Produkt

1. 1.Hintergrund

Nitrofurane sind synthetische Breitbandantibiotika, die wegen ihrer hervorragenden antibakteriellen und pharmakokinetischen Eigenschaften häufig in der Tierproduktion eingesetzt werden.Sie wurden auch als Wachstumsförderer in der Schweine-, Geflügel- und Aquakultur verwendet.Langzeitstudien mit Labortieren zeigten, dass die Ausgangssubstanzen und ihre Metaboliten krebserzeugende und mutagene Eigenschaften aufwiesen.Dies hat zu einem Verbot von Nitrofuranen zur Behandlung von Tieren geführt, die zur Lebensmittelerzeugung verwendet werden.Die Nitrofuran-Medikamente Furaltadon, Nitrofurantoin und Nitrofurazon wurden 1993 in der EU für die Verwendung in der Lebensmitteltierhaltung verboten, und die Verwendung von Furazolidon wurde 1995 verboten.

Die Analyse von Nitrofuran-Drogenrückständen muss auf dem Nachweis der gewebegebundenen Metaboliten der Nitrofuran-Ausgangsdrogen basieren.Da die Ausgangssubstanzen sehr schnell metabolisiert werden und die gewebegebundenen Nitrofuran-Metaboliten für lange Zeit erhalten bleiben, werden diese Metaboliten als Ziel beim Nachweis des Missbrauchs von Nitrofuranen verwendet, zu denen der Furazolidon-Metabolit (AOZ), der Furaltadon-Metabolit (AMOZ ), Nitrofurantoin-Metabolit (AHD) und Nitrofurazon-Metabolit (SEM).

AOZ-Rückstände werden am häufigsten mittels LC-MS oder LC-MS/MS bestimmt.Enzymimmunoassays weisen gegenüber chromatographischen Verfahren erhebliche Vorteile hinsichtlich Sensitivität, Nachweisgrenze, technischer Ausstattung und Zeitbedarf auf.(Zeitaufwand: 45min)

1. 2.Testprinzip

Dieses ELISA-Kit dient zum Nachweis von AOZ nach dem Prinzip des indirekt-kompetitiven Enzymimmunoassays.Die Mikrotiter-Vertiefungen sind mit Fang-BSA-gekoppeltem Antigen beschichtet.AOZ in der Probe konkurriert mit dem auf der Mikrotiterplatte beschichteten Antigen um den zugesetzten Antikörper.Nach Zugabe von Enzymkonjugat wird chromogenes Substrat verwendet und das Signal mit einem Spektrophotometer gemessen.Die Absorption ist umgekehrt proportional zur AOZ-Konzentration in der Probe.

1. 3.Anwendungen

Dieses Kit kann zur quantitativen und qualitativen Analyse von AOZ-Rückständen in verwendet werdenAnima-Gewebe(Muskel, Leber usw.), Honig.

1. 4.Kreuzreaktionen

Furazolidon-Metabolit (AOZ)……………………..100 %

Furaltadon-Metabolit (AMOZ)……………………<0,1 %

Nitrofurantoin-Metabolit (AHD)……………………<0,1 %

Nitrofurazon-Metabolit (SEM)…………………...…<0,1 %

Furazolidon…………………………………….…..…16,3 %

Furaltadon…………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon…………………………………………..…<1%

1. 5.Benötigte Materialien

5.1Ausrüstungen

----Mikrotiterplatten-Spektrophotometer (450nm/630nm)

----Rotationsverdampfer oder Stickstofftrocknungsinstrumente

----Homogenisierer / Stomacher

----Shaker

----Vortexmixer

----Zentrifuge

----Analysenwaage (Induktivität: 0,01 g)

----Messpipette: 10ml

----Pipettenbirne aus Gummi

----Messkolben: 100ml

----Glaskolben: 10ml

----Polystyrol-Zentrifugenröhrchen: 2 ml, 50 ml

----Mikropipetten: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-Multipipette

5.2Reagenzien

----Ethylacetat (AR)

----n-Hexan (oder n-Heptan) (AR)

----Dikaliumhydrogenphosphattrihydrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Konzentrierte Salzsäure (HCl, AR)

-----Methanol

----Natriumhydroxid (NaOH, AR)

