produit

1. 1.Arrière plan

Les nitrofuranes sont des antibiotiques synthétiques à large spectre, fréquemment utilisés en production animale pour leurs excellentes propriétés antibactériennes et pharmacocinétiques.Ils avaient également été utilisés comme promoteurs de croissance dans la production porcine, avicole et aquatique.Des études à long terme sur des animaux de laboratoire ont indiqué que les médicaments parents et leurs métabolites présentaient des caractéristiques cancérigènes et mutagènes.Cela a conduit à une interdiction des nitrofuranes pour le traitement des animaux utilisés pour la production alimentaire.Les médicaments à base de nitrofurane furaltadone, nitrofurantoïne et nitrofurazone ont été interdits d'utilisation dans la production d'animaux destinés à l'alimentation dans l'UE en 1993, et l'utilisation de la furazolidone a été interdite en 1995.

L'analyse des résidus de médicaments à base de nitrofurane doit être basée sur la détection des métabolites liés aux tissus des médicaments parents à base de nitrofurane.Étant donné que les médicaments parents sont très rapidement métabolisés et que les métabolites du nitrofurane liés aux tissus resteront longtemps en place, ces métabolites sont utilisés comme cible dans la détection de l'abus de nitrofuranes, qui comprennent le métabolite de la furazolidone (AOZ), le métabolite de la furaltadone (AMOZ ), le métabolite de la nitrofurantoïne (AHD) et le métabolite de la nitrofurazone (SEM).

Les résidus AOZ sont déterminés le plus souvent par LC-MS ou LC-MS/MS.Les immunoessais enzymatiques, par rapport aux méthodes chromatographiques, présentent des avantages considérables en termes de sensibilité, de limite de détection, d'équipement technique et d'exigence de temps.(Coût horaire : 45min)

1. 2.Principe d'essai

Ce kit ELISA est conçu pour détecter l'AOZ sur la base du principe du dosage immunoenzymatique en compétition indirecte.Les puits de microtitration sont recouverts d'antigène de capture lié à la BSA.L'AOZ dans l'échantillon entre en compétition avec l'antigène déposé sur la plaque de microtitration pour l'anticorps ajouté.Après l'ajout du conjugué enzymatique, un substrat chromogénique est utilisé et le signal est mesuré par un spectrophotomètre.L'absorption est inversement proportionnelle à la concentration d'AOZ dans l'échantillon.

1. 3.Applications

Ce kit peut être utilisé dans l'analyse quantitative et qualitative des résidus d'AOZ danstissus d'anima(muscle, foie, etc.), miel.

1. 4.Réactions croisées

Métabolite furazolidone (AOZ)……………………..100%

Métabolite de la furaltadone (AMOZ)……………………<0,1 %

Métabolite de la nitrofurantoïne (AHD)……………………<0,1 %

Métabolite de la nitrofurazone (SEM)…………………...…<0,1 %

Furazolidone…………………………………….…..…16,3%

Furaltadone…………………………………………….…<1%

Nitrofurantoïne…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………..…<1%

1. 5.Matériaux nécessaires

5.1Équipements

---- Spectrophotomètre à plaque de microtitration (450 nm/630 nm)

---- Évaporateur rotatif ou instruments de séchage à l'azote

---- Homogénéisateur / estomac

----Mixeur

----Mélangeur de vortex

----Centrifuger

----Balance analytique (inductance : 0,01 g)

----Pipette graduée : 10ml

----Poire de pipette en caoutchouc

----Fiole jaugée : 100ml

---- Flacon en verre : 10 ml

----Tube à centrifuger en polystyrène : 2 ml, 50 ml

----Micropipettes : 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Réactifs

----Acétate d'éthyle (AR)

----n-hexane (ou n-heptane) (AR)

----Hydrogénophosphate dipotassique trihydraté

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Acide chlorhydrique concentré (HCl, AR)

