produk

1. 1.Latar belakang

Nitrofuran adalah antibiotik spektrum luas sintetik, yang sering digunakan dalam produksi hewan karena sifat antibakteri dan farmakokinetiknya yang sangat baik.Mereka juga telah digunakan sebagai promotor pertumbuhan pada babi, unggas dan produksi air.Dalam studi jangka panjang dengan hewan laboratorium menunjukkan bahwa obat induk dan metabolitnya menunjukkan karakteristik karsinogenik dan mutagenik.Hal ini menyebabkan pelarangan nitrofuran untuk pengobatan hewan yang digunakan untuk produksi makanan.Obat nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin dan nitrofurazone dilarang digunakan dalam produksi makanan hewan di UE pada tahun 1993, dan penggunaan furazolidone dilarang pada tahun 1995.

Analisis residu obat nitrofuran perlu didasarkan pada deteksi metabolit terikat jaringan dari obat induk nitrofuran.Karena obat induk dimetabolisme dengan sangat cepat, dan metabolit nitrofuran yang terikat jaringan akan bertahan untuk waktu yang lama, metabolit ini digunakan sebagai target dalam mendeteksi penyalahgunaan nitrofuran, yang meliputi metabolit Furazolidone (AOZ), metabolit Furaltadone (AMOZ ), Metabolit Nitrofurantoin (AHD) dan Metabolit Nitrofurazon (SEM).

Residu AOZ paling sering ditentukan oleh LC-MS atau LC-MS/MS.Immunoassay enzim, dibandingkan dengan metode kromatografi, menunjukkan keuntungan yang cukup besar mengenai sensitivitas, batas deteksi, peralatan teknis, dan persyaratan waktu.(Biaya waktu: 45 menit)

1. 2.Prinsip Uji

Kit ELISA ini dirancang untuk mendeteksi AOZ berdasarkan prinsip immunoassay enzim persaingan tidak langsung.Sumur mikrotiter dilapisi dengan antigen yang terhubung dengan BSA.AOZ dalam sampel bersaing dengan antigen yang dilapisi pada pelat mikrotiter untuk penambahan antibodi.Setelah penambahan konjugat enzim, substrat kromogenik digunakan dan sinyal diukur dengan spektrofotometer.Penyerapan berbanding terbalik dengan konsentrasi AOZ dalam sampel.

1. 3.Aplikasi

Kit ini dapat digunakan dalam analisis kuantitatif dan kualitatif residu AOZjaringan hewan(otot, hati dll), sayang.

1. 4.Reaksi silang

Metabolit Furazolidone (AOZ)……………………..100%

Metabolit Furaltadon (AMOZ)………………………<0,1%

Metabolit nitrofurantoin (AHD)………………………<0,1%

Metabolit nitrofurazon (SEM)………………………...…<0,1%

Furazolidon…………………………………….…..…16,3%

Furaltadon…………………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon………………………………………………..…<1%

1. 5.Bahan yang Dibutuhkan

5.1Peralatan

---- Spektrofotometer pelat mikrotiter (450nm/630nm)

---- Rotary evaporator atau instrumen pengering nitrogen

---- Homogenizer / perut

----Pengocok

---- Pencampur pusaran

---- Sentrifugal

---- Neraca analitik (induktansi: 0,01g)

---- Pipet lulus: 10ml

---- Bohlam pipet karet

---- Labu volumetrik: 100ml

---- Labu kaca: 10ml

---- Tabung centrifuge polistiren: 2ml, 50ml

---- Mikropipet: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipet

5.2Reagen

----Etil asetat (AR)

----n-heksana (atau n-heptana) (AR)

---- Dipotassium hidrogen fosfat trihidrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Asam klorida pekat (HCl, AR)

----- Metanol

---- Natrium hidroksida (NaOH, AR)

---- Air deionisasi

1. 6.Komponen Kit

l Pelat mikrotiter dilapisi dengan antigen, 96 sumur

l Larutan standar (6 botol, 1ml/botol)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Kontrol standar spiking : (1ml/botol).....….100ppb

l Enzim konjugat pekat 1ml...…..tutup merah

l Pengencer konjugasi enzim 10ml………..tutup hijau

l Substrat A 7ml………..............…....…..…..tutup putih

l Substrat B 7ml………..............…........….…..tutup merah

l Hentikan larutan 7ml……………………………… tutup kuning

l 20×larutan pencuci pekat 40ml

……………………………………….……topi transparan

l 2×larutan ekstraksi pekat 60ml….tutup biru

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg……………… tutup putih

1. 7.Persiapan Reagen

Larutan 1: pereaksi turunan:

Tambahkan 10ml metanol ke dalam botol yang mengandung 2-Nitrobenzaldehida dan larutkan.(pada konsentrasi 10mM).

Larutan 2: 0,1MK₂HPO₄larutan:

Berat 22,8g K₂HPO₄.3H₂O ke 1L air deionisasi untuk larut.

Larutan 3: larutan HCl 1M

Larutkan 8.3ml Asam klorida pekat dengan air deionisasi hingga 100 ml.

Solusi 4:larutan NaOH 1M

Larutkan 4g NaOH dengan 100ml air deionisasi.

