تولید - محصول

1. 1.زمینه

نیتروفوران ها آنتی بیوتیک های مصنوعی وسیع الطیف هستند که به دلیل خواص عالی ضد باکتریایی و فارماکوکینتیکی خود اغلب در تولیدات حیوانی استفاده می شوند.آنها همچنین به عنوان محرک رشد در تولید خوک، طیور و آبزیان استفاده شده بودند.در مطالعات طولانی مدت با حیوانات آزمایشگاهی مشخص شد که داروهای مادر و متابولیت های آنها ویژگی های سرطان زایی و جهش زایی را نشان می دهند.این منجر به ممنوعیت نیتروفوران ها برای درمان حیوانات مورد استفاده برای تولید غذا شده است.داروهای نیتروفوران فوراالتادون، نیتروفورانتوئین و نیتروفورازون در سال 1993 در اتحادیه اروپا استفاده در تولید حیوانات غذایی ممنوع شد و استفاده از فورازولیدون در سال 1995 ممنوع شد.

تجزیه و تحلیل بقایای داروهای نیتروفوران باید بر اساس تشخیص متابولیت های متصل به بافت داروهای اصلی نیتروفوران باشد.از آنجایی که داروهای اصلی بسیار سریع متابولیزه می شوند و متابولیت های نیتروفوران متصل به بافت برای مدت طولانی باقی می مانند، این متابولیت ها به عنوان هدف در تشخیص سوء مصرف نیتروفوران ها استفاده می شوند که شامل متابولیت Furazolidone (AOZ)، متابولیت Furaltadone (AMOZ) می شود. متابولیت نیتروفورانتوئین (AHD) و متابولیت نیتروفورازون (SEM).

باقی مانده های AOZ معمولاً توسط LC-MS یا LC-MS/MS تعیین می شوند.ایمونواسی آنزیمی، در مقایسه با روش‌های کروماتوگرافی، مزایای قابل‌توجهی را از نظر حساسیت، محدودیت تشخیص، تجهیزات فنی و زمان مورد نیاز نشان می‌دهد.(هزینه زمان: 45 دقیقه)

1. 2.اصل تست

این کیت ELISA برای تشخیص AOZ بر اساس اصل ایمونواسی آنزیمی رقابتی غیرمستقیم طراحی شده است.چاه های میکروتیتر با آنتی ژن متصل به BSA پوشانده شده اند.AOZ در نمونه با آنتی ژن پوشانده شده روی صفحه میکروتیتر برای آنتی بادی اضافه شده رقابت می کند.پس از افزودن آنزیم مزدوج، از بستر کروموژنیک استفاده می شود و سیگنال توسط اسپکتروفتومتر اندازه گیری می شود.جذب با غلظت AOZ در نمونه نسبت معکوس دارد.

1. 3.برنامه های کاربردی

این کیت را می توان در تجزیه و تحلیل کمی و کیفی باقیمانده AOZ دربافت های آنیما(عضله، کبد و غیره)، عسل.

1. 4.واکنش های متقاطع

متابولیت فورازولیدون (AOZ)…………………………..100%

متابولیت فوراتادون (AMOZ)…………………<۰.۱٪

متابولیت نیتروفورانتوئین (AHD)…………………<0.1%

متابولیت نیتروفورازون (SEM)……………………<0.1%

فورازولیدون………………………………………….. 16.3%

فورالتادون……………………………………………<1%

نیتروفورانتوئین……………………………………………<۱%

نیتروفورازون……………………………………………<1%

1. 5.مواد مورد نیاز

5.1تجهیزات

---- اسپکتروفتومتر صفحه میکروتیتر (450nm/630nm)

---- اواپراتور روتاری یا ابزار خشک کن نیتروژن

---- هموژنایزر / معده

---- تکان دهنده

---- میکسر گرداب

----سانتریفیوژ

---- تعادل تحلیلی (القایی: 0.01 گرم)

---- پیپت مدرج: 10 میلی لیتر

----لامپ پیپت لاستیکی

---- فلاسک حجمی: 100 میلی لیتر

---- فلاسک شیشه ای: 10 میلی لیتر

----لوله سانتریفیوژ پلی استایرن: 2 میلی لیتر، 50 میلی لیتر

---- میکروپیپت ها: 20ul-200ul، 100ul-1000ul،

250ul-multipipette

5.2معرف ها

----اتیل استات (AR)

----n-هگزان (یا n-هپتان) (AR)

----دی پتاسیم هیدروژن فسفات تری هیدرات

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----اسید هیدروکلریک غلیظ (HCl، AR)

----- متانول

---- هیدروکسید سدیم (NaOH، AR)

