फुराज़ोलिडोन मेटाबोलाइट (एओजेड) के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रतिस्पर्धी एंजाइम इम्यूनोएसे किट
- 1.पृष्ठभूमि
नाइट्रोफुरन्स सिंथेटिक ब्रॉड-स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक्स हैं, जो अक्सर अपने उत्कृष्ट जीवाणुरोधी और फार्माकोकाइनेटिक गुणों के लिए पशु उत्पादन में नियोजित होते हैं।उनका उपयोग सुअर, कुक्कुट और जलीय उत्पादन में वृद्धि प्रवर्तकों के रूप में भी किया गया था।प्रयोगशाला पशुओं के साथ दीर्घ अवधि के अध्ययन में संकेत मिलता है कि मूल दवाओं और उनके चयापचयों ने कार्सिनोजेनिक और म्यूटाजेनिक विशेषताओं को दिखाया है।इसने खाद्य उत्पादन के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों के इलाज के लिए नाइट्रोफुरन्स का निषेध किया है।1993 में यूरोपीय संघ में नाइट्रोफुरन ड्रग्स फुराल्टाडोन, नाइट्रोफुरैंटोइन और नाइट्रोफ्यूराज़ोन को खाद्य पशु उत्पादन में उपयोग से प्रतिबंधित कर दिया गया था और 1995 में फ़राज़ोलिडोन का उपयोग प्रतिबंधित कर दिया गया था।
नाइट्रोफुरन दवाओं के अवशेषों का विश्लेषण नाइट्रोफुरन मूल दवाओं के ऊतक बाध्य मेटाबोलाइट्स के पता लगाने पर आधारित होना चाहिए।चूंकि मूल दवाएं बहुत तेजी से मेटाबोलाइज की जाती हैं, और ऊतक बाध्य नाइट्रोफ्यूरान मेटाबोलाइट्स लंबे समय तक बने रहेंगे, इन मेटाबोलाइट्स का उपयोग नाइट्रोफुरन्स के दुरुपयोग का पता लगाने में लक्ष्य के रूप में किया जाता है, जिसमें फुराजोलिडोन मेटाबोलाइट (एओजेड), फुराल्टाडोन मेटाबोलाइट (एएमओजेड) शामिल हैं। ), Nitrofurantoin मेटाबोलाइट (AHD) और Nitrofurazone मेटाबोलाइट (SEM)।
AOZ-अवशेषों का निर्धारण आमतौर पर LC-MS या LC-MS/MS द्वारा किया जाता है।क्रोमैटोग्राफिक विधियों की तुलना में एंजाइम इम्यूनोसेज़, संवेदनशीलता, पता लगाने की सीमा, तकनीकी उपकरण और समय की आवश्यकता के संबंध में काफी फायदे दिखाते हैं।(समय लागत: 45 मिनट)
- 2.परीक्षण सिद्धांत
यह एलिसा किट अप्रत्यक्ष-प्रतिस्पर्धी एंजाइम इम्यूनोएसे के सिद्धांत के आधार पर एओजेड का पता लगाने के लिए डिज़ाइन की गई है।माइक्रोटिटर कुएं कैप्चर बीएसए-लिंक्ड एंटीजन के साथ लेपित हैं।नमूने में AOZ जोड़े गए एंटीबॉडी के लिए माइक्रोटिटर प्लेट पर लगे एंटीजन के साथ प्रतिस्पर्धा करता है।एंजाइम संयुग्म जोड़ने के बाद, क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है और सिग्नल को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा मापा जाता है।अवशोषण नमूने में AOZ सांद्रता के व्युत्क्रमानुपाती होता है।
- 3.अनुप्रयोग
इस किट का उपयोग एओजेड अवशेषों के मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण में किया जा सकता हैएनिमा ऊतक(मांसपेशियों, जिगर आदि), शहद।