----Deionisiertes Wasser

1. 6.Kit-Komponenten

l Antigenbeschichtete Mikrotiterplatte, 96 Vertiefungen

l Standardlösungen (6 Flaschen, 1 ml/Flasche)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Dotierung Standardkontrolle : (1ml/Flasche)....….100 ppb

l Konzentriertes Enzymkonjugat 1ml……..rote Kappe

l Enzymkonjugat-Verdünnungsmittel 10ml………..grüne Kappe

l Substrat A 7ml………..............…....…..…..weiße Kappe

l Substrat B 7ml………..............…........….…..rote Kappe

l Stopplösung 7ml……………………………gelbe Kappe

l 20×konzentrierte Waschlösung 40ml

…………………………………….……transparente Kappe

l 2×konzentrierte Extraktionslösung 60ml….blaue Kappe

l 2-Nitrobenzaldehyd 15,1 mg………………weiße Kappe

1. 7.Vorbereitung der Reagenzien

Lösung 1: Derivat Reagenz:

10 ml Methanol in die Flasche mit 2-Nitrobenzaldehyd geben und auflösen.(bei einer Konzentration von 10 mM).

Lösung 2: 0,1 MK₂HPO₄Lösung:

Wiege 22,8 g K₂HPO₄.3H₂O bis 1 l deionisiertes Wasser zum Auflösen.

Lösung 3: 1 M HCl-Lösung

8,3 ml konzentrierte Salzsäure auflösen mit deionisiertem Wasser auf 100ml.

Lösung 4:1 M NaOH-Lösung

Lösen Sie 4 g NaOH mit 100 ml deionisiertem Wasser auf.

Lösung 5: Extraktionslösung:

2x konzentrierte Extraktionslösung mit deionisiertem Wasser im Volumenverhältnis 1:1 verdünnen.Diese Lösung kann für 1 Monat bei 4℃ gelagert werden, die zum Extrahieren von Proben verwendet wird.

Lösung 6: Waschlösung:

Verdünnen Sie die 20-fach konzentrierte Waschlösung mit entionisiertem Wasser im Volumenverhältnis 1:19, das zum Waschen der Platten verwendet wird.Diese verdünnte Lösung kann 1 Monat bei 4℃ aufbewahrt werden.

1. 8.Probenvorbereitungen

8.1Hinweis und Vorsichtsmaßnahmen vor dem Betrieb:

a) Bitte verwenden Sie einmalige Spitzen im Experiment und wechseln Sie die Spitzen, wenn Sie andere Reagenzien aufnehmen.

b) Stellen Sie sicher, dass alle Versuchsinstrumente sauber sind.

c) das abgeleitete Reagenz kann bei 2-8℃ für drei Monate konserviert werden;

d) Die HCl-Lösung kann 3 Monate bei Raumtemperatur aufbewahrt werden;

e) Die NaOH-Lösung ist 3 Monate bei Raumtemperatur haltbar;

f) Halten Sie unbehandelte Proben im Gefrierschrank (-20℃);

g) Behandelte Proben können für 24 Stunden bei 2-8℃ im Dunkeln aufbewahrt werden.

8.2 Tiergewebe- und Leberproben:

----Proben mit Homogenisator homogenisieren;

----1,0 ± 0,05 g der homogenisierten Gewebeprobe in ein 50-ml-Polystyrol-Zentrifugenröhrchen einwiegen.Fügen Sie 4 ml deionisiertes Wasser, 0,5 ml 1 M HCl-Lösung und 100 ul Derivat-Reagenz hinzu (siehe Lösung 1).Schütteln Sie es für 2min.

---- Bei 37℃ über Nacht inkubieren (ca. 16h);

---- Fügen Sie 5 ml 0,1 MK hinzu₂HPO₄ (Lösung2), 0,4 ml 1 M NaOH (Lösung4) und 5 ml Ethylacetat.30 Sekunden lang heftig schütteln;

---- Bei Raumtemperatur (20-25℃) für 10min zentrifugieren, mindestens 3000g;

---- 2,5 ml der überstehenden organischen Phase in ein sauberes 10-ml-Glasröhrchen geben, mit 50-60℃ Stickstoffgas oder Rotationsverdampfer trocknen;

---- Trockene Reste mit 1ml n-Hexan (oder n-Heptan) auflösen, 30s vortexen, 1ml Extraktionslösung zugeben (Lösung5), 1 Minute vortexen, vollständig mischen.

