pwodwi

1. 1.Jan nou koumanse

Nitrofurans se antibyotik sentetik gwo spectre, ki souvan itilize nan pwodiksyon bèt pou ekselan pwopriyete anti-bakteri ak farmakokinetik li yo.Yo te itilize tou kòm pwomotè kwasans nan kochon, bèt volay ak pwodiksyon akwatik.Nan etid alontèm ak bèt laboratwa endike ke dwòg paran yo ak metabolites yo te montre karakteristik kanserojèn ak mutagenic.Sa a te mennen nan yon entèdiksyon nan nitrofurans pou tretman bèt yo itilize pou pwodiksyon manje.Dwòg nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin ak nitrofurazone te entèdi nan pwodiksyon bèt manje nan Inyon Ewopeyen an 1993, e yo te entèdi itilizasyon furazolidone nan lane 1995.

Analiz de rezidi dwòg nitrofuran yo bezwen baze sou deteksyon metabolit ki mare nan tisi dwòg paran nitrofuran yo.Depi dwòg paran yo metabolize trè rapidman, epi metabolit nitrofuran ki mare nan tisi yo ap kenbe pou yon tan long, metabolit sa yo itilize kòm sib nan deteksyon abi nitrofuran, ki gen ladan metabolit Furazolidone (AOZ), metabolit Furaltadone (AMOZ). ), Nitrofurantoin metabolit (AHD) ak Nitrofurazone metabolit (SEM).

AOZ-résid yo detèmine pi souvan pa LC-MS oswa LC-MS/MS.Anzim imunoassays, konpare ak metòd kwomatografik, montre avantaj konsiderab konsènan sansiblite, limit deteksyon, ekipman teknik ak kondisyon tan.(Pri tan: 45min)

1. 2.Prensip tès la

Twous ELISA sa a fèt pou detekte AOZ ki baze sou prensip imunoessai anzim endirèk-konpetitif.Pwi microtiter yo kouvwi ak kaptire BSA-lye antijèn.AOZ nan echantiyon konkirans ak antijèn ki kouvwi sou plak la mikrotiter pou antikò a te ajoute.Apre adisyon a nan konjige anzim, yo itilize substra kwomojèn epi siyal la mezire pa yon espektrofotomèt.Absòpsyon an se envès pwopòsyonèl ak konsantrasyon AOZ nan echantiyon an.

1. 3.Aplikasyon

Twous sa a ka itilize nan analiz quantitative ak kalitatif nan rezidi AOZ nantisi anima(misk, fwa elatriye), siwo myèl.

1. 4.Reyaksyon kwaze

Furazolidone metabolit (AOZ)……………………..100%

Furaltadone metabolit (AMOZ)…………………………<0.1%

Nitrofurantoin metabolit (AHD)…………………………<0.1%

Nitrofurazone metabolit (SEM)…………………………...…<0.1%

Furazolidone………………………………………………..…16.3%

Furaltadone…………………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon……………………………………………………..…<1%

1. 5.Materyèl ki obligatwa

5.1Ekipman

---- Espektrofotomèt plak mikrotitè (450nm/630nm)

----Rotary evaporator oswa enstriman siye nitwojèn

----Homogenizer / stomacher

----Shaker

---- Vortex mixer

---- Santrifij

---- Balans analitik (induktans: 0.01g)

---- Pipèt gradye: 10ml

----Anpoul pipèt kawotchou

---- Flakon volumetrik: 100ml

---- Flakon vè: 10ml

---- Tib santrifij Polystyrène: 2ml, 50ml

----Mikwopipèt: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multippèt

5.2Reyaktif

---- Acetate etil (AR)

----n-hexane (oswa n-heptane) (AR)

----Dipotasyòm idwojèn fosfat triidrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Konsantre asid idroklorik (HCl, AR)

-----Metanòl

---- Idwoksid sodyòm (NaOH, AR)

----Dlo deyonize

1. 6.Konpozan Twous

l Microtiter plak kouvwi ak antijèn, 96 pwi

l Solisyon estanda (6 boutèy, 1ml / boutèy)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Spiking estanda kontwòl: (1ml / boutèy).......100ppb

l Konjige anzim konsantre 1ml ...... bouchon wouj

l Anzim konjige diluants 10ml………..bouchon vèt

l Substra A 7ml……….............…....…..…..bouchon blan

l Substra B 7ml………..............…........….…..bouchon wouj

l Stop solisyon 7ml…………………………… bouchon jòn

l 20×konsantre lave solisyon 40ml

…………………………………………….……bouchon transparan

l 2×konsantre ekstraksyon solisyon 60ml….blue bouchon

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………bouchon blan

1. 7.Preparasyon reyaktif

Solisyon 1: reyaktif derive:

Ajoute 10ml metanol nan boutèy la ki gen 2-Nitrobenzaldehyde epi fonn.(nan konsantrasyon 10mM).

Solisyon 2: 0.1MK₂HPO₄solisyon:

Peze 22.8g K₂HPO₄.3H₂O a 1L dlo deyonize pou fonn.

Solisyon 3: 1M HCl solisyon

Fonn 8.3ml asid idroklorik konsantre ak dlo deyonize a 100ml.

