetat.Ryst voldsomt i 30'erne;

---- Centrifuger ved stuetemperatur (20-25 ℃) i 10 minutter, mindst 3000 g;

---- Tag 2,5 ml af supernatantens organiske fase i et 10 ml rent glasrør, tør med 50-60 ℃ nitrogengas eller rotationsfordamper;

---- Opløs den tørre rest med 1 ml n-hexan (eller n-heptan), vortex i 30 sekunder, tilsæt 1 ml ekstraktionsopløsning (løsning5), vortex 1 min, bland helt.

---- Centrifuger ved stuetemperatur (20-25oC) i 5 minutter, mindst 3000 g;

---- Fjern supernatantens organiske fase;tage 50 μl af substratets vandfase til analyse.

 

8.4 Honning

---- afvej 1,0±0,05 g af den homogeniserede honningprøve i et 50 ml polystyren centrifugerør;

---- Tilsæt 4 ml deioniseret vand, 0,5 ml 1 M HCl (løsning3) og 100μl derivatreagens (løsning1);ryst fuldstændigt i 2min;

---- Inkuber ved 37 ℃ natten over (ca. 16 timer);

----Tilsæt 5ml 0,1MK2HPO4 (løsning2), 0,4 ml 1 M NaOH (løsning4) og 5 ml ethylacetat, ryst kraftigt i 30 sekunder;

---- Centrifuger ved stuetemperatur (20-25 ℃) i 10 minutter, mindst 3000 g;

----Tag 2,5 ml af supernatantens organiske fase i et 10 ml rent glasrør, tør med 50-60 ℃ nitrogengas eller rotationsfordamper;

---- Opløs den tørre rest med 1 ml n-hexan (eller n- heptan), vortex i 30 sekunder, tilsæt 1 ml ekstraktionsopløsning (løsning5), vortex 1 min, bland helt.

----Centrifuger ved stuetemperatur (20-25oC) i 10 minutter, mindst 3000 g;

---- Fjern supernatantens organiske fase;tage 50 μl af substratets vandfase til analyse.

  1. 9.Assay proces

9.1Bemærk før assay

9.1.1 Sørg for, at alle reagenser og mikrobrønde er ved stuetemperatur (20-25 ℃).

9.1.2 Returner alle de resterende reagenser til 2-8 ℃ umiddelbart efter brug.

9.1.3 Korrekt vask af mikrobrøndene er et vigtigt trin i analysen;det er den afgørende faktor for reproducerbarheden af ​​ELISA-analysen.

9.1.4 Undgå lyset og dæk mikrobrøndene under inkubation.

9.2 Analysetrin

9.2.1 Tag alle reagenser ud ved stuetemperatur (20-25 ℃) i mere end 30 minutter, homogeniser før brug.

9.2.2 Få de nødvendige mikrobrønde ud og læg resten tilbage i zip-lock-posen ved 2-8 ℃ med det samme.

9.2.3 Den koncentrerede vaskeopløsning og den koncentrerede ekstraktionsopløsning skal genopvarmes til stuetemperatur før brug.

9.2.4Nummer:Nummereret hver mikrobrøndpositioner, og alle standarder og prøver skal køres i to eksemplarer.Registrer standarderne og prøvepositionerne.

9.2.5Fortynding af koncentreret antistofopløsning: fortynd den koncentrerede enzymopløsning med enzymkonjugatfortyndere i volumenforholdet 1:10 (1 gange koncentreret enzymopløsning: 10 gange enzymkonjugatfortyndere).

9.2.6Tilsæt standardopløsning/prøve og enzymkonjugatopløsning: tilsæt 50 µl standardopløsning eller forberedt prøve til tilsvarende brønde, tilsæt 50 µl enzymkonjugatopløsning.Bland forsigtigt ved at ryste pladen manuelt og inkuber i 30 minutter ved 25 ℃ med låg.

9.2.7Vask: Fjern forsigtigt låget og hæld væsken ud af brøndene og skyl mikrobrøndene med 250 µl fortyndet vaskeopløsning (løsning6) med et interval på 10 s i 4-5 gange.Absorber det resterende vand med absorberende papir (restluftboblen kan fjernes med ubrugt spids).

