արտադրանք

1. 1.Նախապատմություն

Նիտրոֆուրանները սինթետիկ լայն սպեկտրի հակաբիոտիկներ են, որոնք հաճախ օգտագործվում են կենդանիների արտադրության մեջ՝ իրենց հիանալի հակաբակտերիալ և ֆարմակոկինետիկ հատկությունների համար:Դրանք նաև օգտագործվել են որպես աճի խթանիչներ խոզերի, թռչնամսի և ջրային մսի արտադրության մեջ:Լաբորատոր կենդանիների հետ երկարաժամկետ հետազոտությունների ընթացքում ցույց են տվել, որ հիմնական դեղամիջոցները և դրանց մետաբոլիտները ցույց են տվել քաղցկեղածին և մուտագեն հատկություններ:Սա հանգեցրել է սննդի արտադրության համար օգտագործվող կենդանիների բուժման համար նիտրոֆուրանների արգելմանը:Նիտրոֆուրանային ֆուրալտադոնը, նիտրոֆուրանտոինը և նիտրոֆուրազոնը արգելվել են օգտագործել սննդամթերքի կենդանիների արտադրության մեջ ԵՄ-ում 1993 թվականին, իսկ ֆուրազոլիդոնի օգտագործումն արգելվել է 1995 թվականին:

Նիտրոֆուրանի դեղերի մնացորդի վերլուծությունը պետք է հիմնված լինի նիտրոֆուրանի հիմնական դեղամիջոցների հյուսվածքային մետաբոլիտների հայտնաբերման վրա:Քանի որ հիմնական դեղամիջոցները շատ արագ են մետաբոլիզացվում, և հյուսվածքի հետ կապված նիտրոֆուրանի մետաբոլիտները երկար ժամանակ կպահպանվեն, այս մետաբոլիտները օգտագործվում են որպես թիրախ նիտրոֆուրանների չարաշահման հայտնաբերման համար, որոնք ներառում են Furazolidone մետաբոլիտ (AOZ), Furaltadone մետաբոլիտ (AMOZ): ), Nitrofurantoin մետաբոլիտ (AHD) և Nitrofurazone metabolite (SEM):

AOZ-ի մնացորդները որոշվում են առավել հաճախ LC-MS կամ LC-MS/MS միջոցով:Ֆերմենտային իմունային անալիզները, համեմատած քրոմատոգրաֆիկ մեթոդների հետ, ցույց են տալիս զգալի առավելություններ՝ կապված զգայունության, հայտնաբերման սահմանի, տեխնիկական սարքավորումների և ժամանակի պահանջի հետ:(Ժամանակի արժեքը՝ 45 րոպե)

1. 2.Փորձարկման սկզբունք

Այս ELISA հավաքածուն նախագծված է AOZ-ի հայտնաբերման համար՝ հիմնվելով անուղղակի-մրցակցային ֆերմենտային իմունային հետազոտության սկզբունքի վրա:Միկրոտիտրային հորերը պատված են BSA-ի հետ կապված հակագենով:Նմուշում AOZ-ը մրցում է միկրոտիտրային ափսեի վրա պատված հակագենի հետ՝ ավելացված հակամարմինների համար:Ֆերմենտի կոնյուգատի ավելացումից հետո օգտագործվում է քրոմոգեն սուբստրատ, և ազդանշանը չափվում է սպեկտրոֆոտոմետրով:Կլանումը հակադարձ համեմատական ​​է նմուշի AOZ կոնցենտրացիայի հետ:

1. 3.Դիմումներ

Այս փաթեթը կարող է օգտագործվել AOZ մնացորդի քանակական և որակական վերլուծության մեջանիմա հյուսվածքներ(մկաններ, լյարդ և այլն), մեղր:

1. 4.Խաչաձև ռեակցիաներ

Ֆուրազոլիդոն մետաբոլիտ (AOZ)…………………………………………………………………………………………………

Ֆուրալտադոն մետաբոլիտ (AMOZ)……………………<0,1%

Նիտրոֆուրանտոին մետաբոլիտ (AHD)……………………<0,1%

Նիտրոֆուրազոն մետաբոլիտ (SEM)………………………<0,1%

Ֆուրազոլիդոն………………………………………………….. 16.3%

Ֆուրալտադոն………………………………………………<1%

Նիտրոֆուրանտոին……………………………………………<1%

Նիտրոֆուրազոն………………………………………………<1%

1. 5.Պահանջվող նյութեր

5.1Սարքավորումներ

----Միկրոտիտրային թիթեղային սպեկտրոֆոտոմետր (450նմ/630նմ)

