Konkurentsivõimeline ensüümi immuunanalüüsi komplekt furazolidooni metaboliidi (AOZ) kvantitatiivseks analüüsiks
Konkurentsivõimeline ensüümi immuunanalüüsi komplekt
Kvantitatiivne analüüsFurasolidooni metaboliit(AOZ)
- 1.Taust
Nitrofuraanid on sünteetilised laia toimespektriga antibiootikumid, mida nende suurepäraste antibakteriaalsete ja farmakokineetiliste omaduste tõttu kasutatakse sageli loomakasvatuses.Neid kasutati ka kasvustimulaatoritena sea-, linnu- ja veekasvatuses.Pikaajalised uuringud laboriloomadega näitasid, et lähteravimitel ja nende metaboliitidel on kantserogeensed ja mutageensed omadused.See on viinud nitrofuraanide keelustamiseni toidu tootmiseks kasutatavate loomade raviks.Nitrofuraanravimite furaltadooni, nitrofurantoiini ja nitrofurasooni kasutamine toiduloomade tootmises keelati EL-is 1993. aastal ning furasolidooni kasutamine keelustati 1995. aastal.
Nitrofuraani ravimite jääkide analüüs peab põhinema nitrofuraani lähteravimite kudedega seotud metaboliitide tuvastamisel.Kuna lähteravimid metaboliseeruvad väga kiiresti ja kudedega seotud nitrofuraani metaboliidid säilivad pikka aega, kasutatakse neid metaboliite sihtmärgina nitrofuraanide kuritarvitamise tuvastamisel, sealhulgas furazolidooni metaboliit (AOZ), furaltadooni metaboliit (AMOZ). ), nitrofurantoiini metaboliit (AHD) ja nitrofurasooni metaboliit (SEM).
AOZ-jäägid määratakse kõige sagedamini LC-MS või LC-MS/MS abil.Ensüüm-immunoanalüüsid näitavad kromatograafiliste meetoditega võrreldes märkimisväärseid eeliseid tundlikkuse, avastamispiiri, tehniliste seadmete ja ajanõude osas.(Ajakulu: 45 min)
- 2.Testi põhimõte
See ELISA komplekt on loodud AOZ tuvastamiseks kaudse-konkureeriva ensüümi immuunanalüüsi põhimõttel.Mikrotiitri süvendid on kaetud püüdmis-BSA-seotud antigeeniga.Proovis sisalduv AOZ konkureerib lisatud antikeha pärast mikrotiiterplaadile kaetud antigeeniga.Pärast ensüümi konjugaadi lisamist kasutatakse kromogeenset substraati ja signaali mõõdetakse spektrofotomeetriga.Absorptsioon on pöördvõrdeline AOZ kontsentratsiooniga proovis.
- 3.Rakendused
Seda komplekti saab kasutada AOZ-i jääkide kvantitatiivseks ja kvalitatiivseks analüüsiksanima kuded(lihased, maks jne), kallis.
- 4.Ristreaktsioonid
Furasolidooni metaboliit (AOZ)………………………..100%
Furaltadooni metaboliit (AMOZ)………………………<0,1%
Nitrofurantoiini metaboliit (AHD)……………………<0,1%
Nitrofurasooni metaboliit (SEM)…………………………<0,1%
Furasolidoon……………………………………….…..…16,3%
Furaltadoon………………………………………………..<1%
Nitrofurantoiin…………………………………….…….…<1%
Nitrofurasoon……………………………………………..<1%
- 5.Vajalikud materjalid
5.1Varustus
----Mikrotiiterplaadi spektrofotomeeter (450nm/630nm)
----Rotatsioonaurusti või lämmastikukuivatusinstrumendid
----Homogenisaator /maohaige
----Saiker
----Vortex segisti
---- Tsentrifuug
----Analüütiline kaal (induktiivsus: 0,01g)
---- Gradueeritud pipett: 10ml
----Pipeti kummist pirn
----Mõõtekolb: 100ml
----Klaaskolb: 10ml
----Polüstüreenist tsentrifuugitoru: 2ml, 50ml
----Mikropipetid: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250 ul-multipipetti
5.2Reaktiivid
---- etüülatsetaat (AR)
----n-heksaan (või n-heptaan) (AR)