- 4.पार प्रतिक्रियाओं
फ़राज़ोलिडोन मेटाबोलाइट (एओजेड) …………………… ..100%
फुराल्टाडोन मेटाबोलाइट (AMOZ) …………………………… <0.1%
नाइट्रोफुरैंटोइन मेटाबोलाइट (एएचडी) …………………… <0.1%
Nitrofurazone मेटाबोलाइट (SEM) ……………………<0.1%
फ़राज़ज़ोलोन ……………………………………………………… 16.3%
फुराल्टेडोन …………………………………………। …<1%
नाइट्रोफुरेंटोइन ………………………………………………। …<1%
Nitrofurazone…………………………………………..<1%
- 5.सामग्री की आवश्यकता
5.1उपकरणों
---- माइक्रोटिटर प्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (450nm/630nm)
---- रोटरी बाष्पीकरण या नाइट्रोजन सुखाने के उपकरण
---- Homogenizer /stomacher
---- शेखर
----भंवर मिक्सर
---- अपकेंद्रित्र
----विश्लेषणात्मक संतुलन (अधिष्ठापन: 0.01g)
---- स्नातक की उपाधि प्राप्त पिपेट: 10 मि.ली
---- रबर पिपेट बल्ब
---- वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क: 100 मिली
---- ग्लास फ्लास्क: 10 मिली
---- पॉलीस्टाइन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब: 2 मिली, 50 मिली
---- माइक्रोपिपेट्स: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250ul-मल्टीपिपेट
5.2अभिकर्मकों
---- एथिल एसीटेट (AR)
----एन-हेक्सेन (या एन-हेप्टेन) (एआर)
---- डिपोटेशियम हाइड्रोजन फॉस्फेट ट्राइहाइड्रेट
(K2एचपीओ4.3एच2ओ) (एआर)
---- केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल, एआर)
-----मेथनॉल
---- सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH, AR)
----विआयनीकृत पानी
- 6.किट घटक
एल एंटीजन के साथ लेपित माइक्रोटिटर प्लेट, 96 कुएं
एल मानक समाधान (6 बोतलें, 1 मिली / बोतल)
0ppb, 0.025ppb, 0.075ppb, 0.225ppb, 0.675ppb, 2.025ppb
एल स्पाइकिंग मानक नियंत्रण: (1 मिली/बोतल).......100 पीपीबी
एल केंद्रित एंजाइम संयुग्म 1ml....... लाल टोपी
एल एंजाइम conjugate diluents 10ml………..ग्रीन कैप
एल सब्सट्रेट एक 7 मिलीलीटर ……………………………………..….. सफेद टोपी
एल सबस्ट्रेट बी 7 मिली ……………………………………….. लाल टोपी
एल बंद समाधान 7ml…………………………पीला टोपी
एल 20 × केंद्रित धो समाधान 40 मि.ली
…………………………………………… पारदर्शी टोपी
एल 2 × केंद्रित निष्कर्षण समाधान 60 मिलीलीटर ... नीली टोपी
एल 2-नाइट्रोबेंजाल्डिहाइड 15.1mg ……………… सफेद टोपी
- 7.अभिकर्मकों की तैयारी
समाधान 1: व्युत्पन्न अभिकर्मक:
2-नाइट्रोबेंजाल्डिहाइड वाली बोतल में 10 मिली मेथेनॉल मिलाएं और घोलें।(10mM की एकाग्रता पर)।
समाधान 2: 0.1 एमके2एचपीओ4उपाय:
वजन 22.8 ग्राम के2एचपीओ4.3एच2भंग करने के लिए ओ से 1 एल विआयनीकृत पानी।
समाधान 3: 1 एम एचसीएल समाधान
8.3 मिलीलीटर केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड को भंग करें विआयनीकृत पानी के साथ 100 मि.ली.