---- Պտտվող գոլորշիացնող կամ ազոտի չորացման գործիքներ

----Համասեռացնող /ստամոքիչ

----Թափահարող

----Վորտեքս խառնիչ

----Ցենտրիֆուգ

----Անալիտիկ հաշվեկշիռ (ինդուկտիվություն՝ 0,01գ)

----Գրաֆիկացված պիպետտ՝ 10մլ

----Ռետինե խողովակի լամպ

----Ծավալային կոլբա՝ 100մլ

----Ապակե կոլբա՝ 10մլ

----Պոլիստիրոլային ցենտրիֆուգային խողովակ՝ 2մլ, 50մլ

----Միկրոպիպետներ՝ 20ուլ-200ուլ, 100ուլ-1000ուլ,

250ուլ-մուլտիպիպետտ

5.2Ռեակտիվներ

----Էթիլացետատ (AR)

----n-հեքսան (կամ n-հեպտան) (AR)

----Դիկալիումի ջրածնային ֆոսֆատ տրիհիդրատ

(K₂HPO₄.3Հ₂O) (AR)

----Խիտ աղաթթու (HCl, AR)

-----Մեթանոլ

----Նատրիումի հիդրօքսիդ (NaOH, AR)

----Դիոնացված ջուր

1. 6.Հավաքածուի բաղադրիչներ

լ Microtiter ափսե պատված հակագենով, 96 հորեր

լ Ստանդարտ լուծույթներ (6 շիշ, 1 մլ/շիշ)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Spiking ստանդարտ հսկողություն. (1 մլ/շիշ).........100 ppb

լ Խտացված ֆերմենտային կոնյուգատ 1մլ.........կարմիր գլխարկ

l Ֆերմենտային կոնյուգատ նոսրացուցիչներ 10մլ………..կանաչ գլխարկ

լ Ենթաշերտ A 7մլ……………………………..սպիտակ գլխարկ

լ Ենթաշերտ B 7մլ………………………………..կարմիր գլխարկ

l Ստոպ լուծույթ 7 մլ……………………………………դեղին գլխարկ

լ 20×խտացված լվացքի լուծույթ 40մլ

……………………………………………թափանցիկ գլխարկ

լ 2×խտացված արդյունահանման լուծույթ 60 մլ….կապույտ գլխարկ

լ 2-Նիտրոբենզալդեհիդ 15.1մգ………………սպիտակ գլխարկ

1. 7.Ռեակտիվների պատրաստում

Լուծում 1ածանցյալ ռեագենտ:

2-Նիտրոբենզալդեհիդ պարունակող շշի մեջ ավելացրեք 10 մլ մեթանոլ և լուծեք:(10 մՄ կոնցենտրացիայով):

Լուծում 20,1 մլն₂HPO₄լուծում:

Քաշը 22,8 գ Կ₂HPO₄.3Հ₂O-ից մինչև 1 լ դեոնացված ջուր լուծարելու համար:

Լուծում 31 մ HCl լուծույթ

Լուծել 8,3 մլ խտացված աղաթթու դեիոնացված ջրով մինչև 100մլ.

Լուծում 4:1 մ NaOH լուծույթ

4 գ NaOH լուծեք 100 մլ դեիոնացված ջրով:

Լուծում 5արդյունահանման լուծույթ.

Նոսրացրեք 2×խտացված արդյունահանման լուծույթը դեիոնացված ջրով 1:1 ծավալային հարաբերակցությամբ:Այս լուծույթը կարող է պահպանվել 1 ամիս 4℃ ջերմաստիճանում, որը կօգտագործվի արդյունահանվող նմուշների համար:

Լուծում 6Լվացքի լուծույթ.

20×խտացված լվացքի լուծույթը նոսրացրեք դեոնացված ջրով 1:19 ծավալային հարաբերակցությամբ, որը կօգտագործվի ափսեները լվանալու համար:Այս նոսրացված լուծույթը կարող է պահպանվել 1 ամիս 4℃ ջերմաստիճանում:

1. 8.Նմուշի պատրաստուկներ

8.1Ծանուցում և նախազգուշական միջոցներ գործարկումից առաջ.