Solisyon 4:1M NaOH solisyon

Fonn 4g NaOH ak 100ml dlo deyonize.

Solisyon 5: solisyon ekstraksyon:

Delye 2 × solisyon ekstraksyon konsantre ak dlo deyonize nan rapò volim 1:1.Solisyon sa a ka konsève pou 1 mwa nan 4 ℃, ki pral itilize pou ekstrè echantiyon.

Solisyon 6: solisyon lave :

Delye 20 × solisyon lave konsantre ak dlo deyonize nan volim 1:19, ki pral itilize pou lave plak yo.Solisyon dilye sa a ka konsève pou 1 mwa nan 4 ℃.

1. 8.Egzanp Preparasyon

8.1Avi ak prekosyon anvan operasyon:

a) Tanpri itilize konsèy yon sèl nan eksperyans la, epi chanje konsèy yo lè absòbe diferan reyaktif.

b) Asire w ke tout enstriman eksperimantal yo pwòp.

c) reyaktif derive a ka konsève nan 2-8 ℃ pou twa mwa;

d) Solisyon HCl la ka konsève nan tanperati chanm pou 3 mwa;

e) Yo ka konsève solisyon NaOH pou 3 mwa nan tanperati chanm;

f) Kenbe echantiyon ki pa trete nan friz (-20 ℃);

g) Echantiyon trete yo ka konsève pou 24 èdtan nan 2-8 ℃ nan fènwa.

8.2 Tisi bèt ak echantiyon fwa:

----Omojenize echantiyon yo avèk omojenize;

----Pwa 1.0±0.05g echantiyon tisi omojenize a nan tib santrifij 50ml polystyrène.Ajoute 4ml dlo deyonize, 0.5ml 1M HCl solisyon ak 100ul reyaktif derive (gade solisyon 1).Souke li pou 2min.

---- Enkube nan 37 ℃ lannwit lan (apeprè 16h);

---- Ajoute 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solisyon2), 0.4ml 1M NaOH (solisyon4) ak 5ml acetate etil.Souke fò pou 30s;

---- Santrifije nan tanperati chanm (20-25 ℃) pou 10min, omwen 3000g;

---- Pran 2.5ml faz òganik supernatant nan yon tib an vè 10ml pwòp, sèk ak 50-60 ℃ gaz nitwojèn oswa evaporateur rotary;

---- Fonn rès sèk la ak 1ml n-hexane (oswa n-heptane), vortex pou 30s, ajoute 1ml solisyon ekstraksyon (solisyon5), vortex 1min, melanje nèt.

---- Santrifije nan tanperati chanm (20-25^oC) pou 5min, omwen 3000g;

---- Retire faz òganik supernatant la;pran 50μl nan faz dlo a substra pou tès.

8.4 Siwo myèl

---- peze 1.0±0.05g echantiyon siwo myèl omojenize a nan yon tib santrifujeur 50ml polystyrène;

----Ajoute 4ml dlo deyonize, 0.5ml 1M HCl (solisyon3) ak 100μl reyaktif derive (solisyon1);souke nèt pou 2min;

----Enkube nan 37 ℃ lannwit lan (apeprè 16h);

----Ajoute 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solisyon2), 0.4ml 1M NaOH (solisyon4) ak 5ml acetate etil, souke fò pou 30s;

---- Santrifij nan tanperati chanm (20-25 ℃) pou 10min, omwen 3000g;

----Pran 2.5ml faz òganik supernatant nan yon tib an vè 10ml pwòp, sèk ak 50-60 ℃ gaz nitwojèn oswa evaporateur rotary;

---- Fonn rès sèk la ak 1ml n-hexane (oswa n-heptane), vortex pou 30s, ajoute 1ml solisyon ekstraksyon (solisyon5), vortex 1min, melanje nèt.

---- Santrifije nan tanperati chanm (20-25^oC) pou 10min, omwen 3000g;

---- Retire faz òganik supernatant la;pran 50μl nan faz dlo a substra pou tès.

1. 9.Pwosesis tès

9.1Avi anvan tès la

9.1.1 Asire w ke tout reyaktif ak microwells yo tout nan tanperati chanm (20-25 ℃).

9.1.2 Retounen tout rès reyaktif yo nan 2-8 ℃ imedyatman apre yo fin itilize yo.

9.1.3 Lave microwells yo kòrèkteman se yon etap enpòtan nan pwosesis tès la;li se faktè ki enpòtan anpil nan repwodiksyon analiz ELISA.

9.1.4 Evite limyè a epi kouvri microwells yo pandan enkubasyon.

9.2 Etap tès yo

9.2.1 Retire tout reyaktif nan tanperati chanm (20-25 ℃) pou plis pase 30min, omojeneize anvan ou itilize.

9.2.2 Retire mikwo-puits ki nesesè yo epi retounen rès la nan sak zip-lock la nan 2-8 ℃ imedyatman.

9.2.3 Solisyon lave konsantre ak solisyon ekstraksyon konsantre yo ta dwe rechofe yo nan tanperati chanm anvan ou itilize.