समाधान 4:1M NaOH समाधान
100 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के साथ 4g NaOH को भंग करें।
समाधान 5: निष्कर्षण समाधान:
1:1 के आयतन अनुपात में विआयनीकृत पानी के साथ 2×केंद्रित निष्कर्षण घोल को पतला करें।इस समाधान को 1 महीने के लिए 4 ℃ पर संरक्षित किया जा सकता है, जिसका उपयोग नमूनों को निकालने के लिए किया जाएगा।
समाधान 6: धो समाधान:
1:19 के आयतन अनुपात में विआयनीकृत पानी के साथ 20 × केंद्रित धोने के घोल को पतला करें, जिसका उपयोग प्लेटों को धोने के लिए किया जाएगा।यह पतला घोल 1 महीने के लिए 4 ℃ पर संरक्षित किया जा सकता है।
- 8.नमूना तैयारी
8.1ऑपरेशन से पहले सूचना और सावधानियां:
ए) कृपया प्रयोग में एक-बंद युक्तियों का उपयोग करें, और विभिन्न अभिकर्मकों को अवशोषित करते समय युक्तियों को बदलें।
बी) सुनिश्चित करें कि सभी प्रायोगिक उपकरण साफ हैं।
सी) व्युत्पन्न अभिकर्मक को तीन महीने के लिए 2-8 ℃ पर संरक्षित किया जा सकता है;
डी) एचसीएल समाधान को कमरे के तापमान पर 3 महीने तक संरक्षित किया जा सकता है;
ङ) NaOH विलयन को कमरे के तापमान पर 3 महीने तक संरक्षित रखा जा सकता है;
च) अनुपचारित नमूनों को फ्रीज (-20 ℃) में रखें;
छ) उपचारित नमूनों को 24 घंटों के लिए 2-8 ℃ पर अंधेरे में संरक्षित किया जा सकता है।
8.2 पशु ऊतक और जिगर के नमूने:
---- होमोजिनेजर के साथ नमूनों को होमोजेनाइज करें;
---- वजन 1.0 ± 0.05 ग्राम समरूप ऊतक के नमूने को 50 मिली पॉलीस्टीरीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में।4ml विआयनीकृत पानी, 0.5ml 1M HCl समाधान और 100ul व्युत्पन्न अभिकर्मक जोड़ें (समाधान 1 देखें)।इसे 2 मिनट तक हिलाएं।
----37 ℃ रातोंरात (लगभग 16h) पर इनक्यूबेट करें;
---- 5ml 0.1MK जोड़ें2एचपीओ4 (उपाय2), 0.4 मिली 1M NaOH (उपाय4) और 5 मिली एथिल एसीटेट।30s के लिए जोर से हिलाओ;
---- कमरे के तापमान (20-25 ℃) पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, कम से कम 3000 ग्राम;
---- सतह पर तैरनेवाला कार्बनिक चरण के 2.5 मिलीलीटर को 10 मिलीलीटर साफ ग्लास ट्यूब में लें, 50-60 ℃ नाइट्रोजन गैस या रोटरी बाष्पीकरण के साथ सुखाएं;
---- 30s के लिए 1ml n-hexane (या n-heptane), भंवर के साथ सूखे बचे हुए को भंग करें, 1ml निष्कर्षण समाधान जोड़ें (उपाय5), भंवर 1 मिनट, पूरी तरह मिलाएं।
---- कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज (20-25oसी) 5 मिनट के लिए, कम से कम 3000 ग्राम;
---- सतह पर तैरनेवाला कार्बनिक चरण निकालें;परख के लिए सब्सट्रेट जल चरण का 50μl लें।
8.4 शहद
---- 50 मिलीलीटर पॉलीस्टाइरीन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में समरूप शहद के नमूने का 1.0±0.05 ग्राम वजन;
---- 4ml विआयनीकृत पानी, 0.5ml 1M HCl (उपाय3) और 100μl व्युत्पन्न अभिकर्मक (उपाय1);2 मिनट के लिए पूरी तरह हिलाएं;
----37 ℃ रातोंरात (लगभग 16h) पर इनक्यूबेट करें;
---- 5ml 0.1MK जोड़ें2एचपीओ4 (उपाय2), 0.4 मिली 1M NaOH (उपाय4) और 5 मिलीलीटर एथिल एसीटेट, 30 के लिए जमकर हिलाओ;
---- 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (20-25 ℃) पर अपकेंद्रित्र, कम से कम 3000 ग्राम;