ա) Փորձի ժամանակ օգտագործեք միանվագ խորհուրդներ և փոխեք խորհուրդները տարբեր ռեակտիվներ կլանելիս:

բ) Համոզվեք, որ բոլոր փորձարարական գործիքները մաքուր են:

գ) ածանցյալ ռեագենտը կարող է պահպանվել 2-8℃ ջերմաստիճանում երեք ամիս.

դ) HCl լուծույթը կարող է պահպանվել սենյակային ջերմաստիճանում 3 ամիս.

ե) NaOH լուծույթը կարող է պահպանվել 3 ամիս սենյակային ջերմաստիճանում.

զ) չմշակված նմուշները պահել սառեցված վիճակում (-20℃);

է) Մշակված նմուշները կարող են պահպանվել 24 ժամ 2-8℃ ջերմաստիճանում մթության մեջ:

8.2 Կենդանական հյուսվածքի և լյարդի նմուշներ.

---- Նմուշները համասեռացնել միատարրացուցիչով;

---- Համասեռացված հյուսվածքի նմուշի 1,0±0,05 գ քաշը 50 մլ պոլիստիրոլի ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ:Ավելացնել 4 մլ դեիոնացված ջուր, 0,5 մլ 1M HCl լուծույթ և 100 մլ ածանցյալ ռեագենտ (տես լուծույթ 1):Թափահարել 2 րոպե։

---- Ինկուբացնել 37℃ ջերմաստիճանում մեկ գիշերում (մոտ 16ժ);

---- Ավելացնել 5մլ 0.1MK₂HPO₄ (լուծում2), 0,4 մլ 1 մ NaOH (լուծում4) և 5 մլ էթիլացետատ:Ուժեղ թափահարում է 30 վայրկյան;

---- Ցենտրիֆուգել սենյակային ջերմաստիճանում (20-25℃) 10 րոպե, առնվազն 3000գ;

---- Վերցրեք 2,5 մլ գերնույն օրգանական փուլը 10 մլ մաքուր ապակե խողովակի մեջ, չորացրեք 50-60℃ ազոտային գազով կամ պտտվող գոլորշիչով;

---- Չոր մնացորդը լուծել 1մլ n-հեքսանով (կամ n-հեպտանով), պտտեցնել 30 վրկ, ավելացնել 1մլ արդյունահանման լուծույթ (լուծում5), պտտեցնել 1 րոպե, ամբողջությամբ խառնել։

---- Ցենտրիֆուգեք սենյակային ջերմաստիճանում (20-25^oգ) 5 րոպե, առնվազն 3000 գ;

---- Հեռացնել վերին օրգանական փուլը;Վերցրեք 50 մկլ ենթաշերտի ջրի փուլը վերլուծության համար:

8.4 Մեղր

---- կշռել 1,0±0,05 գ միատարր մեղրի նմուշը 50 մլ պոլիստիրոլի ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ;

----Ավելացրեք 4 մլ դեոնացված ջուր, 0,5 մլ 1 մ HCl (լուծում3) և 100 մկլ ածանցյալ ռեագենտ (լուծում1);ամբողջությամբ թափահարել 2 րոպե;

---- Ինկուբացիա 37℃ ջերմաստիճանում գիշերում (մոտ 16ժ);

----Ավելացրեք 5մլ 0.1MK₂HPO₄ (լուծում2), 0,4 մլ 1 մ NaOH (լուծում4) և 5 մլ էթիլացետատ, ուժեղ թափահարեք 30 վրկ.

----Ցենտրիֆուգել սենյակային ջերմաստիճանում (20-25℃) 10 րոպե, առնվազն 3000գ;

---- Վերցրեք 2,5 մլ գերնույն օրգանական փուլը 10 մլ մաքուր ապակե խողովակի մեջ, չորացրեք 50-60℃ ազոտային գազով կամ պտտվող գոլորշիչով;

----Չոր մնացորդը լուծել 1մլ n-հեքսանով (կամ n-հեպտանով), պտտեցնել 30 վրկ, ավելացնել 1մլ արդյունահանման լուծույթ (լուծում5), պտտեցնել 1 րոպե, ամբողջությամբ խառնել։

----Ցենտրիֆուգեք սենյակային ջերմաստիճանում (20-25^oգ) 10 րոպե, առնվազն 3000 գ;

----Հեռացնել վերին օրգանական փուլը;Վերցրեք 50 մկլ ենթաշերտի ջրի փուլը վերլուծության համար:

1. 9.Վերլուծության գործընթացը

9.1Ուշադրություն դարձրեք վերլուծությունից առաջ

9.1.1 Համոզվեք, որ բոլոր ռեակտիվները և միկրոհորերը գտնվում են սենյակային ջերմաստիճանում (20-25℃):

9.1.2 Օգտագործելուց անմիջապես հետո մնացած բոլոր ռեակտիվները վերադարձրեք 2-8℃ ջերմաստիճանի:

9.1.3 Միկրոհորերի ճիշտ լվացումը կարևոր քայլ է վերլուծության գործընթացում.դա ELISA վերլուծության վերարտադրելիության կենսական գործոնն է:

9.1.4 Խուսափեք լույսից և ծածկեք միկրոհորերը ինկուբացիայի ընթացքում:

9.2 Վերլուծության քայլեր

9.2.1 Բոլոր ռեակտիվները դուրս հանեք սենյակային ջերմաստիճանում (20-25℃) ավելի քան 30 րոպե, օգտագործելուց առաջ միատարրացրեք:

9.2.2 Դուրս հանեք անհրաժեշտ միկրոհորերը և անմիջապես վերադարձրեք մնացածը 2-8℃ ջերմաստիճանի տակ գտնվող կայծակաճարմանդ տոպրակի մեջ:

9.2.3 Լվացքի խտացված լուծույթը և խտացված արդյունահանման լուծույթը օգտագործելուց առաջ պետք է նորից տաքացվեն, որպեսզի դրանք լինեն սենյակային ջերմաստիճանում:

9.2.4Թիվ:Յուրաքանչյուր միկրոհորի համարակալված դիրքերը և բոլոր ստանդարտներն ու նմուշները պետք է գործարկվեն կրկնօրինակով:Գրանցեք ստանդարտների և նմուշների դիրքերը:

9.2.5Խտացված հակամարմինների լուծույթի նոսրացումԽտացված ֆերմենտային լուծույթը նոսրացրեք ֆերմենտային կոնյուգատի նոսրացուցիչներով 1:10 ծավալային հարաբերակցությամբ (1 անգամ խտացված ֆերմենտային լուծույթ. 10 անգամ ֆերմենտային կոնյուգատային լուծիչներ):

9.2.6Ավելացնել ստանդարտ լուծույթ / նմուշ և ֆերմենտային կոնյուգատի լուծույթհամապատասխան հորերին ավելացնել 50 մկլ ստանդարտ լուծույթ կամ պատրաստված նմուշ, ավելացնել 50 մկլ ֆերմենտային կոնյուգատի լուծույթ:Մեղմորեն խառնել՝ ձեռքով թափահարելով ափսեը և ինկուբացնել 30 րոպե 25℃ ջերմաստիճանում ծածկով:

9.2.7ԼվանալՀեռացրեք ծածկը նրբորեն և հեղուկը լցրեք հորերից և ողողեք միկրոհորերը 250 մկլ նոսրացված լվացքի լուծույթով (լուծում6) 10 վրկ ընդմիջումով 4-5 անգամ:Կլանեք մնացորդային ջուրը ներծծող թղթով (մնացած օդի պղպջակը կարելի է հեռացնել չօգտագործված ծայրով):

9.2.8ԳունավորումՅուրաքանչյուր հորին ավելացրեք 50 մկլ ենթաշերտի լուծույթ A և 50 մլ ենթաշերտի լուծույթ B:Մեղմորեն խառնել՝ ձեռքով ճոճելով ափսեը և 15 րոպե 25℃ ջերմաստիճանում ինկուբացնել ծածկով (տես 12.8):

9.2.11ՉափելՅուրաքանչյուր հորի մեջ ավելացրեք 50 մկլ կանգառի լուծույթ:Նրբորեն խառնեք՝ ձեռքով օրորելով թիթեղը և չափեք ներծծումը 450 նմ-ով (Առաջարկվում էր չափել 450/630 նմ երկակի ալիքի երկարությամբ: Կարդացեք արդյունքը կանգառի լուծույթի ավելացումից հետո 5 րոպեի ընթացքում):

10 Արդյունքներ

10.1Տոկոսային կլանումը

Ստանդարտների և նմուշների համար ստացված կլանման արժեքների միջին արժեքները բաժանվում են առաջին ստանդարտի կլանման արժեքի վրա (զրոյական ստանդարտ) և բազմապատկվում 100%-ով:Այսպիսով, զրոյական ստանդարտը հավասար է 100%-ի, իսկ կլանման արժեքները բերվում են տոկոսներով:

=

B —— կլանման ստանդարտ (կամ նմուշ)

B0 —— կլանման զրոյական ստանդարտ

10.2Ստանդարտ կոր

----Ստանդարտ կորը գծելու համար. Ստանդարտների կլանման արժեքը որպես y առանցք, AOZ ստանդարտ լուծույթի (ppb) կոնցենտրացիայի կիսալոգարիթմական, որպես x առանցք:

----Յուրաքանչյուր նմուշի AOZ կոնցենտրացիան (ppb), որը կարելի է կարդալ տրամաչափման կորից, բազմապատկվում է յուրաքանչյուր հաջորդ նմուշի համապատասխան նոսրացման գործակցով, և ստացվում է նմուշի փաստացի կոնցենտրացիան:

Խնդրում ենք նկատի ունենալ.

Բոլոր տվյալների կրճատման համար մշակվել է հատուկ ծրագրակազմ, որը կարող է տրամադրվել ըստ պահանջի:

Նոսրացման գործոն……………………………………………………2

10.Զգայունություն, ճշգրտություն և ճշգրտություն

Զգայունություն: 0,025 ppb

Հայտնաբերման սահմանաչափ.

Հյուսվածք (մկան, լյարդ) …………………………… 0.1 ppb

Մեղր------------------------------------------------ -0.1ppb

Ճշգրտություն:

Կենդանիների հյուսվածք (մկաններ եւ լյարդ) ...... ... ............ 100 ± 20%

Մեղր……………………………………………… 100±20%

Ճշգրտություն:ELISA հավաքածուի CV-ն 10%-ից պակաս է:

11.Ծանուցում

12.1 Ստանդարտների և նմուշների համար ստացված կլանման արժեքների միջին արժեքները կնվազեն, եթե ռեակտիվները և նմուշները չեն կարգավորվել սենյակային ջերմաստիճանում (20-25℃):

12.2 Թույլ մի տվեք, որ միկրոհորերը չորանան քայլերի միջև, որպեսզի խուսափեք անհաջող վերարտադրողականությունից և գործարկեք հաջորդ քայլը միկրոհորերի ամրացմանը հպելուց անմիջապես հետո:

12.3 Օգտագործելուց առաջ յուրաքանչյուր ռեագենտ նրբորեն թափահարեք:

12.4 Ձեր մաշկը հեռու պահեք կանգառի լուծույթից, քանի որ այն 0,5 ՄՀ է₂SO₄լուծում.

12.5 Մի օգտագործեք հնացած փաթեթները:Մի փոխեք տարբեր խմբաքանակների ռեագենտները, հակառակ դեպքում դա կնվազեցնի զգայունությունը:

12.6 Պահպանման պայման. ELISA փաթեթները պահեք 2-8℃ ջերմաստիճանում, մի սառչեք:Կնքեք մնացած միկրոհորերի թիթեղները, Խուսափեք արևի ուղիղ ճառագայթներից բոլոր ինկուբացիաների ընթացքում:Խորհուրդ է տրվում ծածկել միկրոտիտրային թիթեղները:

12.7 Ենթաշերտի լուծույթը պետք է հրաժարվել, եթե այն գունավորվում է:Ռեակտիվները կարող են քայքայվել, եթե զրոյական ստանդարտի կլանման արժեքը (450/630 նմ) ​​փոքր է 0,5-ից (A450nm<0,5):

12.8 Գունավորման ռեակցիայի համար անհրաժեշտ է 15 րոպե սուբստրատի լուծույթի ավելացումից հետո;Դուք կարող եք երկարացնել ինկուբացիոն ժամանակը մինչև 20 րոպե կամ ավելի, եթե գույնը չափազանց բաց է որոշելու համար: Երբեք մի գերազանցեք 25 րոպեն: Ընդհակառակը, պատշաճ կերպով կրճատեք ինկուբացիոն ժամանակը:

12.9 Օպտիմալ ռեակցիայի ջերմաստիճանը 25℃ է:Ավելի բարձր կամ ցածր ջերմաստիճանը կհանգեցնի զգայունության և կլանման արժեքների փոփոխության:

12.Պահպանման պայմանները և պահպանման ժամկետը

Պահպանման վիճակ՝ 2-8℃։

Պահպանման ժամկետը՝ 12 ամիս.