toradh

1. 1.Cùl-fhiosrachadh

Tha nitrofurans nan antibiotics speactram farsaing synthetigeach, a bhios gu tric air am fastadh ann an cinneasachadh bheathaichean airson na feartan antibacterial agus pharmacokinetic sàr-mhath aca.Bha iad cuideachd air an cleachdadh mar luchd-adhartachaidh fàis ann an cinneasachadh muc, cearcan agus uisge.Ann an sgrùdaidhean fad-ùine le beathaichean obair-lann chomharraich iad gu robh na drogaichean pàrant agus na metabolites aca a’ nochdadh feartan carcinogenic agus mutagenic.Tha seo air leantainn gu toirmeasg air nitrofurans airson làimhseachadh bheathaichean a thathas a’ cleachdadh airson cinneasachadh bìdh.Chaidh na drogaichean nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin agus nitrofurazone a thoirmeasg bho bhith gan cleachdadh ann an cinneasachadh bheathaichean bìdh san EU ann an 1993, agus chaidh cleachdadh furazolidone a thoirmeasg ann an 1995.

Feumaidh an anailis air fuigheall dhrogaichean nitrofuran a bhith stèidhichte air a bhith a ‘lorg metabolites ceangailte ri clò de dhrogaichean pàrant nitrofuran.Leis gu bheil na drogaichean pàrant air an metabolachadh gu math luath, agus mairidh na metabolites nitrofuran ceangailte ri clò airson ùine mhòr, tha na metabolites sin air an cleachdadh mar thargaid ann a bhith a ‘lorg mì-ghnàthachadh nitrofurans, a tha a’ toirt a-steach metabolite Furazolidone (AOZ), Furaltadone metabolite (AMOZ). ), Nitrofurantoin metabolite (AHD) agus metabolite Nitrofurazone (SEM).

Tha fuigheall AOZ mar as trice air a dhearbhadh le LC-MS no LC-MS/MS.Tha sgrùdaidhean immunossame, an coimeas ri modhan cromatagrafach, a’ nochdadh buannachdan mòra a thaobh cugallachd, crìoch lorgaidh, uidheamachd teicnigeach agus riatanas ùine.(Cosgais ùine: 45min)

1. 2.Prionnsabal deuchainn

Tha an uidheamachd ELISA seo air a dhealbhadh gus AOZ a lorg stèidhichte air prionnsapal immunoassay enzyme farpaiseach neo-dhìreach.Tha na tobraichean microtiter air an còmhdach le antigen ceangailte ri BSA.Bidh AOZ ann an sampall a’ farpais ris an antigen còmhdaichte air a’ phlàta microtiter airson an antibody a chaidh a chur ris.Às deidh enzyme conjugate a chuir ris, thathas a ’cleachdadh substrate chromogenic agus tha an comharra air a thomhas le spectrphotometer.Tha an in-ghabhail co-rèireach gu mì-chothromach ris a’ cho-chruinneachadh AOZ san sampall.

1. 3.Iarrtasan

Faodar an uidheamachd seo a chleachdadh ann an sgrùdadh cainneachdail agus càileachdail air fuigheall AOZ ann ansgeadaichean anima(fèithean, grùthan, msaa), mil.

1. 4.Tar-fhreagairt

Furazolidone metabolite (AOZ) ……………………………..100%

Furaltadone metabolite (AMOZ) …………………… <0.1%

Nitrofurantoin metabolite (AHD) …………………<0.1%

Nitrofurazone metabolite (SEM) …………………<0.1%

Furazolidone …………………………………….…..… 16.3%

Furaltadone………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin …………………………………….…….…<1%

Nitrofurazone …………………………………………..<1%

1. 5.Stuthan a dhìth

5.1Innealan

---- Spectrophotometer plàta microtiter (450nm / 630nm)

---- ionnstramaidean evaporator rothlach no nitrigin

---- Homogenizer / stamag

---- Shaker

---- measgachadh Vortex

---- Centrifuge

---- Cothromachadh anailis (inntrigeadh: 0.01g)

---- Pìob ceumnaichte: 10ml

---- bulb pìobaire rubair

---- Flasg toirteil: 100ml

---- Flasg glainne: 10ml

---- Tiùb centrifuge polystyrene: 2ml, 50ml

---- Micrippettes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-ioma-phìob

5.2Ath-bheothaichean

---- Acetate ethyl (AR)

---- n-hexane (no n-heptane) (AR)

---- Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- searbhag hydrochloric tiugh (HCl, AR)

-----Methanol

---- Sodium hydroxide (NaOH, AR)

