προϊόν

1. 1.Ιστορικό

Τα νιτροφουράνια είναι συνθετικά αντιβιοτικά ευρέος φάσματος, τα οποία χρησιμοποιούνται συχνά στη ζωική παραγωγή για τις εξαιρετικές αντιβακτηριακές και φαρμακοκινητικές τους ιδιότητες.Είχαν επίσης χρησιμοποιηθεί ως αυξητικοί παράγοντες στην παραγωγή χοίρων, πουλερικών και υδρόβιων ζώων.Σε μακροχρόνιες μελέτες με πειραματόζωα έδειξαν ότι τα μητρικά φάρμακα και οι μεταβολίτες τους παρουσίαζαν καρκινογόνα και μεταλλαξιογόνα χαρακτηριστικά.Αυτό οδήγησε σε απαγόρευση των νιτροφουρανίων για τη θεραπεία ζώων που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή τροφίμων.Τα νιτροφουρανικά φάρμακα φουραλταδόνη, νιτροφουραντοΐνη και νιτροφουραζόνη απαγορεύτηκε να χρησιμοποιηθούν στη ζωική παραγωγή τροφίμων στην ΕΕ το 1993 και η χρήση της φουραζολιδόνης απαγορεύτηκε το 1995.

Η ανάλυση των υπολειμμάτων φαρμάκων νιτροφουρανίου πρέπει να βασίζεται στην ανίχνευση των δεσμευμένων στον ιστό μεταβολιτών των μητρικών φαρμάκων νιτροφουρανίου.Δεδομένου ότι τα μητρικά φάρμακα μεταβολίζονται πολύ γρήγορα και οι μεταβολίτες του νιτροφουρανίου που συνδέονται με τον ιστό θα διατηρηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα, αυτοί οι μεταβολίτες χρησιμοποιούνται ως στόχος στην ανίχνευση της κατάχρησης νιτροφουρανίων, στα οποία περιλαμβάνονται ο μεταβολίτης Furazolidone (AOZ), μεταβολίτης Furaltadone (AMOZ ), μεταβολίτης νιτροφουραντοΐνης (AHD) και μεταβολίτης νιτροφουραζόνης (SEM).

Τα υπολείμματα AOZ προσδιορίζονται συνηθέστερα με LC-MS ή LC-MS/MS.Οι ενζυμικές ανοσοδοκιμασίες, σε σύγκριση με τις χρωματογραφικές μεθόδους, παρουσιάζουν σημαντικά πλεονεκτήματα όσον αφορά την ευαισθησία, το όριο ανίχνευσης, τον τεχνικό εξοπλισμό και την απαίτηση χρόνου.(Χρόνος: 45 λεπτά)

1. 2.Αρχή δοκιμής

Αυτό το κιτ ELISA έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση AOZ με βάση την αρχή της έμμεσης-ανταγωνιστικής ενζυμικής ανοσοδοκιμασίας.Τα φρεάτια μικροτιτλοδότησης επικαλύπτονται με δεσμευμένο με BSA αντιγόνο.Το AOZ στο δείγμα ανταγωνίζεται το αντιγόνο που είναι επικαλυμμένο στην πλάκα μικροτιτλοδότησης για το αντίσωμα που προστέθηκε.Μετά την προσθήκη του συζυγούς ενζύμου, χρησιμοποιείται χρωμογόνο υπόστρωμα και το σήμα μετράται με φασματοφωτόμετρο.Η απορρόφηση είναι αντιστρόφως ανάλογη με τη συγκέντρωση AOZ στο δείγμα.

1. 3.Εφαρμογές

Αυτό το κιτ μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ποσοτική και ποιοτική ανάλυση των υπολειμμάτων AOZζωικούς ιστούς(μύες, συκώτι κλπ), μέλι.