---- Bei Raumtemperatur zentrifugieren (20-25^oC) für 5 min, mindestens 3000 g;

---- Entfernen Sie die überstehende organische Phase;Nehmen Sie 50 μl der Substratwasserphase für den Assay.

8.4 Honig

---- 1,0 ± 0,05 g der homogenisierten Honigprobe in ein 50-ml-Polystyrol-Zentrifugenröhrchen einwiegen;

----Fügen Sie 4 ml deionisiertes Wasser, 0,5 ml 1 M HCl (Lösung3) und 100 μl Derivatreagenz (Lösung1);2min komplett schütteln;

----Inkubieren Sie bei 37℃ über Nacht (ca. 16h);

----Fügen Sie 5 ml 0,1 MK hinzu₂HPO₄ (Lösung2), 0,4 ml 1 M NaOH (Lösung4) und 5 ml Ethylacetat, 30 Sekunden lang kräftig schütteln;

----Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur (20-25℃) für 10 Minuten, mindestens 3000 g;

----2,5 ml der überstehenden organischen Phase in ein sauberes 10-ml-Glasröhrchen geben, mit 50-60℃ Stickstoffgas oder Rotationsverdampfer trocknen;

----Trockene Reste mit 1 ml n-Hexan (oder n-Heptan) auflösen, 30 s vortexen, 1 ml Extraktionslösung zugeben (Lösung5), 1 Minute vortexen, vollständig mischen.

----Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur (20-25^oC) für 10 min, mindestens 3000 g;

----Entferne die überstehende organische Phase;Nehmen Sie 50 μl der Substratwasserphase für den Assay.

1. 9.Assay-Prozess

9.1Hinweis vor dem Assay

9.1.1 Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien und Mikrovertiefungen Raumtemperatur (20-25℃) haben.

9.1.2 Bringen Sie alle restlichen Reagenzien sofort nach Gebrauch wieder auf 2-8℃ zurück.

9.1.3 Das korrekte Waschen der Mikrowells ist ein wichtiger Schritt im Assayverfahren;es ist der lebenswichtige Faktor für die Reproduzierbarkeit der ELISA-Analyse.

9.1.4 Vermeiden Sie Licht und decken Sie die Mikrowells während der Inkubation ab.

9.2 Assay-Schritte

9.2.1 Alle Reagenzien bei Raumtemperatur (20-25℃) länger als 30 Minuten entnehmen, vor Gebrauch homogenisieren.

9.2.2 Holen Sie die benötigten Mikrowells heraus und geben Sie den Rest sofort bei 2-8℃ in den Reißverschlussbeutel zurück.

9.2.3 Die konzentrierte Waschlösung und die konzentrierte Extraktionslösung sollten vor Gebrauch wieder auf Raumtemperatur erwärmt werden.

9.2.4Anzahl:Alle Mikrowell-Positionen sind nummeriert und alle Standards und Proben sollten doppelt ausgeführt werden.Notieren Sie die Standards und Probenpositionen.

9.2.5Verdünnung der konzentrierten Antikörperlösung: Verdünnen Sie die konzentrierte Enzymlösung mit Enzymkonjugat-Verdünnungsmitteln im Volumenverhältnis 1:10 (1-fach konzentrierte Enzymlösung: 10-fach Enzymkonjugat-Verdünnungsmittel).

9.2.6Standardlösung / Probe und Enzymkonjugatlösung zugeben: 50 µl Standardlösung oder vorbereitete Probe in die entsprechenden Vertiefungen geben, 50 µl Enzymkonjugatlösung zugeben.Durch manuelles Schütteln der Platte vorsichtig mischen und 30 min bei 25℃ mit Deckel inkubieren.

9.2.7Waschen: Entfernen Sie vorsichtig die Abdeckung und gießen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen und spülen Sie die Mikrovertiefungen mit 250 µl verdünnter Waschlösung (Lösung6) im Abstand von 10 Sekunden für 4-5 Mal.Restwasser mit saugfähigem Papier aufsaugen (die Restluftblase kann mit unbenutzter Spitze beseitigt werden).