---- uisge deionized

1. 6.Co-phàirtean Kit

l Plàta microtiter còmhdaichte le antigen, 96 tobraichean

l Fuasglaidhean àbhaisteach (6 botail, 1ml / botal)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Smachd àbhaisteach snìomh: (1ml / botal) ......100ppb

l enzyme cuimseach co-luachadh 1ml ... ..... caip dearg

l Duilgheadasan conjugate enzyme 10ml ………….. ceap uaine

l Fo-strat A 7ml ………........................geal cap

l Fo-strat B 7ml………...........................caip dearg

l Cuir stad air fuasgladh 7ml ………………………… cap buidhe

l 20 × fuasgladh nighe tiugh 40ml

…………………………………….……bonn follaiseach

l 2 × fuasgladh às-tharraing tiugh 60ml….caip gorm

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………cap geal

1. 7.Ullachadh reactaran

Fuasgladh 1: derivative reagent:

Cuir 10ml de methanol ris a’ bhotal le 2-Nitrobenzaldehyde agus sgaoil.(aig an ìre de 10mM).

Fuasgladh 2aig: 0.1MK₂HPO₄fuasgladh:

Cuideam 22.8g K₂HPO₄.3H₂O gu 1L de uisge deionized airson a sgaoileadh.

Fuasgladh 3: 1M fuasgladh HCl

Fuasgail 8.3ml searbhag hydrochloric tiugh le uisge deionized gu 100ml.

Fuasgladh 4:Fuasgladh 1M NaOH

Fuasgail 4g NaOH le uisge deionized 100ml.

Fuasgladh 5: fuasgladh às-tharraing:

Fuasgladh às-tharraing tiugh 2 × le uisge deionized anns a’ cho-mheas tomhas-lìonaidh 1: 1.Faodar am fuasgladh seo a ghleidheadh ​​​​airson 1 mìos aig 4 ℃, a thèid a chleachdadh airson sampallan a chaidh a thoirt a-mach.

Fuasgladh 6: fuasgladh nighe:

Lùghdaich am fuasgladh nighe tiugh 20 × le uisge deionized anns a’ chuibhreann tomhas-lìonaidh de 1:19, a thèid a chleachdadh airson na truinnsearan a nighe.Faodar am fuasgladh caolaichte seo a ghleidheadh ​​​​airson 1 mìos aig 4 ℃.

1. 8.Ullachaidhean Eisimpleirean

8.1Sanas agus ro-chùram mus tèid an obrachadh:

a) Feuch an cleachd thu molaidhean aon-uair san deuchainn, agus atharraich na molaidhean nuair a bhios tu a’ gabhail a-steach diofar imoibrí.

b) Dèan cinnteach gu bheil a h-uile inneal deuchainneach glan.

c) faodar an derivative reagent a ghleidheadh ​​​​aig 2-8 ℃ airson trì mìosan;

d) Faodar am fuasgladh HCl a ghleidheadh ​​​​aig teòthachd an t-seòmair airson 3 mìosan;

e) Faodar fuasgladh NaOH a ghleidheadh ​​​​airson 3 mìosan aig teòthachd an t-seòmair;

f) Cùm sampallan gun làimhseachadh ann an reothadh (-20 ℃);

g) Faodar sampallan làimhseachaidh a ghleidheadh ​​​​airson 24h aig 2-8 ℃ ann an dorchadas.

8.2 Stuthan bheathaichean agus sampallan grùthan:

---- Homogenize na sampallan le homogenizer;

---- Cuideam 1.0 ± 0.05g den sampall clò homogenized a-steach do phìob centrifuge polystyrene 50ml.Cuir 4ml uisge deionized, fuasgladh 0.5ml 1M HCl agus reagent derivative 100ul (faic fuasgladh 1).Crith e airson 2 mhionaid.

---- Goir aig 37 ℃ thar oidhche (mu 16h);

---- Cuir 5ml 0.1MK ris₂HPO₄ (fuasgladh2), 0.4ml 1M NaOH (fuasgladh4) agus 5ml ethyl acetate.Crith gu dian airson 30s;

---- Centrifuge aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃) airson 10min, co-dhiù 3000g;

---- Thoir 2.5ml den ìre organach supernatant a-steach do phìob glainne glan 10ml, tioram le gas nitrogen 50-60 ℃ no evaporator rothlach;

---- Fuasgail an còrr tioram le 1ml n-hexane (no n- heptane), vortex airson 30n, cuir fuasgladh às-tharraing 1ml (fuasgladh5), vortex 1min, measgachadh gu tur.

