produto

1. 1.Fondo

Os nitrofuranos son antibióticos sintéticos de amplo espectro, que se empregan con frecuencia na produción animal polas súas excelentes propiedades antibacterianas e farmacocinéticas.Tamén se utilizaron como promotores do crecemento na produción porcina, avícola e acuática.En estudos a longo prazo con animais de laboratorio indicaron que as drogas parentais e os seus metabolitos mostraban características canceríxenas e mutaxénicas.Isto levou a prohibir os nitrofuranos para o tratamento dos animais utilizados para a produción de alimentos.Os fármacos de nitrofurano furaltadona, nitrofurantoína e nitrofurazona foron prohibidos na UE na produción de alimentos para animais en 1993, e o uso de furazolidona foi prohibido en 1995.

A análise dos residuos de fármacos con nitrofurano debe basearse na detección dos metabolitos ligados ao tecido dos fármacos nai de nitrofurano.Dado que os fármacos nai metabolizan moi rapidamente e os metabolitos de nitrofurano ligados ao tecido conservaranse durante moito tempo, estes metabolitos úsanse como obxectivo na detección do abuso de nitrofuranos, que inclúen o metabolito de furazolidona (AOZ), o metabolito de furaltadona (AMOZ). ), metabolito de nitrofurantoína (AHD) e metabolito de nitrofurazona (SEM).

Os residuos de AOZ son determinados máis comúnmente por LC-MS ou LC-MS/MS.Os inmunoensaios enzimáticos, en comparación cos métodos cromatográficos, mostran vantaxes considerables en canto á sensibilidade, límite de detección, equipamento técnico e tempo esixencia.(Custo de tempo: 45 min)

1. 2.Principio de proba

Este kit ELISA está deseñado para detectar AOZ baseándose no principio de inmunoensaio enzimático competitivo indirecto.Os pozos de microtitulación están recubertos de antíxeno de captura ligado a BSA.AOZ na mostra compite co antíxeno revestido na placa de microtitulación polo anticorpo engadido.Despois da adición de conxugado enzimático, utilízase o substrato cromoxénico e o sinal é medido por un espectrofotómetro.A absorción é inversamente proporcional á concentración de AOZ na mostra.

1. 3.Aplicacións

Este kit pódese usar na análise cuantitativa e cualitativa de residuos de AOZtecidos de anima(músculo, fígado, etc.), mel.

1. 4.Reaccións cruzadas

Metabolito de furazolidona (AOZ) 100%

Metabolito de furaltadona (AMOZ)…………………………<0,1%

Metabolito de nitrofurantoína (AHD)…………………………<0,1%

Metabolito de nitrofurazona (SEM)………..<0,1%

Furazolidona………………………………………………..…16,3%

Furaltadona…………………………………………………….…<1%

Nitrofurantoína………………………………………….…….…<1%

Nitrofurazona…………………………………………..…<1%

1. 5.Materiais necesarios

5.1Equipos

---- Espectrofotómetro de placa de microtitulación (450 nm/630 nm)

----Evaporador rotativo ou instrumentos de secado de nitróxeno

----Homogeneizador/estómago

---- Axitador

---- Mezclador Vortex

----Centrífuga

----Balanza analítica (inductancia: 0,01 g)

----Pipeta graduada: 10 ml

---- Bombilla de pipeta de goma

----Matraz aforado: 100ml

---- Matraz de vidro: 10 ml

----Tubo de centrífuga de poliestireno: 2 ml, 50 ml

----Micropipetas: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multippette

5.2Reactivos

----Acetato de etilo (AR)

----n-hexano (ou n-heptano) (AR)

---- Hidróxeno fosfato dipotásico trihidratado

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Ácido clorhídrico concentrado (HCl, AR)

-----Metanol

---- Hidróxido de sodio (NaOH, AR)

----Auga desionizada

1. 6.Compoñentes do kit

l Placa de microtitulación recuberta de antíxeno, 96 pocillos

l Solucións estándar (6 botellas, 1 ml/botella)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Control estándar de espiga: (1 ml/botella).......100 ppb

l Conxugado enzimático concentrado 1 ml....... gorro vermello

l Diluentes conxugados enzimáticos 10 ml………..tapón verde

l Substrato A 7ml……….............…....…..…..tapón branco

l Substrato B 7ml……………………….........….…..tapón vermello

l Solución de parada 7 ml………………………. tapón amarelo

l 20×solución de lavado concentrada 40ml

…………………………………………….……tapón transparente

l 2×solución de extracción concentrada 60ml….tapón azul

l 2-Nitrobenzaldehido 15,1 mg…………………cap branco

1. 7.Preparación de reactivos

Solución 1: reactivo derivado:

Engade 10 ml de metanol á botella con 2-Nitrobenzaldehido e disolve.(a unha concentración de 10 mM).

Solución 2: 0,1 MK₂HPO₄solución:

Peso 22,8 g K₂HPO₄.3H₂O a 1L de auga desionizada para disolver.