----آب دی یونیزه

1. 6.اجزای کیت

l پلیت میکروتیتر پوشش داده شده با آنتی ژن، 96 چاهک

l محلول استاندارد (6 بطری، 1 میلی لیتر / بطری)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l کنترل استاندارد اسپکینگ: (1 میلی لیتر/بطری)........100ppb

l کنژوگه آنزیمی غلیظ 1 میلی لیتر......... کلاهک قرمز

l رقیق کننده های مزدوج آنزیمی 10 میلی لیتر……….. کلاهک سبز

l سوبسترا A 7ml……………………………... کلاهک سفید

l سوبسترا B 7 میلی لیتر……………………………….. کلاه قرمز

l محلول قطع 7 میلی لیتر………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

l 20×محلول شستشو غلیظ 40ml

………………………………………………درپوش شفاف

l 2×محلول استخراج غلیظ 60 میلی لیتر….درپوش آبی

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg…………………کلاه سفید

1. 7.آماده سازی معرف ها

راه حل 1: معرف مشتق:

10 میلی لیتر متانول را به بطری حاوی 2-نیتروبنزالدئید اضافه کنید و حل کنید.(در غلظت 10 میلی مولار).

راه حل 2: 0.1MK₂HPO₄راه حل:

وزن 22.8 گرم K₂HPO₄.3H₂O تا 1 لیتر آب دیونیزه حل شود.

راه حل 3: محلول HCl 1M

8.3 میلی لیتر اسید هیدروکلریک غلیظ را حل کنید با آب دیونیزه تا 100 میلی لیتر.

راه حل 4:محلول 1 مولار NaOH

4 گرم NaOH را با 100 میلی لیتر آب دیونیزه حل کنید.

راه حل 5: محلول استخراج:

2× محلول استخراج غلیظ را با آب دیونیزه به نسبت حجمی 1:1 رقیق کنید.این محلول را می توان به مدت 1 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد که برای نمونه های استخراج شده استفاده می شود.

راه حل 6: محلول شستشو:

محلول شستشوی غلیظ 20× را با آب دیونیزه در نسبت حجمی 1:19 رقیق کنید که برای شستشوی صفحات استفاده می شود.این محلول رقیق شده را می توان به مدت 1 ماه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد.

1. 8.آماده سازی نمونه

8.1توجه و اقدامات احتیاطی قبل از عمل:

الف) لطفاً از نکات یکباره در آزمایش استفاده کنید و هنگام جذب معرف های مختلف، نکات را تغییر دهید.

ب) مطمئن شوید که تمام ابزارهای آزمایشی تمیز هستند.

ج) معرف مشتق را می توان در دمای 2-8 درجه سانتیگراد به مدت سه ماه حفظ کرد.

د) محلول HCl را می توان به مدت 3 ماه در دمای اتاق نگهداری کرد.

ه) محلول NaOH را می توان به مدت 3 ماه در دمای اتاق حفظ کرد.

و) نمونه های تیمار نشده را در انجماد (20- درجه سانتیگراد) نگهداری کنید.

g) نمونه های تیمار شده را می توان به مدت 24 ساعت در دمای 2-8 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری کرد.

8.2 نمونه های بافت حیوانی و کبد:

---- نمونه ها را با هموژنایزر همگن کنید.

---- وزن 1.0±0.05 گرم از نمونه بافت همگن شده در لوله سانتریفیوژ پلی استایرن 50 میلی لیتری.4 میلی لیتر آب دیونیزه، 0.5 میلی لیتر محلول 1M HCl و معرف مشتق 100 لیتر اضافه کنید (به محلول 1 مراجعه کنید).آن را به مدت 2 دقیقه تکان دهید.

---- در دمای 37 درجه یک شب (حدود 16 ساعت) جوجه کشی کنید.

---- 5 میلی لیتر 0.1MK اضافه کنید₂HPO₄ (راه حل2)، 0.4 میلی لیتر NaOH 1M (راه حل4) و 5 میلی لیتر اتیل استات.به مدت 30 ثانیه به شدت تکان دهید.

---- در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) به مدت 10 دقیقه، حداقل 3000 گرم سانتریفیوژ کنید.

---- 2.5 میلی لیتر از فاز آلی رویی را در یک لوله شیشه ای تمیز 10 میلی لیتری، با گاز نیتروژن 50-60 درجه سانتیگراد یا اواپراتور چرخشی خشک کنید.

---- باقی مانده خشک را با 1 میلی لیتر هگزان (یا n- هپتان) حل کنید، 30 ثانیه گرداب کنید، 1 میلی لیتر محلول استخراج اضافه کنید.راه حل5) ورتکس 1 دقیقه، کاملا مخلوط کنید.