1. 4.Διασταυρούμενες αντιδράσεις

Μεταβολίτης φουραζολιδόνη (AOZ)………………………..100%

Μεταβολίτης φουραλταδόνης (AMOZ)……………………<0,1%

Μεταβολίτης νιτροφουραντοΐνης (AHD)……………………<0,1%

Μεταβολίτης νιτροφουραζόνης (SEM)………………………<0,1%

Φουραζολιδόνη………………………………………..…16,3%

Φουραλταδόνη……………………………………………<1%

Νιτροφουραντοΐνη……………………………………………<1%

Νιτροφουραζόνη……………………………………………<1%

1. 5.Απαιτούμενα υλικά

5.1Εξοπλισμοί

----Φασματοφωτόμετρο πλάκας μικροτίτλου (450nm/630nm)

----Όργανα περιστροφικού εξατμιστή ή ξήρανσης αζώτου

----Ομογενοποιητής /στομαχιστής

----Σέικερ

----Μίκτης Vortex

----Φυγόκεντρος

----Αναλυτική ισορροπία (επαγωγή: 0,01 g)

----Βαθμολογημένη πιπέτα: 10ml

----Λαμπτήρας πιπέτας από καουτσούκ

----Ογκομετρική φιάλη: 100ml

----Γυάλινη φιάλη: 10ml

----Φυγοκεντρικός σωλήνας πολυστυρενίου: 2ml, 50ml

----Μικροπιπέτες: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250 ul-πολυπιπέτα

5.2Αντιδραστήρια

----Οξεικός αιθυλεστέρας (AR)

----n-εξάνιο (ή ν-επτάνιο) (AR)

----Τριένυδρο όξινο φωσφορικό δικάλιο

(K₂HPO₄.3Η₂O) (AR)

----Πυκνό υδροχλωρικό οξύ (HCl, AR)

-----Μεθανόλη

----Υδροξείδιο του νατρίου (NaOH, AR)

----Απιονισμένο νερό

1. 6.Εξαρτήματα κιτ

l Πλάκα μικροτίτλου επικαλυμμένη με αντιγόνο, 96 φρεάτια

l Τυποποιημένα διαλύματα (6 φιάλες, 1 ml/φιάλη)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Τυπικός έλεγχος Spiking : (1ml/φιάλη)........100 ppb

l Συμπυκνωμένο ενζυμικό σύζευγμα 1ml.........κόκκινο καπάκι

l Συζυγή αραιωτικά ενζύμων 10ml………..πράσινο καπάκι

l Υπόστρωμα A 7ml……………………………..λευκό καπάκι

l Υπόστρωμα Β 7ml………………………………..κόκκινο καπάκι

l Σταματήστε τη λύση 7ml …………………………… Κίτρινο καπάκι

l 20×συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης 40ml

……………………………………………διαφανές καπάκι

l 2×συμπυκνωμένο διάλυμα εκχύλισης 60ml….μπλε πώμα

l 2-Νιτροβενζαλδεΰδη 15,1 mg………………λευκό καπάκι

1. 7.Προετοιμασία αντιδραστηρίων

Λύση 1: παράγωγο αντιδραστήριο:

Προσθέστε 10 ml μεθανόλης στη φιάλη με 2-Νιτροβενζαλδεΰδη και διαλύστε.(σε συγκέντρωση 10 mM).

Λύση 2: 0,1 MK₂HPO₄λύση:

Βάρος 22,8 g K₂HPO₄.3Η₂O έως 1L απιονισμένου νερού για διάλυση.

Λύση 3: Διάλυμα HCl 1M

Διαλύστε 8,3 ml πυκνού υδροχλωρικού οξέος με απιονισμένο νερό στα 100ml.

Λύση 4:Διάλυμα NaOH 1M

Διαλύστε 4 g NaOH με 100 ml απιονισμένου νερού.

Λύση 5: διάλυμα εκχύλισης:

Αραιώστε 2× πυκνό διάλυμα εκχύλισης με απιονισμένο νερό σε αναλογία όγκου 1:1.Αυτό το διάλυμα μπορεί να διατηρηθεί για 1 μήνα στους 4℃, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή δειγμάτων.

Λύση 6: διάλυμα πλύσης:

Αραιώστε το 20×συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης με απιονισμένο νερό σε αναλογία όγκου 1:19, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί για το πλύσιμο των πλακών.Αυτό το αραιωμένο διάλυμα μπορεί να διατηρηθεί για 1 μήνα στους 4℃.

1. 8.Παρασκευάσματα δειγμάτων

8.1Σημείωση και προφυλάξεις πριν από τη λειτουργία:

α) Χρησιμοποιήστε μεμονωμένες συμβουλές στο πείραμα και αλλάξτε τις άκρες όταν απορροφάτε διαφορετικά αντιδραστήρια.

β) Βεβαιωθείτε ότι όλα τα πειραματικά όργανα είναι καθαρά.

γ) το παράγωγο αντιδραστήριο μπορεί να διατηρηθεί στους 2-8℃ για τρεις μήνες.