-----Méthanol

----Hydroxyde de sodium (NaOH, AR)

----Eau déminéralisée

1. 6.Composants du kit

l Plaque de microtitration recouverte d'antigène, 96 puits

l solutions standard (6 bouteilles, 1 ml/bouteille)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Contrôle standard de dopage : (1ml/bouteille)....….100ppb

l Conjugué enzymatique concentré 1ml...…..bouchon rouge

l Diluants conjugués enzymatiques 10ml………..bouchon vert

l Substrat A 7ml………..............…....…..…..bouchon blanc

l Substrat B 7ml………..............…........….…..bouchon rouge

l Solution d'arrêt 7ml……………………………capuchon jaune

l 20×solution de lavage concentrée 40ml

…………………………………….……bouchon transparent

l 2 × solution d'extraction concentrée 60 ml….capuchon bleu

l 2-Nitrobenzaldéhyde 15.1mg………………bouchon blanc

1. 7.Préparation des réactifs

La solution 1: réactif dérivé :

Ajouter 10 ml de méthanol à la bouteille contenant du 2-nitrobenzaldéhyde et dissoudre.(à la concentration de 10 mM).

La solution 2: 0.1MK₂HPO₄la solution:

Peser 22.8g K₂HPO₄.3H₂O à 1L d'eau déminéralisée à dissoudre.

La solution 3: Solution de HCl 1M

Dissoudre 8,3 ml d'acide chlorhydrique concentré avec de l'eau déminéralisée à 100 ml.

Solution 4 :Solution de NaOH 1M

Dissoudre 4 g de NaOH avec 100 ml d'eau déminéralisée.

solution 5: solution d'extraction :

Diluer 2× la solution d'extraction concentrée avec de l'eau déminéralisée dans un rapport volumique de 1:1.Cette solution peut être conservée pendant 1 mois à 4℃, qui sera utilisée pour extraire des échantillons.

La solution 6: solution de lavage :

Diluer la solution de lavage concentrée 20x avec de l'eau désionisée dans le rapport volumique de 1:19, qui sera utilisée pour laver les plaques.Cette solution diluée se conserve 1 mois à 4℃.

1. 8.Préparations d'échantillons

8.1Avis et précautions avant utilisation :

a) Veuillez utiliser des embouts uniques dans l'expérience et changer les embouts lors de l'absorption de différents réactifs.

b) Assurez-vous que tous les instruments expérimentaux sont propres.

c) le réactif dérivé peut être conservé à 2-8℃ pendant trois mois ;

d) La solution HCl peut être conservée à température ambiante pendant 3 mois ;

e) La solution de NaOH se conserve 3 mois à température ambiante ;

f) Gardez les échantillons non traités au congélateur (-20 ℃);

g) Les échantillons traités peuvent être conservés pendant 24h à 2-8℃ dans l'obscurité.

8.2 Échantillons de tissus et de foie d'animaux :

----Homogénéiser les échantillons avec homogénéisateur ;

----Peser 1,0 ± 0,05 g de l'échantillon de tissu homogénéisé dans un tube à centrifuger en polystyrène de 50 ml.Ajouter 4 ml d'eau déminéralisée, 0,5 ml de solution HCl 1M et 100 ul de réactif dérivé (voir solution 1).Agiter pendant 2min.

---- Incuber à 37℃ pendant la nuit (environ 16h);

---- Ajouter 5ml 0.1MK₂HPO₄ (la solution2), 0,4 ml de NaOH 1M (la solution4) et 5 ml d'acétate d'éthyle.Secouez vigoureusement pendant 30 secondes ;

---- Centrifugeuse à température ambiante (20-25℃) pendant 10min, au moins 3000g ;

---- Prenez 2,5 ml de la phase organique surnageante dans un tube en verre propre de 10 ml, séchez avec de l'azote gazeux de 50 à 60 ℃ ou un évaporateur rotatif ;

---- Dissoudre les restes secs avec 1 ml de n-hexane (ou n-heptane), vortexer pendant 30 secondes, ajouter 1 ml de solution d'extraction (la solution5), vortexer 1min, mélanger complètement.