---- Centrifuge aig teòthachd an t-seòmair (20-25^oC) airson 5min, co-dhiù 3000g;

---- Thoir air falbh an ìre organach supernatant;Gabh 50 μl den ìre uisge substrate airson assay.

8.4 Mil

---- cuideam 1.0 ± 0.05g den sampall meala homogenized a-steach do phìob centrifuge polystyrene 50ml;

---- Cuir 4ml uisge deionized, 0.5ml 1M HCl (fuasgladh3) agus 100μl derivative reagent (fuasgladh1);crathadh gu tur airson 2 mhionaid;

---- Goir aig 37 ℃ thar oidhche (mu 16h);

---- Cuir 5ml 0.1MK ris₂HPO₄ (fuasgladh2), 0.4ml 1M NaOH (fuasgladh4) agus 5ml ethyl acetate, a 'crathadh gu cruaidh airson 30s;

---- Centrifuge aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃) airson 10min, co-dhiù 3000g;

---- Thoir 2.5ml den ìre organach supernatant a-steach do phìob glainne glan 10ml, tioram le gas nitrogen 50-60 ℃ no evaporator rothlach;

---- Fuasgail an còrr tioram le 1ml n-hexane (no n- heptane), vortex airson 30n, cuir fuasgladh às-tharraing 1ml (fuasgladh5), vortex 1min, measgachadh gu tur.

---- Centrifuge aig teòthachd an t-seòmair (20-25^oC) airson 10min, co-dhiù 3000g;

---- Thoir air falbh an ìre organach supernatant;Gabh 50 μl den ìre uisge substrate airson assay.

1. 9.Pròiseas measaidh

9.1Sanas ron assay

9.1.1 Dèan cinnteach gu bheil na h-ath-bheachdan agus na microwells uile aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃).

9.1.2 Thoir air ais na h-ath-bheachdan eile gu 2-8 ℃ dìreach às deidh an cleachdadh.

9.1.3 Tha a bhith a’ nighe nam microwells gu ceart na cheum cudromach ann am pròiseas assay;tha e na fheart deatamach do ath-riochdachadh mion-sgrùdadh ELISA.

9.1.4 Seachain an solas agus còmhdaich na microwells aig àm goir.

9.2 Ceumannan Assay

9.2.1 Thoir a-mach na h-uile ath-bheachdan aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃) airson barrachd air 30min, homogenize mus tèid a chleachdadh.

9.2.2 Thoir a-mach na microwells a tha a dhìth agus till an còrr a-steach don bhaga glas-zip aig 2-8 ℃ sa bhad.

9.2.3 Bu chòir am fuasgladh nighe dùmhail agus fuasgladh às-tharraing tiugh a bhith air ath-bhlàthachadh gus a bhith aig teòthachd an t-seòmair mus tèid a chleachdadh.

9.2.4Àireamh:Bu chòir gach suidheachadh microwell agus gach inbhe agus sampall a bhith air an ruith ann an dùblachadh.Clàraich na h-inbhean agus suidheachadh sampall.

9.2.5Lùghdachadh air fuasgladh antibody cuimseach: caolaich am fuasgladh enzyman dùmhlaichte le diluents conjugate enzyme anns a’ cho-mheas tomhas-lìonaidh de 1:10 (fuasgladh enzyme tiugh 1 fillte: 10 pasgadh enzyme conjugate diluents).

9.2.6Cuir fuasgladh / sampall àbhaisteach agus fuasgladh co-chuingealaichte enzyme ris: cuir 50 µl de fhuasgladh àbhaisteach no sampall ullaichte gu tobraichean co-fhreagarrach, cuir fuasgladh enzyme 50µl conjugate.Meudaich gu socair le bhith a’ crathadh a’ phlàta le làimh agus goir airson 30 mionaid aig 25 ℃ le còmhdach.

9.2.7Nigh: Thoir air falbh an còmhdach gu socair agus dòirt an leaghan a-mach às na tobraichean agus nigh na microwells le fuasgladh nighe caolaichte 250µl (fuasgladh6) aig eadar-ama de 10s airson 4-5 tursan.Gabh a-steach an uisge a tha air fhàgail le pàipear sùghaidh (faodar am builgean èadhair eile a chuir às le tip nach deach a chleachdadh).

9.2.8Dathadh: Cuir fuasgladh substrate 50µl A agus fuasgladh substrate 50ul B ri gach tobar.Meudaich gu socair le bhith a’ rocadh a’ phlàta le làimh agus goir airson 15 mionaid aig 25 ℃ le còmhdach (faic 12.8).