δ) Το διάλυμα HCl μπορεί να διατηρηθεί σε θερμοκρασία δωματίου για 3 μήνες.

ε) Το διάλυμα NaOH μπορεί να διατηρηθεί για 3 μήνες σε θερμοκρασία δωματίου.

στ) Διατηρήστε τα μη επεξεργασμένα δείγματα σε κατάψυξη (-20℃).

ζ) Τα επεξεργασμένα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν για 24 ώρες στους 2-8℃ στο σκοτάδι.

8.2 Δείγματα ζωικού ιστού και ήπατος:

----Ομογενοποιήστε τα δείγματα με ομογενοποιητή.

---- Βάρος 1,0±0,05 g του ομογενοποιημένου δείγματος ιστού σε σωλήνα φυγοκέντρησης πολυστυρενίου 50 ml.Προσθέστε 4 ml απιονισμένου νερού, 0,5 ml διαλύματος HCl 1M και 100 μl αντιδραστηρίου παραγώγου (βλ. διάλυμα 1).Ανακινήστε το για 2 λεπτά.

---- Επώαση στους 37℃ όλη τη νύχτα (περίπου 16 ώρες).

---- Προσθέστε 5ml 0,1MK₂HPO₄ (λύση2), 0,4 ml 1M NaOH (λύση4) και 5 ml οξικού αιθυλεστέρα.Ανακινήστε δυνατά για 30 δευτερόλεπτα.

---- Φυγοκεντρήστε σε θερμοκρασία δωματίου (20-25℃) για 10 λεπτά, τουλάχιστον 3000 g.

---- Πάρτε 2,5 ml της υπερκείμενης οργανικής φάσης σε καθαρό γυάλινο σωλήνα 10 ml, στεγνώστε με αέριο άζωτο 50-60℃ ή περιστροφικό εξατμιστή.

---- Διαλύουμε το ξηρό υπόλοιπο με 1ml n-εξάνιο (ή n-επτάνιο), ανακατεύουμε για 30 δευτερόλεπτα, προσθέτουμε 1ml διάλυμα εκχύλισης (λύση5), αναδεύστε 1 λεπτό, ανακατέψτε πλήρως.

---- Φυγοκεντρήστε σε θερμοκρασία δωματίου (20-25^oΓ) για 5 λεπτά, τουλάχιστον 3000 γρ.

---- Αφαιρέστε την υπερκείμενη οργανική φάση.πάρτε 50 μl της υδατικής φάσης του υποστρώματος για ανάλυση.

8.4 Μέλι

----ζυγίστε 1,0±0,05 g του ομογενοποιημένου δείγματος μελιού σε ένα φυγοκεντρικό σωλήνα πολυστυρενίου 50 ml.

----Προσθέστε 4ml απιονισμένο νερό, 0,5ml 1M HCl (λύση3) και αντιδραστήριο παραγώγου 100μl (λύση1);ανακινήστε τελείως για 2 λεπτά.

---- Επώαση στους 37℃ όλη τη νύχτα (περίπου 16 ώρες).

----Προσθέστε 5ml 0,1MK₂HPO₄ (λύση2), 0,4 ml 1M NaOH (λύση4) και 5 ml οξικού αιθυλεστέρα, ανακινήστε δυνατά για 30 δευτερόλεπτα.

----Φυγοκεντρήστε σε θερμοκρασία δωματίου (20-25℃) για 10 λεπτά, τουλάχιστον 3000g.

---- Πάρτε 2,5 ml της υπερκείμενης οργανικής φάσης σε καθαρό γυάλινο σωλήνα 10 ml, στεγνώστε με αέριο άζωτο 50-60℃ ή περιστροφικό εξατμιστή.

----Διαλύουμε το ξηρό υπόλοιπο με 1ml n-εξάνιο (ή n-επτάνιο), ανακατεύουμε για 30 δευτερόλεπτα, προσθέτουμε 1ml διάλυμα εκχύλισης (λύση5), αναδεύστε 1 λεπτό, ανακατέψτε πλήρως.

----Φυγοκεντρήστε σε θερμοκρασία δωματίου (20-25^oΓ) για 10 λεπτά, τουλάχιστον 3000 γρ.

----Αφαιρέστε την υπερκείμενη οργανική φάση.πάρτε 50 μl της υδατικής φάσης του υποστρώματος για ανάλυση.