---- Centrifuger à température ambiante (20-25^oC) pendant 5min, au moins 3000g ;

---- Eliminer la phase organique surnageante ;prendre 50 μl de la phase aqueuse du substrat pour le dosage.

8.4 Miel

----peser 1,0 ± 0,05 g de l'échantillon de miel homogénéisé dans un tube à centrifuger en polystyrène de 50 ml ;

----Ajouter 4 ml d'eau déminéralisée, 0,5 ml de HCl 1M (la solution3) et 100μl de réactif dérivé (la solution1);agiter complètement pendant 2min ;

----Incuber à 37℃ pendant la nuit (environ 16h);

----Ajouter 5ml 0.1MK₂HPO₄ (la solution2), 0,4 ml de NaOH 1M (la solution4) et 5 ml d'acétate d'éthyle, agitez vigoureusement pendant 30 secondes ;

----Centrifugeuse à température ambiante (20-25℃) pendant 10min, au moins 3000g ;

----Prendre 2,5 ml de la phase organique surnageante dans un tube en verre propre de 10 ml, sécher avec de l'azote gazeux de 50 à 60 ℃ ou un évaporateur rotatif ;

---- Dissoudre les restes secs avec 1 ml de n-hexane (ou n-heptane), vortexer pendant 30 secondes, ajouter 1 ml de solution d'extraction (la solution5), vortexer 1min, mélanger complètement.

----Centrifuger à température ambiante (20-25^oC) pendant 10min, au moins 3000g ;

----Retirer la phase organique surnageante ;prendre 50 μl de la phase aqueuse du substrat pour le dosage.

1. 9.Processus de dosage

9.1Avis avant dosage

9.1.1 Assurez-vous que tous les réactifs et micropuits sont tous à température ambiante (20-25℃).

9.1.2 Remettez tous les autres réactifs à 2-8℃ immédiatement après utilisation.

9.1.3 Le lavage correct des micropuits est une étape importante du processus de dosage ;c'est le facteur essentiel de la reproductibilité de l'analyse ELISA.

9.1.4 Eviter la lumière et couvrir les micropuits pendant l'incubation.

9.2 Étapes du dosage

9.2.1 Retirez tous les réactifs à température ambiante (20-25℃) pendant plus de 30 minutes, homogénéisez avant utilisation.

9.2.2 Sortez les micropuits nécessaires et remettez le reste dans le sac à fermeture éclair à 2-8℃ immédiatement.

9.2.3 La solution de lavage concentrée et la solution d'extraction concentrée doivent être réchauffées à température ambiante avant utilisation.

9.2.4Nombre:Chaque position de micropuits est numérotée et tous les étalons et échantillons doivent être analysés en double.Enregistrez les positions des étalons et des échantillons.

9.2.5Dilution de la solution concentrée d'anticorps: diluer la solution enzymatique concentrée avec des diluants de conjugué enzymatique dans un rapport volumique de 1:10 (solution enzymatique concentrée 1 fois : diluants de conjugué enzymatique 10 fois).

9.2.6Ajouter la solution standard / l'échantillon et la solution de conjugué enzymatique: ajouter 50µl de solution standard ou d'échantillon préparé dans les puits correspondants, ajouter 50µl de solution de conjugué enzymatique.Mélangez doucement en secouant la plaque manuellement et incubez pendant 30 min à 25℃ avec couvercle.

9.2.7Laver: Retirez délicatement le couvercle et versez le liquide hors des puits et rincez les micropuits avec 250 µl de solution de lavage diluée (la solution6) à intervalle de 10 s pendant 4 à 5 fois.Absorbez l'eau résiduelle avec du papier absorbant (la bulle d'air restante peut être éliminée avec un embout non utilisé).