9.2.8Färbung: 50 µl Substratlösung A und 50 µl Substratlösung B in jede Vertiefung geben.Vorsichtig durch manuelles Schütteln der Platte mischen und 15 min bei 25℃ mit Deckel inkubieren (siehe 12.8).

9.2.11Messen: 50 µl Stopplösung in jede Vertiefung geben.Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Platte manuell schütteln, und messen Sie die Extinktion bei 450 nm (Es wird empfohlen, mit der Doppelwellenlänge von 450/630 nm zu messen. Lesen Sie das Ergebnis innerhalb von 5 Minuten nach Zugabe der Stopplösung ab.)

10 Ergebnisse

10.1Prozent Absorption

Die ermittelten Mittelwerte der Extinktionswerte der Standards und der Proben werden durch den Extinktionswert des ersten Standards (Nullstandard) dividiert und mit 100 % multipliziert.Der Nullstandard wird somit gleich 100 % gesetzt und die Extinktionswerte in Prozent angegeben.

=

B ——Extinktionsstandard (oder Probe)

B0 — Extinktionsnullstandard

10.2Standardkurve

----Um eine Standardkurve zu zeichnen: Nehmen Sie den Extinktionswert der Standards als y-Achse, halblogarithmisch der Konzentration der AOZ-Standardlösung (ppb) als x-Achse.

----Die AOZ-Konzentration jeder Probe (ppb), die aus der Kalibrierungskurve abgelesen werden kann, wird mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor jeder gefolgten Probe multipliziert, und die tatsächliche Konzentration der Probe wird erhalten.

Bitte beachten Sie:

Für alle Datenreduktionen wurde spezielle Software entwickelt, die auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden kann.

Verdünnungsfaktor………………………………………..……2

10.Sensibilität, Genauigkeit und Präzision

Empfindlichkeit: 0,025 ppb

Nachweisgrenze:

Gewebe (Muskel, Leber) …………………………0,1 ppb

Schatz------------------------------------------------- -0,1 ppb

Genauigkeit:

Tierisches Gewebe (Muskel und Leber)…………………100±20%

Honig………………………………..………….... 100±20%

Präzision:Der CV des ELISA-Kits beträgt weniger als 10 %.

11.Notiz

12.1 Die Mittelwerte der für die Standards und Proben erhaltenen Extinktionswerte verringern sich, wenn die Reagenzien und Proben nicht auf Raumtemperatur (20-25℃) reguliert wurden.

12.2 Lassen Sie die Mikrowells zwischen den Schritten nicht trocknen, um eine erfolglose Reproduzierbarkeit zu vermeiden, und führen Sie den nächsten Schritt unmittelbar nach dem Klopfen auf den Mikrowell-Halter durch.

12.3 Schütteln Sie jedes Reagenz vor Gebrauch vorsichtig.

12.4 Halten Sie Ihre Haut von der Stopplösung fern, da es sich um 0,5 MH handelt₂SO₄Lösung.

12.5 Verwenden Sie keine veralteten Kits.Tauschen Sie die Reagenzien verschiedener Chargen nicht aus, da sonst die Empfindlichkeit sinkt.

12.6 Lagerbedingungen: Bewahren Sie die ELISA-Kits bei 2–8 °C auf, nicht einfrieren.Rest-Mikrotiterplatten versiegeln. Während aller Inkubationen direktes Sonnenlicht vermeiden.Es wird empfohlen, die Mikrotiterplatten abzudecken.

12.7 Substratlösung sollte aufgegeben werden, wenn sie sich verfärbt.Die Reagenzien können beschädigt werden, wenn der Extinktionswert (450/630 nm) des Nullstandards weniger als 0,5 beträgt (E450 nm < 0,5).

12.8 Die Färbereaktion benötigt 15 min nach Zugabe der Substratlösung;Sie können die Inkubationszeit auf 20 Minuten oder mehr verlängern, wenn die Farbe zu hell ist, um sie zu bestimmen. Überschreiten Sie niemals 25 Minuten. Im Gegenteil, verkürzen Sie die Inkubationszeit angemessen.

12.9 Die optimale Reaktionstemperatur beträgt 25℃.Höhere oder niedrigere Temperaturen führen zu Änderungen der Empfindlichkeits- und Extinktionswerte.

12.Lagerbedingungen und Lagerdauer

Lagerbedingungen: 2-8℃.

Speicherdauer: 12 Monate.