----Dikaaliumvesinikfosfaattrihüdraat
(K2HPO4.3H2O) (AR)
---- Kontsentreeritud vesinikkloriidhape (HCl, AR)
----- Metanool
---- Naatriumhüdroksiid (NaOH, AR)
----Deioniseeritud vesi
- 6.Komplekti komponendid
l Antigeeniga kaetud mikrotiiterplaat, 96 süvendiga
l Standardlahused (6 pudelit, 1 ml/pudel)
0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb
l Standardne lisamiskontroll: (1ml/pudel)....100 ppb
l Kontsentreeritud ensüümi konjugaat 1ml.........punane kork
l Ensüümkonjugaadi lahjendid 10ml………..roheline kork
l Substraat A 7 ml……………………………..valge kork
l Substraat B 7ml………………………………..punane kork
l Stop-lahus 7 ml………………………………kollane kork
l 20× kontsentreeritud pesulahus 40ml
…………………………………….……läbipaistev kork
l 2×kontsentreeritud ekstraktsioonilahus 60ml….sinine kork
l 2-nitrobensaldehüüd 15,1 mg………………………………………………………………
- 7.Reaktiivide ettevalmistamine
Lahendus 1: derivaatreaktiiv:
Lisage 2-nitrobensaldehüüdi sisaldavasse pudelisse 10 ml metanooli ja lahustage.(kontsentratsioonil 10 mM).
Lahendus 2: 0,1 MK2HPO4lahendus:
Kaal 22,8 g K2HPO4.3H2O kuni 1 l deioniseeritud vett lahustamiseks.
Lahendus 3: 1 M HCl lahus
Lahustage 8,3 ml kontsentreeritud vesinikkloriidhapet deioniseeritud veega 100 ml-ni.
Lahendus 4:1 M NaOH lahus
Lahustage 4 g NaOH 100 ml deioniseeritud vees.
Lahendus 5: ekstraheerimislahus:
Lahjendage 2x kontsentreeritud ekstraktsioonilahus deioniseeritud veega mahusuhtes 1:1.Seda lahust saab säilitada 1 kuu temperatuuril 4 ℃, mida kasutatakse proovide ekstraheerimiseks.
Lahendus 6: pesulahus:
Lahjendage 20 × kontsentreeritud pesulahus deioniseeritud veega mahusuhtes 1:19, mida kasutatakse plaatide pesemiseks.Seda lahjendatud lahust võib säilitada 1 kuu temperatuuril 4 ℃.
- 8.Näidiste ettevalmistused
8.1Märkus ja ettevaatusabinõud enne kasutamist:
a) Kasutage katses ühekordseid otsikuid ja muutke otsikuid erinevate reaktiivide neelamisel.
b) Veenduge, et kõik katseinstrumendid oleksid puhtad.
c) derivaatreaktiivi saab säilitada temperatuuril 2–8 ℃ kolm kuud;
d) HCl lahust võib toatemperatuuril säilitada 3 kuud;
e) NaOH lahust võib toatemperatuuril säilitada 3 kuud;
f) hoidke töötlemata proove sügavkülmas (-20 ℃);
g) Töödeldud proove saab säilitada 24 tundi pimedas temperatuuril 2–8 ℃.
8.2 Loomkoe- ja maksaproovid:
----Homogeniseerige proovid homogenisaatoriga;
---- Kaal 1,0±0,05 g homogeniseeritud koeproovi 50 ml polüstüreenist tsentrifuugitorusse.Lisage 4 ml deioniseeritud vett, 0,5 ml 1 M HCl lahust ja 100 ul derivaatreaktiivi (vt lahus 1).Loksutage seda 2 minutit.
---- Inkubeerida temperatuuril 37 ℃ üle öö (umbes 16 tundi);
---- Lisa 5ml 0,1MK2HPO4 (lahendus2), 0,4 ml 1 M NaOH (lahendus4) ja 5 ml etüülatsetaati.Raputage tugevalt 30 sekundit;
---- Tsentrifuugige toatemperatuuril (20-25 ℃) 10 min, vähemalt 3000 g;
---- Võtke 2,5 ml supernatanti orgaanilist faasi 10 ml puhtasse klaastorusse, kuivatage gaasilise lämmastikuga temperatuuril 50–60 ℃ või pöördaurustiga;
---- Lahustage kuiv jääk 1 ml n-heksaanis (või n-heptaanis), loksutage 30 sekundit keerisega, lisage 1 ml ekstraheerimislahust (lahendus5), segage keerisega 1 min, segage täielikult.