9.2.8Coloration: Ajouter 50 µl de solution de substrat A et 50 µl de solution de substrat B dans chaque puits.Mélanger doucement en secouant la plaque manuellement et incuber pendant 15 min à 25℃ avec couvercle (voir 12.8).

9.2.11Mesure: Ajouter 50µl de solution d'arrêt dans chaque puits.Mélanger doucement en secouant la plaque manuellement et mesurer l'absorbance à 450 nm (il est suggéré de mesurer avec la double longueur d'onde de 450/630 nm. Lire le résultat dans les 5 minutes après l'ajout de la solution d'arrêt.)

10 Résultats

10.1Pourcentage d'absorption

Les valeurs moyennes des valeurs d'absorbance obtenues pour les étalons et les échantillons sont divisées par la valeur d'absorbance du premier étalon (étalon zéro) et multipliées par 100 %.L'étalon zéro est ainsi rendu égal à 100 % et les valeurs d'absorbance sont indiquées en pourcentages.

=

B ——étalon d'absorbance (ou échantillon)

B0 ——étalon zéro d'absorbance

10.2Courbe standard

----Pour tracer une courbe standard : prenez la valeur d'absorbance des normes en axe y, semi-logarithmique de la concentration de la solution standard AOZ (ppb) en axe x.

---- La concentration AOZ de chaque échantillon (ppb), qui peut être lue à partir de la courbe d'étalonnage, est multipliée par le facteur de dilution correspondant de chaque échantillon suivi, et la concentration réelle de l'échantillon est obtenue.

Veuillez noter :

Un logiciel spécial a été développé pour toutes les réductions de données, qui peut être fourni sur demande.

Facteur de dilution………………………………………..……2

dix.Sensibilité, justesse et précision

Sensibilité: 0,025ppb

Limite de détection:

Tissu (muscle, foie)…………………………0.1ppb

Mon chéri------------------------------------------------- -0,1 ppb

Précision:

Tissu animal (muscle et foie)……...…………100±20%

Miel………………………………..………….... 100±20%

Précision:Le CV du kit ELISA est inférieur à 10 %.

11.Avis

12.1 Les valeurs moyennes des valeurs d'absorbance obtenues pour les étalons et les échantillons seront réduites si les réactifs et les échantillons n'ont pas été régulés à température ambiante (20-25℃).

12.2 Ne laissez pas les micropuits sécher entre les étapes pour éviter une mauvaise reproductibilité et effectuez l'étape suivante immédiatement après avoir tapoté le porte-micropuits.

12.3 Agiter doucement chaque réactif avant utilisation.

12.4 Gardez votre peau à l'écart de la solution d'arrêt car c'est le 0.5MH₂SO₄la solution.

12.5 Ne pas utiliser les kits périmés.N'échangez pas les réactifs de différents lots, sinon cela diminuera la sensibilité.

12.6 Condition de stockage : Conserver les kits ELISA à 2-8℃, ne pas congeler.Scellez les plaques de micropuits restantes, évitez la lumière directe du soleil pendant toutes les incubations.Il est recommandé de couvrir les plaques de microtitration.

12.7 La solution de substrat doit être abandonnée si elle change de couleur.Les réactifs peuvent être détériorés si la valeur d'absorbance (450/630nm) de l'étalon zéro est inférieure à 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 La réaction de coloration nécessite 15 minutes après l'ajout de la solution de substrat ;Vous pouvez prolonger le temps d'incubation à 20 min ou plus si la couleur est trop claire pour être déterminée. Ne dépassez jamais 25 min. Au contraire, raccourcissez correctement le temps d'incubation.

12.9 La température de réaction optimale est de 25℃.Une température plus élevée ou plus basse entraînera des modifications des valeurs de sensibilité et d'absorbance.

12.Condition de stockage et durée de stockage

Condition de stockage : 2-8℃.

Période de stockage : 12 mois.