Solución 3: solución de HCl 1M

Disolver 8,3 ml de ácido clorhídrico concentrado con auga desionizada a 100 ml.

Solución 4:Solución de NaOH 1M

Disolver 4 g de NaOH con 100 ml de auga desionizada.

Solución 5: solución de extracción:

Diluír 2x solución de extracción concentrada con auga desionizada nunha proporción de volume de 1:1.Esta solución pódese conservar durante 1 mes a 4 ℃, que se utilizará para extraer mostras.

Solución 6: solución de lavado:

Dilúese a solución de lavado concentrada 20 × con auga desionizada na proporción de volume de 1:19, que se utilizará para lavar as placas.Esta solución diluída pódese conservar durante 1 mes a 4 ℃.

1. 8.Preparacións da mostra

8.1Aviso e precaucións antes da operación:

a) Use puntas únicas no experimento e cambie as puntas ao absorber diferentes reactivos.

b) Asegúrese de que todos os instrumentos experimentais estean limpos.

c) o reactivo derivado pódese conservar a 2-8 ℃ durante tres meses;

d) A disolución de HCl pódese conservar a temperatura ambiente durante 3 meses;

e) A disolución de NaOH pódese conservar 3 meses a temperatura ambiente;

f) Manter as mostras sen tratar en conxelación (-20 ℃);

g) As mostras tratadas pódense conservar durante 24 horas a 2-8 ℃ na escuridade.

8.2 Mostras de tecido animal e fígado:

----Homoxeneizar as mostras con homoxeneizador;

----Pesar 1,0±0,05 g da mostra de tecido homoxeneizado nun tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml.Engade 4 ml de auga desionizada, 0,5 ml de solución de HCl 1 M e 100 ul de reactivo derivado (ver solución 1).Axitalo durante 2 min.

---- Incubar a 37 ℃ durante a noite (aproximadamente 16 h);

---- Engade 5 ml 0,1 MK₂HPO₄ (solución2), 0,4 ml de NaOH 1M (solución4) e 5 ml de acetato de etilo.Axita ferozmente durante 30 segundos;

---- Centrifugar a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min, polo menos 3000 g;

---- Tome 2,5 ml da fase orgánica sobrenadante nun tubo de vidro limpo de 10 ml, seque con gas nitróxeno a 50-60 ℃ ou evaporador rotatorio;

---- Disolver o resto seco con 1 ml de n-hexano (ou n-heptano), agitar durante 30 segundos, engadir 1 ml de solución de extracción (solución5), agitar 1 min, mesturar completamente.

---- Centrifugar a temperatura ambiente (20-25^oC) durante 5 minutos, polo menos 3000 g;

---- Eliminar a fase orgánica sobrenadante;tomar 50 μl da fase acuosa do substrato para o ensaio.

8.4 Mel

----pesar 1,0±0,05 g da mostra de mel homoxeneizada nun tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml;

----Engadir 4 ml de auga desionizada, 0,5 ml de HCl 1 M (solución3) e 100μl de reactivo derivado (solución1);axitar completamente durante 2 minutos;

----Incubar a 37 ℃ durante a noite (aproximadamente 16 h);

----Engadir 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solución2), 0,4 ml de NaOH 1M (solución4) e 5 ml de acetato de etilo, axitar con forza durante 30 segundos;

----Centrifuga a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante 10 min, polo menos 3000 g;

---- Tome 2,5 ml da fase orgánica sobrenadante nun tubo de vidro limpo de 10 ml, seque con nitróxeno a 50-60 ℃ ou evaporador rotatorio;

---- Disolver o resto seco con 1 ml de n-hexano (ou n-heptano), agitar durante 30 segundos, engadir 1 ml de solución de extracción (solución5), agitar 1 min, mesturar completamente.

----Centrifugar a temperatura ambiente (20-25^oC) durante 10 minutos, polo menos 3000 g;

----Eliminar a fase orgánica sobrenadante;tomar 50 μl da fase acuosa do substrato para o ensaio.

1. 9.Proceso de ensaio

9.1Aviso antes do ensaio

9.1.1 Asegúrese de que todos os reactivos e micropozos estean a temperatura ambiente (20-25 ℃).

9.1.2 Retorna todos os reactivos restantes a 2-8 ℃ inmediatamente despois do uso.

9.1.3 Lavar correctamente os micropozos é un paso importante no proceso de ensaio;é o factor vital para a reproducibilidade da análise ELISA.

9.1.4 Evitar a luz e cubrir os micropozos durante a incubación.

9.2 Pasos do ensaio

9.2.1 Saque todos os reactivos a temperatura ambiente (20-25 ℃) durante máis de 30 min, homoxeneízao antes do uso.

9.2.2 Saca os micropozos necesarios e devolve o resto á bolsa con peche con cremallera a 2-8 ℃ inmediatamente.

9.2.3 A solución de lavado concentrada e a solución de extracción concentrada deben quentarse de novo a temperatura ambiente antes do uso.