---- Tsentrifuugige toatemperatuuril (20-25oC) 5 min, vähemalt 3000g;
---- Eemaldage supernatant orgaaniline faas;võtke testimiseks 50 μl substraadi veefaasi.
8.4 Kallis
----kaala 1,0±0,05 g homogeniseeritud meeproovi 50 ml polüstüreenist tsentrifuugitorusse;
---- Lisage 4 ml deioniseeritud vett, 0,5 ml 1 M HCl (lahendus3) ja 100 μl derivaatreaktiivi (lahendus1);loksutage täielikult 2 minutit;
---- Inkubeerida temperatuuril 37 ℃ üle öö (umbes 16 tundi);
----Lisa 5ml 0,1MK2HPO4 (lahendus2), 0,4 ml 1 M NaOH (lahendus4) ja 5 ml etüülatsetaati, loksutage tugevalt 30 sekundit;
----Tsentrifuugige toatemperatuuril (20-25 ℃) 10 min, vähemalt 3000g;
---- Võtke 2,5 ml supernatanti orgaanilist faasi 10 ml puhtasse klaastorusse, kuivatage gaasilise lämmastikuga temperatuuril 50–60 ℃ või pöördaurustiga;
---- Lahustage kuiv jääk 1 ml n-heksaanis (või n-heptaanis), loksutage 30 sekundit keerisega, lisage 1 ml ekstraheerimislahust (lahendus5), segage keerisega 1 min, segage täielikult.
----Tsentrifuugige toatemperatuuril (20-25oC) 10 min, vähemalt 3000g;
----Eemaldage supernatant orgaaniline faas;võtke testimiseks 50 μl substraadi veefaasi.
- 9.Analüüsi protsess
9.1Märkus enne analüüsi
9.1.1 Veenduge, et kõik reaktiivid ja mikrosüvendid oleksid toatemperatuuril (20-25 ℃).
9.1.2 Viige kõik ülejäänud reaktiivid kohe pärast kasutamist tagasi temperatuurini 2–8 ℃.
9.1.3 Mikrosüvendite õige pesemine on analüüsiprotsessi oluline etapp;see on ELISA analüüsi reprodutseeritavuse oluline tegur.
9.1.4 Vältige valgust ja katke mikrosüvendid inkubeerimise ajal.
9.2 Testi etapid
9.2.1 Võtke kõik reaktiivid välja toatemperatuuril (20-25 ℃) kauemaks kui 30 minutiks, homogeniseerige enne kasutamist.
9.2.2 Võtke vajalikud mikrosüvendid välja ja pange ülejäänud kohe tagasi lukuga kotti temperatuuril 2–8 ℃.
9.2.3 Kontsentreeritud pesulahust ja kontsentreeritud ekstraktsioonilahust tuleb enne kasutamist soojendada toatemperatuurini.
9.2.4Number:Nummerdatud iga mikrosüvendi positsioonid ning kõik standardid ja proovid tuleks käitada kahes eksemplaris.Salvestage standardid ja näidiste asukohad.
9.2.5Kontsentreeritud antikehalahuse lahjendamine: lahjendage kontsentreeritud ensüümilahust ensüümi konjugaadi lahjenditega mahusuhtes 1:10 (1-kordne kontsentreeritud ensüümilahus: 10-kordne ensüümi konjugaadi lahjendus).
9.2.6Lisage standardlahus/proov ja ensüümi konjugaadi lahus: lisage vastavatesse süvenditesse 50 µl standardlahust või ettevalmistatud proovi, lisage 50 µl ensüümi konjugaadi lahust.Segage õrnalt plaati käsitsi loksutades ja inkubeerige kaanega 30 minutit temperatuuril 25 ℃.
9.2.7Pesta: Eemaldage õrnalt kate ja valage vedelik süvenditest välja ning loputage mikrosüvendeid 250 µl lahjendatud pesulahusega (lahendus6) intervalliga 10s 4-5 korda.Absorbeerige jääkvesi imava paberiga (ülejäänud õhumulli saab eemaldada kasutamata otsikuga).