---- در دمای اتاق (20-25) سانتریفیوژ کنید^oج) به مدت 5 دقیقه، حداقل 3000 گرم؛

---- فاز آلی رویی را بردارید.50 میکرولیتر از فاز آب زیرلایه را برای سنجش مصرف کنید.

8.4 عزیزم

---- 1.0±0.05 گرم از نمونه عسل همگن شده را در یک لوله سانتریفیوژ پلی استایرن 50 میلی لیتری وزن کنید.

----4 میلی لیتر آب یونیزه شده، 0.5 میلی لیتر HCl 1M اضافه کنید.راه حل3) و معرف مشتق 100μl (راه حل1)؛به مدت 2 دقیقه کاملا تکان دهید.

---- در دمای 37 درجه یک شب (حدود 16 ساعت) جوجه کشی کنید.

----5ml 0.1MK اضافه کنید₂HPO₄ (راه حل2)، 0.4 میلی لیتر NaOH 1M (راه حل4) و 5 میلی لیتر اتیل استات، به مدت 30 ثانیه به شدت تکان دهید.

---- در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) به مدت 10 دقیقه، حداقل 3000 گرم سانتریفیوژ کنید.

---- 2.5 میلی لیتر از فاز آلی رویی را در یک لوله شیشه ای تمیز 10 میلی لیتری، با گاز نیتروژن 50-60 درجه سانتیگراد یا اواپراتور چرخشی خشک کنید.

---- باقیمانده خشک را با 1 میلی لیتر هگزان n- (یا n- هپتان) حل کنید، 30 ثانیه گرداب کنید، 1 میلی لیتر محلول استخراج اضافه کنید.راه حل5) ورتکس 1 دقیقه، کاملا مخلوط کنید.

---- در دمای اتاق (20-25) سانتریفیوژ کنید^oج) برای 10 دقیقه، حداقل 3000 گرم؛

---- فاز آلی رویی را حذف کنید.50 میکرولیتر از فاز آب زیرلایه را برای سنجش مصرف کنید.

1. 9.فرآیند سنجش

9.1قبل از سنجش توجه کنید

9.1.1 مطمئن شوید که همه معرف ها و ریز چاه ها در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) هستند.

9.1.2 تمام معرف های باقی مانده را بلافاصله پس از استفاده به 2-8 درجه سانتیگراد برگردانید.

9.1.3 شستن صحیح ریز چاه ها مرحله مهمی در فرآیند سنجش است.این عامل حیاتی برای تکرارپذیری آنالیز ELISA است.

9.1.4 از نور دوری کنید و در طول انکوباسیون ریز چاه ها را بپوشانید.

9.2 مراحل سنجش

9.2.1 همه معرف ها را در دمای اتاق (20-25 درجه سانتیگراد) برای بیش از 30 دقیقه خارج کنید، قبل از استفاده همگن کنید.

9.2.2 ریز چاه های مورد نیاز را خارج کنید و بقیه را فوراً در کیسه زیپ لاک در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد برگردانید.

9.2.3 محلول شستشوی غلیظ و محلول استخراج غلیظ باید قبل از استفاده مجدداً گرم شود تا در دمای اتاق باشد.

9.2.4عدد:هر موقعیت ریز چاه شماره گذاری شده و همه استانداردها و نمونه ها باید به صورت تکراری اجرا شوند.استانداردها و موقعیت های نمونه را ثبت کنید.

9.2.5رقیق کردن محلول آنتی بادی غلیظ: محلول غلیظ آنزیمی را با رقیق کننده های مزدوج آنزیمی به نسبت حجمی 1:10 رقیق کنید (محلول آنزیمی غلیظ 1 برابر: رقیق کننده های مزدوج آنزیمی 10 برابر).

9.2.6محلول استاندارد / نمونه و محلول مزدوج آنزیمی را اضافه کنید: 50 میکرولیتر محلول استاندارد یا نمونه آماده شده را به چاهکهای مربوطه اضافه کنید، 50 میکرولیتر محلول مزدوج آنزیمی اضافه کنید.با تکان دادن دستی بشقاب را به آرامی مخلوط کنید و به مدت 30 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد با درپوش انکوبه کنید.

9.2.7شستشو: پوشش را به آرامی بردارید و مایع را از چاه ها بیرون بریزید و ریز چاه ها را با محلول شستشو رقیق شده 250 میکرولیتر بشویید.راه حل6) در فاصله 10 ثانیه برای 4-5 بار.آب باقیمانده را با کاغذ جاذب جذب کنید (با نوک استفاده نشده می توان بقیه حباب هوا را از بین برد).