9.2.4Número:Cada posición dos micropozos numeradas e todos os patróns e mostras deben executarse por duplicado.Rexistrar os estándares e as posicións das mostras.

9.2.5Dilución da solución concentrada de anticorpos: diluír a solución enzimática concentrada con diluentes conxugados enzimáticos na proporción de volume de 1:10 (solución enzimática concentrada 1 veces: diluentes conxugados enzimáticos 10 veces).

9.2.6Engadir solución estándar/mostra e solución de conxugado enzimático: engadir 50 µl de solución estándar ou mostra preparada aos pozos correspondentes, engadir 50 µl de solución de conxugado enzimático.Mestura suavemente axitando a placa manualmente e incuba durante 30 min a 25 ℃ con tapa.

9.2.7Lavar: Retire a tapa suavemente e verte o líquido dos pozos e enxágüe os micropozos con 250 µl de solución de lavado diluída (solución6) a intervalos de 10 segundos durante 4-5 veces.Absorbe a auga residual con papel absorbente (a burbulla de aire restante pódese eliminar coa punta non utilizada).

9.2.8Coloración: Engade 50 µl de solución de substrato A e 50 µl de solución de substrato B a cada pozo.Mestura suavemente movendo a placa manualmente e incuba durante 15 minutos a 25 ℃ con tapa (ver 12.8).

9.2.11Medida: Engade 50 µl de solución de parada a cada pozo.Mestura suavemente movendo a placa manualmente e mide a absorbancia a 450 nm (suxeriu medir coa lonxitude de onda dual de 450/630 nm. Lea o resultado dentro de 5 minutos despois da adición da solución de parada).

10 Resultados

10.1Absorbancia porcentual

Os valores medios dos valores de absorbancia obtidos para os patróns e as mostras divídense polo valor de absorbancia do primeiro patrón (patrón cero) e multiplícanse polo 100%.Así, o patrón cero faise igual ao 100% e os valores de absorbancia cítanse en porcentaxes.

=

B —— estándar de absorbancia (ou mostra)

B0 ——absorción cero estándar

10.2Curva estándar

----Para trazar unha curva estándar: tome o valor de absorbancia dos patróns como eixe y, semilogarítmico da concentración da solución estándar AOZ (ppb) como eixe x.

----A concentración de AOZ de cada mostra (ppb), que se pode ler a partir da curva de calibración, multiplícase polo correspondente factor de dilución de cada mostra seguida e obtense a concentración real da mostra.

Observe:

Desenvolveuse un software especial para toda a redución de datos, que se pode proporcionar baixo petición.

Factor de dilución…………………………………………………2

10.Sensibilidade, exactitude e precisión

Sensibilidade: 0,025 ppb

Límite de detección:

Tecido (músculo, fígado)………………………… 0,1 ppb

Mel -------------------------------------------------- -0,1 ppb

Precisión:

Tecido animal (músculo e fígado)…………………100±20%

Mel………………………………………………….. 100±20%

Precisión:O CV do kit ELISA é inferior ao 10%.

11.Aviso

12.1 Os valores medios dos valores de absorbancia obtidos para os patróns e as mostras reduciranse se os reactivos e as mostras non se regulan a temperatura ambiente (20-25 ℃).

12.2 Non permita que os micropozos se sequen entre os pasos para evitar unha reproducibilidade non exitosa e realice o seguinte paso inmediatamente despois de tocar o soporte de micropozos.

12.3 Agite cada reactivo suavemente antes do uso.

12.4 Manteña a súa pel lonxe da solución de parada porque é o 0,5MH₂SO₄solución.

12.5 Non use os kits obsoletos.Non cambie os reactivos de lotes diferentes ou, se non, baixará a sensibilidade.

12.6 Condicións de almacenamento: manteña os kits ELISA a 2-8 ℃, non conxelar.Selle as placas de micropozos de descanso, evite a luz solar directa durante todas as incubacións.Recoméndase cubrir as placas de microtitulación.

12.7 Débese abandonar a solución do substrato se cambia de cor.Os reactivos poden deteriorarse se o valor de absorbancia (450/630 nm) do estándar cero é inferior a 0,5 (A450nm <0,5).

12.8 A reacción de coloración necesita 15 min despois da adición da solución de substrato;Podes prolongar o tempo de incubación a 20 minutos ou máis se a cor é demasiado clara para ser determinada. Nunca supere os 25 minutos. Pola contra, acurta o tempo de incubación correctamente.

12.9 A temperatura de reacción óptima é de 25 ℃.A temperatura máis alta ou máis baixa provocará cambios nos valores de sensibilidade e absorbancia.

12.Condicións de almacenamento e período de almacenamento

Condicións de almacenamento: 2-8 ℃.

Prazo de almacenamento: 12 meses.