---- सतह पर तैरनेवाला कार्बनिक चरण के 2.5 मिलीलीटर को 10 मिलीलीटर साफ कांच की ट्यूब में लें, 50-60 ℃ नाइट्रोजन गैस या रोटरी बाष्पीकरण के साथ सुखाएं;
---- सूखे बचे हुए को 1ml n-hexane (या n-heptane) के साथ भंग करें, 30s के लिए भंवर, 1ml निष्कर्षण समाधान जोड़ें (उपाय5), भंवर 1 मिनट, पूरी तरह मिलाएं।
---- कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र (20-25oसी) 10 मिनट के लिए, कम से कम 3000 ग्राम;
---- सतह पर तैरनेवाला कार्बनिक चरण निकालें;परख के लिए सब्सट्रेट जल चरण का 50μl लें।
- 9.परख प्रक्रिया
9.1परख से पहले नोटिस
9.1.1 सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्मक और माइक्रोवेल कमरे के तापमान (20-25 ℃) पर हैं।
9.1.2 उपयोग के तुरंत बाद बाकी सभी अभिकर्मकों को 2-8 ℃ पर लौटा दें।
9.1.3 microwells को सही ढंग से धोना परख की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है;यह एलिसा विश्लेषण की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता के लिए महत्वपूर्ण कारक है।
9.1.4 प्रकाश से बचें और ऊष्मायन के दौरान माइक्रोवेल्स को कवर करें ।
9.2 परख कदम
9.2.1 30 मिनट से अधिक के लिए सभी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान (20-25 ℃) पर बाहर निकालें, उपयोग से पहले समरूप करें।
9.2.2 आवश्यक माइक्रोवेल्स को बाहर निकालें और बाकी को जिप-लॉक बैग में 2-8 ℃ पर तुरंत वापस कर दें।
9.2.3 सांद्रित धुलाई विलयन और सांद्र निष्कर्षण विलयन को उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर पुन: गर्म किया जाना चाहिए।
9.2.4संख्या:क्रमांकित प्रत्येक माइक्रोवेल स्थिति और सभी मानकों और नमूनों को दो प्रतियों में चलाया जाना चाहिए।मानकों और नमूनों की स्थिति को रिकॉर्ड करें।
9.2.5केंद्रित एंटीबॉडी समाधान का कमजोर पड़ना: 1:10 (1 गुना केंद्रित एंजाइम समाधान: 10 गुना एंजाइम संयुग्म मंदक) के मात्रा अनुपात में एंजाइम संयुग्म मंदक के साथ केंद्रित एंजाइम समाधान को पतला करें।
9.2.6मानक समाधान / नमूना और एंजाइम संयुग्म समाधान जोड़ें: संबंधित कुओं में 50μl मानक समाधान या तैयार नमूना जोड़ें, 50μl एंजाइम संयुग्म समाधान जोड़ें।प्लेट को मैन्युअल रूप से हिलाकर धीरे से मिलाएं और कवर के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
9.2.7धोना: कवर को धीरे से हटाएं और तरल को कुओं से बाहर निकालें और माइक्रोवेल्स को 250μl पतला धोने के घोल से धोएं (उपाय6) 10s के अंतराल पर 4-5 बार।शोषक कागज के साथ अवशिष्ट पानी को अवशोषित करें (बाकी हवा के बुलबुले को अप्रयुक्त टिप के साथ समाप्त किया जा सकता है)।
9.2.8रंगाई: प्रत्येक कुएं में 50μl सब्सट्रेट समाधान ए और 50ul सब्सट्रेट समाधान बी जोड़ें।प्लेट को मैन्युअल रूप से हिलाकर धीरे से मिलाएं और कवर के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (12.8 देखें)।
9.2.11मापना: प्रत्येक कुएं में 50μl स्टॉप सॉल्यूशन डालें।प्लेट को मैन्युअल रूप से हिलाकर धीरे से मिलाएं और 450nm पर अवशोषक को मापें (यह 450/630nm की दोहरी-तरंग दैर्ध्य के साथ माप का सुझाव देता है। स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ने के बाद 5 मिनट के भीतर परिणाम पढ़ें।)