1. 9.Διαδικασία ανάλυσης

9.1Σημείωση πριν από τον προσδιορισμό

9.1.1 Βεβαιωθείτε ότι όλα τα αντιδραστήρια και τα μικροπηγάδια βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20-25℃).

9.1.2 Επιστρέψτε όλα τα υπόλοιπα αντιδραστήρια στους 2-8℃ αμέσως μετά τη χρήση.

9.1.3 Το σωστό πλύσιμο των μικροβυθισμάτων είναι ένα σημαντικό βήμα στη διαδικασία της ανάλυσης.είναι ο ζωτικός παράγοντας για την αναπαραγωγιμότητα της ανάλυσης ELISA.

9.1.4 Αποφύγετε το φως και καλύψτε τα μικροπηγάδια κατά την επώαση.

9.2 Βήματα ανάλυσης

9.2.1 Αφαιρέστε όλα τα αντιδραστήρια σε θερμοκρασία δωματίου (20-25℃) για περισσότερο από 30 λεπτά, ομογενοποιήστε πριν τη χρήση.

9.2.2 Βγάλτε τα μικροβυθίσματα που χρειάζονται και επιστρέψτε τα υπόλοιπα στη σακούλα με φερμουάρ στους 2-8℃ αμέσως.

9.2.3 Το συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης και το συμπυκνωμένο διάλυμα εκχύλισης θα πρέπει να ζεσταθούν ξανά για να είναι σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση.

9.2.4Αριθμός:Οι αριθμημένες θέσεις κάθε μικροβυθίσματος και όλα τα πρότυπα και τα δείγματα θα πρέπει να εκτελούνται εις διπλούν.Καταγράψτε τα πρότυπα και τις θέσεις των δειγμάτων.

9.2.5Αραίωση συμπυκνωμένου διαλύματος αντισωμάτων: αραιώστε το συμπυκνωμένο διάλυμα ενζύμου με αραιωτικά συζυγούς ενζύμου σε αναλογία όγκου 1:10 (1 φορές πυκνό διάλυμα ενζύμου: 10 φορές αραιωτικά συζυγούς ενζύμου).

9.2.6Προσθέστε πρότυπο διάλυμα / δείγμα και διάλυμα συζυγούς ενζύμου: προσθέστε 50µl τυπικού διαλύματος ή παρασκευασμένου δείγματος σε αντίστοιχα φρεάτια, προσθέστε 50μl ενζυμικού συζυγούς διαλύματος.Ανακατεύουμε απαλά ανακινώντας το πιάτο με το χέρι και επωάζουμε για 30 λεπτά στους 25℃ με κάλυμμα.

9.2.7Πλύση: Αφαιρέστε απαλά το κάλυμμα και ρίξτε το υγρό από τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε τα μικροπηγάδια με 250μl αραιωμένου διαλύματος πλύσης (λύση6) σε διάστημα 10 δευτερολέπτων για 4-5 φορές.Απορροφήστε το υπόλοιπο νερό με απορροφητικό χαρτί (η υπόλοιπη φυσαλίδα αέρα μπορεί να εξαλειφθεί με αχρησιμοποίητο άκρο).

9.2.8Χρωματισμός: Προσθέστε 50 μl διαλύματος υποστρώματος Α και 50 μl διαλύματος υποστρώματος Β σε κάθε φρεάτιο.Ανακατέψτε απαλά κουνώντας το πιάτο με το χέρι και επωάστε για 15 λεπτά στους 25℃ με κάλυμμα (βλ. 12.8).

9.2.11Μετρήσει: Προσθέστε 50µl διαλύματος τερματισμού σε κάθε φρεάτιο.Ανακατέψτε απαλά κουνώντας την πλάκα χειροκίνητα και μετρήστε την απορρόφηση στα 450 nm (Προτεινόταν μέτρηση με το διπλό μήκος κύματος 450/630 nm. Διαβάστε το αποτέλεσμα εντός 5 λεπτών μετά την προσθήκη του διαλύματος διακοπής. )

10 Αποτελέσματα

10.1Ποσοστό απορρόφησης

Οι μέσες τιμές των τιμών απορρόφησης που λαμβάνονται για τα πρότυπα και τα δείγματα διαιρούνται με την τιμή απορρόφησης του πρώτου προτύπου (μηδενικό πρότυπο) και πολλαπλασιάζονται επί 100%.Το μηδενικό πρότυπο γίνεται έτσι ίσο με 100% και οι τιμές απορρόφησης αναφέρονται σε ποσοστά.