9.2.8Farvning: Tilsæt 50 µl substratopløsning A og 50 µl substratopløsning B til hver brønd.Bland forsigtigt ved at vippe pladen manuelt og inkuber i 15 minutter ved 25 ℃ med låg (se 12.8).

9.2.11Måle: Tilsæt 50 µl stopopløsningen til hver brønd.Bland forsigtigt ved at vippe pladen manuelt og mål absorbansen ved 450 nm (det foreslås at måle med dobbeltbølgelængden på 450/630 nm. Læs resultatet inden for 5 minutter efter tilsætning af stopopløsning).

10 Resultater

10.1Procent absorbans

Middelværdierne af absorbansværdierne opnået for standarderne og prøverne divideres med absorbansværdien af ​​den første standard (nulstandard) og ganges med 100%.Nulstandarden er således gjort lig med 100%, og absorbansværdierne er angivet i procenter.

=

B - Absorbansstandard (eller prøve)

B0 ——absorbans nul standard

10.2Standard kurve

---- Sådan tegnes en standardkurve: Tag absorbansværdien af ​​standarder som y-akse, semi-logaritmisk af koncentrationen af ​​AOZ-standardopløsningen (ppb) som x-akse.

---- AOZ-koncentrationen af ​​hver prøve (ppb), som kan aflæses fra kalibreringskurven, multipliceres med den tilsvarende fortyndingsfaktor for hver prøve, der følges, og den faktiske koncentration af prøven opnås.

Bemærk venligst:

Der er udviklet speciel software til al datareduktion, som kan leveres på forespørgsel.

Fortyndingsfaktor…………………………………………..……2

10.Følsomhed, nøjagtighed og præcision

Følsomhed: 0,025 ppb

Detektionsgrænse:

Væv (muskel, lever)…………………………0.1ppb

Honning------------------------------------------------- -0,1 ppb

Nøjagtighed:

Dyrevæv (muskel og lever)……………………100±20 %

Honning………………………………………..……………….... 100±20 %

Præcision:CV for ELISA-kittet er mindre end 10 %.

11.Varsel

12.1 Middelværdierne af absorbansværdierne opnået for standarderne og prøverne vil blive reduceret, hvis reagenserne og prøverne ikke er blevet reguleret til stuetemperatur (20-25℃).

12.2 Lad ikke mikrobrønde tørre mellem trinene for at undgå mislykket reproducerbarhed, og udfør det næste trin umiddelbart efter at have banket på mikrobrøndholderen.

12.3 Ryst hvert reagens forsigtigt før brug.

12.4 Hold din hud væk fra stopopløsningen, for det er 0,5MH2SO4løsning.

12.5 Brug ikke sættene forældede.Udskift ikke reagenserne fra forskellige batches, ellers vil det falde følsomheden.

12.6 Opbevaringsforhold: Opbevar ELISA-sættene ved 2-8 ℃, må ikke fryses.Forsegl hvile mikrobrønds plader. Undgå direkte sollys under alle inkubationer.Det anbefales at dække mikrotiterpladerne.

12.7 Substratopløsningen bør opgives, hvis den får farve.Reagenserne kan blive forringet, hvis absorbansværdien (450/630 nm) af nulstandarden er mindre end 0,5 (A450 nm<0,5).

12.8 Farvningsreaktionen tager 15 minutter efter tilsætning af substratopløsning;Du kan forlænge inkubationstiden til 20min eller mere, hvis farven er for lys til at kunne bestemmes., overskrid aldrig 25min. Tværtimod, forkort inkubationstiden ordentligt.

12.9 Den optimale reaktionstemperatur er 25℃.Højere eller lavere temperatur vil føre til ændringer af følsomheds- og absorbansværdier.

12.Opbevaringstilstand og opbevaringsperiode

Opbevaringstilstand: 2-8 ℃.

Opbevaringstid: 12 måneder.

 

 


  • Tidligere:
  • Næste:

  • Skriv din besked her og send den til os

    Relaterede produkter