9.2.8رنگ آمیزی: 50 میکرولیتر محلول بستر A و 50 میکرولیتر محلول بستر B را به هر چاهک اضافه کنید.با تکان دادن دستی بشقاب را به آرامی مخلوط کنید و به مدت 15 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد با درپوش انکوبه کنید (به 12.8 مراجعه کنید).

9.2.11اندازه گرفتن: 50µl محلول توقف را به هر چاهک اضافه کنید.با تکان دادن دستی صفحه را به آرامی مخلوط کنید و میزان جذب را در 450 نانومتر اندازه گیری کنید (پیشنهاد شده است با طول موج دوگانه 450/630 نانومتر اندازه گیری کنید. نتیجه را در عرض 5 دقیقه پس از افزودن محلول توقف مطالعه کنید.)

10 نتایج

10.1درصد جذب

مقادیر میانگین مقادیر جذب به دست آمده برای استانداردها و نمونه ها بر مقدار جذب استاندارد اول (استاندارد صفر) تقسیم شده و در 100% ضرب می شود.بنابراین استاندارد صفر برابر با 100% ساخته شده و مقادیر جذب به صورت درصد ذکر شده است.

=

ب - استاندارد جذب (یا نمونه)

B0 ——استاندارد جذب صفر

10.2منحنی استاندارد

----برای رسم منحنی استاندارد: مقدار جذب استانداردها را به عنوان محور y، نیمه لگاریتمی غلظت محلول استاندارد AOZ (ppb) به عنوان محور x در نظر بگیرید.

---- غلظت AOZ هر نمونه (ppb) که از روی منحنی کالیبراسیون قابل خواندن است، در ضریب رقت مربوطه هر نمونه به دنبال آن ضرب می شود و غلظت واقعی نمونه بدست می آید.

لطفا توجه کنید:

نرم افزار ویژه ای برای کاهش کلیه داده ها ایجاد شده است که در صورت درخواست قابل ارائه می باشد.

فاکتور رقیق سازی………………………………………………2

10.حساسیت، دقت و دقت

حساسیت: 0.025ppb

حد تشخیص:

بافت (عضله، کبد)……………………………۰.۱ppb

عسل------------------------------------------------- -0.1ppb

دقت:

بافت حیوانی (عضله و کبد)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

عزیزم………………………………………………………. 100±20%

دقت، درستی:CV کیت ELISA کمتر از 10٪ است.

11.اطلاع

12.1 اگر معرف ها و نمونه ها در دمای اتاق (25-20 درجه سانتیگراد) تنظیم نشده باشند، میانگین مقادیر جذب به دست آمده برای استانداردها و نمونه ها کاهش می یابد.

12.2 برای جلوگیری از تکرار ناموفق، اجازه ندهید ریز چاه ها بین مراحل خشک شوند و مرحله بعدی را بلافاصله پس از ضربه زدن به نگهدارنده ریز چاه ها اجرا کنید.

12.3 هر معرف را قبل از استفاده به آرامی تکان دهید.

12.4 پوست خود را از محلول استاپ دور نگه دارید زیرا 0.5MH است₂SO₄راه حل.

12.5 از کیت های قدیمی استفاده نکنید.معرف های دسته های مختلف را تعویض نکنید وگرنه حساسیت را کاهش می دهد.

12.6 شرایط نگهداری: کیت های ELISA را در دمای 2-8 درجه سانتیگراد نگه دارید، یخ نزنید.مهر و موم کردن صفحات میکرو چاه استراحت، از نور مستقیم خورشید در طول تمام جوجه کشی اجتناب کنید.پوشاندن صفحات میکروتیتر توصیه می شود.

12.7 محلول بستر در صورت تغییر رنگ باید کنار گذاشته شود.اگر مقدار جذب (450/630 نانومتر) استاندارد صفر کمتر از 0.5 باشد (A450nm<0.5) ممکن است معرف ها خراب شوند.

12.8 واکنش رنگی 15 دقیقه پس از افزودن محلول بستر نیاز دارد.اگر رنگ برای تعیین رنگ خیلی روشن است، می توانید زمان جوجه کشی را تا 20 دقیقه یا بیشتر افزایش دهید، هرگز از 25 دقیقه تجاوز نکنید. برعکس، زمان انکوباسیون را به درستی کوتاه کنید.

12.9 دمای بهینه واکنش 25 درجه سانتیگراد است.دمای بالاتر یا پایین تر منجر به تغییر مقادیر حساسیت و جذب می شود.

12.شرایط نگهداری و مدت نگهداری

شرایط نگهداری: 2-8 ℃.

مدت زمان نگهداری: 12 ماه.