=

Β ——πρότυπο απορρόφησης (ή δείγμα)

B0 ——πρότυπο μηδενικής απορρόφησης

10.2Τυπική καμπύλη

----Για να σχεδιάσετε μια τυπική καμπύλη: Πάρτε την τιμή απορρόφησης των προτύπων ως άξονα y, ημιλογαριθμική της συγκέντρωσης του προτύπου διαλύματος AOZ (ppb) ως άξονα x.

----Η συγκέντρωση AOZ κάθε δείγματος (ppb), η οποία μπορεί να διαβαστεί από την καμπύλη βαθμονόμησης, πολλαπλασιάζεται με τον αντίστοιχο συντελεστή αραίωσης κάθε δείγματος που ακολουθείται και προκύπτει η πραγματική συγκέντρωση του δείγματος.

Παρακαλώ σημειώστε:

Έχει αναπτυχθεί ειδικό λογισμικό για τη μείωση όλων των δεδομένων, το οποίο μπορεί να παρασχεθεί κατόπιν αιτήματος.

Συντελεστής αραίωσης…………………………………………………2

10.Ευαισθησία, ακρίβεια και ακρίβεια

Ευαισθησία: 0,025 ppb

Οριο ανίχνευσης:

Ιστός (μύες, ήπαρ)……………………………0,1 ppb

Μέλι------------------------------------------------- -0,1ppb

Ακρίβεια:

Ζωικός ιστός (μύες και ήπαρ)…………………100±20%

Αγάπη μου………………………………………………. 100±20%

Ακρίβεια:Το βιογραφικό του κιτ ELISA είναι μικρότερο από 10%.

11.Ειδοποίηση

12.1 Οι μέσες τιμές των τιμών απορρόφησης που λαμβάνονται για τα πρότυπα και τα δείγματα θα μειωθούν εάν τα αντιδραστήρια και τα δείγματα δεν έχουν ρυθμιστεί σε θερμοκρασία δωματίου (20-25℃).

12.2 Μην αφήνετε τα μικροπηγάδια να στεγνώσουν μεταξύ των βημάτων για να αποφύγετε την ανεπιτυχή αναπαραγωγιμότητα και λειτουργήστε το επόμενο βήμα αμέσως μετά το χτύπημα της θήκης των μικροϋποδοχών.

12.3 Ανακινήστε απαλά κάθε αντιδραστήριο πριν από τη χρήση.

12.4 Κρατήστε το δέρμα σας μακριά από το διάλυμα στοπ γιατί είναι το 0,5MH₂SO₄λύση.

12.5 Μη χρησιμοποιείτε τα κιτ ξεπερασμένα.Μην ανταλλάξετε τα αντιδραστήρια διαφορετικών παρτίδων, διαφορετικά θα μειωθεί η ευαισθησία.

12.6 Συνθήκη αποθήκευσης: Διατηρήστε τα κιτ ELISA στους 2-8℃, μην παγώσετε.Σφραγίστε τις πλάκες μικροβυθισμάτων υποδοχών, Αποφύγετε το άμεσο ηλιακό φως κατά τη διάρκεια όλων των επωάσεων.Συνιστάται η κάλυψη των πλακών μικροτιτλοδότησης.

12.7 Το διάλυμα υποστρώματος θα πρέπει να εγκαταλειφθεί εάν πάρει χρώμα.Τα αντιδραστήρια μπορεί να αλλοιωθούν εάν η τιμή απορρόφησης (450/630 nm) του μηδενικού προτύπου είναι μικρότερη από 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Η αντίδραση χρωματισμού χρειάζεται 15 λεπτά μετά την προσθήκη του διαλύματος υποστρώματος.Μπορείτε να παρατείνετε τον χρόνο επώασης σε 20 λεπτά ή περισσότερο εάν το χρώμα είναι πολύ ανοιχτό για να προσδιοριστεί., μην υπερβαίνετε ποτέ τα 25 λεπτά. Αντίθετα, συντομεύστε σωστά τον χρόνο επώασης.

12.9 Η βέλτιστη θερμοκρασία αντίδρασης είναι 25℃.Υψηλότερη ή χαμηλότερη θερμοκρασία θα οδηγήσει σε αλλαγές στην ευαισθησία και τις τιμές απορρόφησης.

12.Κατάσταση αποθήκευσης και περίοδος αποθήκευσης

Κατάσταση αποθήκευσης: 2-8℃.

Χρόνος αποθήκευσης: 12 μήνες.