9.2.11Tomhais: Cuir 50µl am fuasgladh stad air gach tobar.Meudaich gu socair le bhith a’ rocadh a’ phlàta le làimh agus tomhais an sùghadh aig 450nm (Mhol e tomhas le tonn-tonn dùbailte 450/630nm. Leugh an toradh taobh a-staigh 5min às deidh fuasgladh stad a chur ris. )

10 Toraidhean

10.1Àireamh sa cheud absorbance

Tha luachan cuibheasach nan luachan sùghaidh a gheibhear airson na h-inbhean agus na sampallan air an roinn le luach sùghaidh a’ chiad ìre (inbhe neoni) agus air an iomadachadh le 100%.Mar sin tha an ìre neoni air a dhèanamh co-ionann ri 100% agus tha na luachan sùghaidh air an ainmeachadh ann an ceudadan.

=

B —— inbhe neo-làthaireachd (no sampall)

B0 —— inbhe neoni

10.2Curve àbhaisteach

---- Gus lùb àbhaisteach a tharraing: Gabh luach sùghadh inbhean mar y-axis, leth-logarithmic de chruinneachadh fuasgladh àbhaisteach AOZ (ppb) mar x-axis.

---- Tha an dùmhlachd AOZ de gach sampall (ppb), a ghabhas leughadh bhon lùb calibration, air iomadachadh leis a ’bhàillidh caolachaidh co-fhreagarrach airson gach sampall a thèid a leantainn, agus gheibhear an fhìor chruinneachadh de shampall.

Thoir an aire:

Chaidh bathar-bog sònraichte a leasachadh airson a h-uile lughdachadh dàta, a dh'fhaodar a thoirt seachad ma thèid iarraidh.

Factor dilution………………………………………..……2

10.Cugallachd, mionaideachd agus mionaideachd

Cugallachd: 0.025ppb

Crìochan lorgaidh:

Meineag (fèithean, grùthan) ………………………… 0.1ppb

Mil ----------------------------------------------- -0.1ppb

Cruinneas:

Stuth beathach (fèithean agus grùthan) ……...…………100 ± 20%

Mil………………………………..………….... 100±20%

Cruinneas:Tha CV de phasgan ELISA nas lugha na 10%.

11.Sanas

12.1 Thèid luachan cuibheasach nan luachan sùghaidh a gheibhear airson na h-inbhean agus na sampallan a lughdachadh mura h-eil na h-ath-bheachdan agus na sampallan air an riaghladh gu teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃).

12.2 Na leig le microwells tiormachadh eadar ceumannan gus ath-riochdachadh neo-shoirbheachail a sheachnadh agus obraich an ath cheum sa bhad às deidh dha tapadh air neach-gleidhidh microwells.

12.3 Crith gach reagent gu socair mus cleachd thu e.

12.4 Cùm do chraiceann air falbh bhon fhuasgladh stad oir is e an 0.5MH a th’ ann₂SO₄fuasgladh.

12.5 Na cleachd na goireasan as ùire.Na atharraich na h-ath-bheachdan ann an diofar batches, air neo fàgaidh e cugallachd.

12.6 Suidheachadh stòraidh: Cùm na goireasan ELISA aig 2-8 ℃, na reothadh.Ròin truinnsearan microwell fois, Seachain solas dìreach rè gach goir.Thathas a 'moladh a bhith a' còmhdach nam plèanaichean microtiter.

12.7 Bu chòir fuasgladh substrate a thrèigsinn ma thionndaidheas e dathan.Dh’ fhaodadh na h-ath-bheachdan a dhol bhuaithe ma tha an luach sùghaidh (450/630nm) den inbhe neoni nas ìsle na 0.5 (A450nm <0.5).

12.8 Feumaidh an ath-bhualadh dath 15min às deidh fuasgladh substrate a chuir ris;Faodaidh tu an ùine goir a leudachadh gu 20 mionaid no barrachd ma tha an dath ro aotrom airson a dhearbhadh, gun a bhith nas fhaide na 25min. Air an làimh eile, giorraich an ùine goir gu ceart.

12.9 Is e an teòthachd ath-bhualadh as fheàrr 25 ℃.Bidh teòthachd nas àirde no nas ìsle a’ leantainn gu atharrachaidhean ann an luachan cugallachd agus sùghaidh.

12.Suidheachadh stòraidh agus ùine stòraidh

Suidheachadh stòraidh: 2-8 ℃.

Ùine stòraidh: 12 mìosan.