9.2.4Nimewo:Nimero chak pozisyon microwell ak tout estanda ak echantiyon yo ta dwe kouri an kopi.Ekri estanda yo ak pozisyon echantiyon yo.

9.2.5Dilution nan solisyon antikò konsantre: delye solisyon an anzim konsantre ak diluants anzim konjige nan rapò volim nan 1:10 (1 pliye solisyon anzim konsantre: 10 pliye diluants anzim konjige).

9.2.6Ajoute solisyon estanda / echantiyon ak solisyon konjige anzim: ajoute 50µl solisyon estanda oswa echantiyon prepare nan pwi korespondan yo, ajoute 50µl solisyon konjige anzim.Melanje dousman pa souke plak la manyèlman epi enkube pou 30min nan 25 ℃ ak kouvèti.

9.2.7Lave: Retire kouvèti a dousman epi vide likid la soti nan pwi yo epi rense mikwo-puits yo ak 250µl solisyon lave dilye (solisyon6) nan entèval 10s pou 4-5 fwa.Absòbe dlo rezidyèl la ak papye absòbe (ti ti wonn lè rès la ka elimine ak pwent ki pa itilize).

9.2.8Kolorasyon: Ajoute 50µl substrate solisyon A ak 50ul substrate solisyon B nan chak pi.Melanje dousman pa balanse plak la manyèlman epi enkube pou 15min nan 25 ℃ ak kouvèti (gade 12.8).

9.2.11Mezire: Ajoute 50µl solisyon stop la nan chak pi.Melanje dousman pa balanse plak la manyèlman epi mezire absorpsyon an nan 450nm (Li sijere mezire ak longèdonn an doub nan 450/630nm. Li rezilta a nan 5min apre adisyon nan solisyon sispann. )

10 Rezilta yo

10.1Pousantaj absòbe

Valè mwayen valè absòbe yo jwenn pou estanda yo ak echantiyon yo divize pa valè absòbe premye estanda (zewo estanda) epi miltipliye pa 100%.Se estanda zewo a ki egal a 100% ak valè absòbe yo site an pousantaj.

=

B ——estanda absòpsyon (oswa echantiyon)

B0 ——absòbsyon zewo estanda

10.2Koub estanda

----Pou trase yon koub estanda: Pran valè absòbe estanda yo kòm aks y, semi logaritmik nan konsantrasyon solisyon estanda AOZ (ppb) kòm aks x.

----Konsantrasyon AOZ nan chak echantiyon (ppb), ki ka li nan koub kalibrasyon an, miltipliye pa faktè dilution korespondan chak echantiyon ki te swiv, epi yo jwenn konsantrasyon aktyèl echantiyon an.

Tanpri remake:

Lojisyèl espesyal yo te devlope pou tout rediksyon done, ki ka bay sou demann.

Faktè dilution…………………………………………………2

10.Sansiblite, presizyon ak presizyon

Sansiblite: 0.025ppb

Limit deteksyon:

Tisi (misk, fwa)………………………… 0.1ppb

siwo myèl------------------------------------------------- -0.1ppb

Presizyon:

Tisi bèt (misk ak fwa)…………………100±20%

Siwo myèl………………………………………..………….... 100±20%

Presizyon:CV nan twous ELISA a se mwens pase 10%.

11.Avi

12.1 Valè mwayèn valè absòbe yo jwenn pou estanda yo ak echantiyon yo ap redwi si reyaktif yo ak echantiyon yo pa te reglemante nan tanperati chanm (20-25 ℃).

12.2 Pa kite mikwo-puits yo sèk ant etap pou evite repwodiksyon san siksè epi opere pwochen etap la imedyatman apre tape detantè mikwo-puits la.

12.3 Souke chak reyaktif dousman anvan w itilize.

12.4 Kenbe po ou lwen solisyon an sispann paske li se 0.5MH la₂SO₄solisyon.

12.5 Pa sèvi ak twous yo demode.Pa fè echanj reyaktif diferan pakèt, oswa sinon li pral lage sansiblite a.

12.6 Kondisyon depo: Kenbe twous ELISA yo nan 2-8 ℃, pa friz.Sele plak mikwopuit rès yo, Evite limyè solèy la dwat pandan tout enkubasyon yo.Li rekòmande kouvri plak mikrotiter yo.

12.7 Yo ta dwe abandone solisyon substrate si li vire koulè.Reyaktif yo ka deteryore si valè absòbe (450/630nm) estanda zewo a se mwens pase 0.5 (A450nm <0.5).

12.8 Reyaksyon kolorasyon an bezwen 15min apre adisyon a nan solisyon substra;Ou ka pwolonje tan an enkubasyon a 20min oswa plis si koulè a ​​twò limyè yo dwe detèmine., pa janm depase 25min.Okontrè, diminye tan an enkubasyon byen.

12.9 Tanperati reyaksyon pi bon an se 25 ℃.Tanperati ki pi wo oswa pi ba ap mennen nan chanjman nan valè sansiblite ak absòbe.

12.Kondisyon depo ak peryòd depo

Kondisyon depo: 2-8 ℃.

Peryòd depo: 12 mwa.