10 परिणाम
10.1प्रतिशत अवशोषण
मानकों और नमूनों के लिए प्राप्त अवशोषक मूल्यों के औसत मूल्यों को पहले मानक (शून्य मानक) के अवशोषण मूल्य से विभाजित किया जाता है और 100% से गुणा किया जाता है।शून्य मानक इस प्रकार 100% के बराबर बना दिया जाता है और अवशोषण मान प्रतिशत में उद्धृत किए जाते हैं।
=
बी --- अवशोषक मानक (या नमूना)
B0 ——अवशोषण शून्य मानक
10.2मानक वक्र
----एक मानक वक्र बनाने के लिए: मानकों के अवशोषण मान को y-अक्ष के रूप में लें, AOZ मानक समाधान (ppb) की सांद्रता के अर्ध लघुगणक को x-अक्ष के रूप में लें।
---- प्रत्येक नमूने (पीपीबी) की एओजेड एकाग्रता, जिसे अंशांकन वक्र से पढ़ा जा सकता है, प्रत्येक नमूने के संबंधित कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा किया जाता है, और नमूना की वास्तविक एकाग्रता प्राप्त की जाती है।
कृपया ध्यान दें:
सभी डेटा कटौती के लिए विशेष सॉफ्टवेयर विकसित किया गया है, जिसे अनुरोध पर प्रदान किया जा सकता है।
विलयन कारक…………………………………………………… 2
10.संवेदनशीलता, सटीकता और सटीकता
संवेदनशीलता: 0.025ppb
पहचान सीमा:
ऊतक (मांसपेशी, यकृत) ………………………… 0.1ppb
शहद------------------------------------------------- -0.1ppb
शुद्धता:
पशु ऊतक (मांसपेशियों और यकृत) ………………… 100 ± 20%
हनी ……………………………… ..……………. 100±20%
शुद्धता:एलिसा किट का सीवी 10% से कम है।
1 1।सूचना
12.1 यदि अभिकर्मकों और नमूनों को कमरे के तापमान (20-25 ℃) में विनियमित नहीं किया गया है, तो मानकों और नमूनों के लिए प्राप्त अवशोषण मूल्यों का माध्य मान कम हो जाएगा।
12.2 माइक्रोवेल्स को असफल पुनरुत्पादन से बचने के लिए चरणों के बीच सूखने की अनुमति न दें और माइक्रोवेल्स होल्डर को टैप करने के तुरंत बाद अगले चरण को संचालित करें।
12.3 उपयोग करने से पहले प्रत्येक अभिकर्मक को धीरे से हिलाएं।
12.4 अपनी त्वचा को स्टॉप सॉल्यूशन से दूर रखें क्योंकि यह 0.5MH है2SO4उपाय।
12.5 पुरानी किट का उपयोग न करें।विभिन्न बैचों के अभिकर्मकों का आदान-प्रदान न करें, अन्यथा यह संवेदनशीलता को गिरा देगा।
12.6 भंडारण की स्थिति: एलिसा किट को 2-8 ℃ पर रखें, फ्रीज न करें।बाकी माइक्रोवेल प्लेट्स को सील करें, सभी इनक्यूबेशन के दौरान सीधे धूप से बचें।माइक्रोटिटर प्लेट्स को कवर करने की सिफारिश की जाती है।
12.7 अधःस्तर विलयन का रंग बदलने पर उसे छोड़ देना चाहिए।यदि शून्य मानक का अवशोषक मान (450/630nm) 0.5 (A450nm<0.5) से कम है तो अभिकर्मक खराब हो सकते हैं।
12.8 सब्सट्रेट समाधान के अतिरिक्त रंगाई प्रतिक्रिया को 15 मिनट की आवश्यकता होती है;यदि रंग निर्धारित करने के लिए बहुत हल्का है तो आप ऊष्मायन समय को 20 मिनट या उससे अधिक तक बढ़ा सकते हैं। कभी भी 25 मिनट से अधिक न हो। इसके विपरीत, ऊष्मायन समय को ठीक से छोटा करें।
12.9 इष्टतम प्रतिक्रिया तापमान 25 ℃ है।उच्च या निम्न तापमान से संवेदनशीलता और अवशोषण मूल्यों में परिवर्तन होगा।
12.भंडारण की स्थिति और भंडारण की अवधि
भंडारण की स्थिति: 2-8 ℃।
भंडारण अवधि: 12 महीने.