9.2.8Värvimine: Lisage igasse süvendisse 50 µl substraadi lahust A ja 50 ul substraadi lahust B.Segage õrnalt, raputades plaati käsitsi, ja inkubeerige kaanega 15 minutit temperatuuril 25 ℃ (vt 12.8).
9.2.11Mõõtke: Lisage igasse süvendisse 50 µl stopplahust.Segage õrnalt, raputades plaati käsitsi, ja mõõtke neelduvus lainepikkusel 450 nm (soovitati mõõta kahe lainepikkusega 450/630 nm. Lugege tulemust 5 minuti jooksul pärast stopplahuse lisamist.)
10 Tulemused
10.1Neeldumise protsent
Standardite ja proovide jaoks saadud neeldumisväärtuste keskmised väärtused jagatakse esimese standardi (nullstandardi) neeldumisväärtusega ja korrutatakse 100%.Seega muudetakse nullstandardiks 100% ja neeldumisväärtused on esitatud protsentides.
=
B — neeldumisstandard (või proov)
B0 — — neeldumise nullstandard
10.2Standardkõver
----Standardkõvera joonistamiseks: võtke y-teljeks standardite neeldumisväärtus, x-teljeks AOZ standardlahuse kontsentratsiooni poollogaritmiline väärtus (ppb).
----Iga proovi AOZ-i kontsentratsioon (ppb), mida saab lugeda kalibreerimiskõveralt, korrutatakse iga jälgitava proovi vastava lahjendusteguriga ja saadakse proovi tegelik kontsentratsioon.
Palun pane tähele:
Kõigi andmete vähendamise jaoks on välja töötatud spetsiaalne tarkvara, mida saab nõudmisel pakkuda.
Lahjendustegur……………………………………………..……2
10.Tundlikkus, täpsus ja täpsus
Tundlikkus: 0,025 ppb
Tuvastamispiir:
Kude (lihas, maks)………………………… 0,1 ppb
Kallis------------------------------------------------- -0,1 ppb
Täpsus:
Loomkude (lihas ja maks)…………………100±20%
Mesi………………………………………………….. 100±20%
Täpsus:ELISA komplekti CV on alla 10%.
11.Märka
12.1 Standardite ja proovide jaoks saadud neeldumisväärtuste keskmisi väärtusi vähendatakse, kui reaktiive ja proove ei ole reguleeritud toatemperatuurile (20-25 ℃).
12.2 Ärge laske mikrosüvenditel etappide vahel kuivada, et vältida ebaõnnestunud reprodutseeritavust, ja kasutage järgmist sammu kohe pärast mikrosüvendi hoidiku koputamist.
12.3 Enne kasutamist loksutage iga reaktiivi õrnalt.
12.4 Hoidke oma nahk stopplahusest eemal, sest see on 0,5MH2SO4lahendus.
12.5 Ärge kasutage aegunud komplekte.Ärge vahetage erinevate partiide reaktiive, vastasel juhul väheneb tundlikkus.
12.6 Säilitamistingimused: hoida ELISA komplekte temperatuuril 2–8 ℃, mitte külmutada.Sulgege ülejäänud mikrosüvendiplaadid. Vältige otsest päikesevalgust kõigi inkubatsioonide ajal.Mikrotiiterplaadid on soovitatav katta.
12.7 Aluspinna lahusest tuleb loobuda, kui see värvub.Reaktiivid võivad rikneda, kui nullstandardi neeldumisväärtus (450/630 nm) on väiksem kui 0,5 (A450 nm<0,5).
12.8 Värvimisreaktsioon vajab 15 min pärast substraadilahuse lisamist;Kui värvus on määramiseks liiga hele, võite inkubatsiooniaega pikendada 20 minutini või kauemaks. Ärge kunagi ületage 25 minutit. Vastupidi, lühendage inkubatsiooniaega korralikult.
12.9 Optimaalne reaktsioonitemperatuur on 25 ℃.Kõrgem või madalam temperatuur põhjustab tundlikkuse ja neeldumise väärtuste muutusi.
12.Säilitusseisund ja säilitusaeg
Säilitustingimused: 2-8℃.
Säilitamisaeg: 12 kuud.