Solusi 5: solusi ekstraksi:

Encerkan larutan ekstraksi pekat 2x dengan air deionisasi dengan perbandingan volume 1:1.Larutan ini dapat disimpan selama 1 bulan pada suhu 4℃, yang akan digunakan untuk mengekstraksi sampel.

Larutan 6: larutan cuci:

Encerkan larutan pencuci pekat 20×dengan air deionisasi dalam rasio volume 1:19, yang akan digunakan untuk mencuci pelat.Larutan encer ini dapat disimpan selama 1 bulan pada suhu 4℃.

1. 8.Persiapan Sampel

8.1Pemberitahuan dan tindakan pencegahan sebelum operasi:

a) Silakan gunakan tip satu kali dalam percobaan, dan ubah tip saat menyerap reagen yang berbeda.

b) Pastikan semua instrumen percobaan bersih.

c) reagen turunan dapat disimpan pada 2-8 ℃ selama tiga bulan;

d) Larutan HCl dapat disimpan pada suhu kamar selama 3 bulan;

e) Larutan NaOH dapat disimpan selama 3 bulan pada suhu kamar;

f) Simpan sampel yang tidak diolah dalam keadaan beku (-20 ℃);

g) Sampel yang dirawat dapat disimpan selama 24 jam pada 2-8 ℃ dalam kegelapan.

8.2 Sampel jaringan dan hati hewan:

---- Homogenkan sampel dengan homogenizer;

---- Timbang 1,0 ± 0,05 g sampel jaringan yang dihomogenkan ke dalam tabung sentrifus polistiren 50 ml.Tambahkan 4ml air deionisasi, 0,5ml larutan HCl 1M dan 100ul reagen turunan (lihat larutan 1).Kocok selama 2 menit.

---- Inkubasi pada suhu 37℃ semalaman (sekitar 16 jam);

---- Tambahkan 5ml 0,1MK₂HPO₄ (larutan2), 0,4ml 1M NaOH (larutan4) dan 5ml etil asetat.Kocok dengan kuat selama 30 detik;

---- Centrifuge pada suhu kamar (20-25 ℃) selama 10 menit, setidaknya 3000g;

---- Ambil 2,5ml fase organik supernatan ke dalam tabung gelas bersih 10ml, keringkan dengan gas nitrogen 50-60 ℃ atau evaporator putar;

---- Larutkan sisa kering dengan 1ml n-hexane (atau n-heptane), vortex selama 30 detik, tambahkan 1ml larutan ekstraksi (larutan5), vortex 1 menit, aduk rata.

---- Centrifuge pada suhu kamar (20-25^oC) selama 5 menit, setidaknya 3000g;

---- Hapus fase organik supernatan;ambil 50μl fase air substrat untuk pengujian.

8.4 Sayang

---- timbang 1,0 ± 0,05 g sampel madu yang telah dihomogenkan ke dalam tabung sentrifus polistiren 50 ml;

---- Tambahkan 4ml air deionisasi, 0,5ml 1M HCl (larutan3) dan reagen turunan 100μl (larutan1);kocok sepenuhnya selama 2 menit;

---- Inkubasi pada suhu 37 ℃ semalam (sekitar 16 jam);

---- Tambahkan 5ml 0,1MK₂HPO₄ (larutan2), 0,4ml 1M NaOH (larutan4) dan 5ml etil asetat, kocok kuat-kuat selama 30 detik;

---- Centrifuge pada suhu kamar (20-25 ℃) selama 10 menit, setidaknya 3000g;

---- Ambil 2,5 ml fase organik supernatan ke dalam tabung gelas bersih 10 ml, keringkan dengan gas nitrogen 50-60 ℃ atau evaporator putar;

----Larutkan sisa kering dengan 1ml n-hexane (atau n-heptane), vortex selama 30 detik, tambahkan 1ml larutan ekstraksi (larutan5), vortex 1 menit, aduk rata.

---- Centrifuge pada suhu kamar (20-25^oC) selama 10 menit, setidaknya 3000g;

----Hapus fase organik supernatan;ambil 50μl fase air substrat untuk pengujian.

1. 9.Proses pengujian

9.1Perhatikan sebelum pengujian

9.1.1 Pastikan semua reagen dan microwell berada pada suhu kamar (20-25℃).

9.1.2 Kembalikan semua sisa reagen ke 2-8℃ segera setelah digunakan.

9.1.3 Mencuci sumur mikro dengan benar merupakan langkah penting dalam proses pengujian;itu adalah faktor penting untuk reproduktifitas analisis ELISA.

9.1.4 Hindari cahaya dan tutupi microwell selama inkubasi.

9.2 Langkah Pengujian

9.2.1 Keluarkan semua reagen pada suhu kamar (20-25℃) selama lebih dari 30 menit, homogenkan sebelum digunakan.

9.2.2 Keluarkan microwell yang diperlukan dan segera kembalikan sisanya ke dalam kantong zip-lock pada suhu 2-8℃.

9.2.3 Larutan pencuci pekat dan larutan ekstraksi pekat harus dihangatkan kembali pada suhu kamar sebelum digunakan.

9.2.4Nomor:Bernomor setiap posisi microwell dan semua standar dan sampel harus dijalankan dalam rangkap dua.Catat standar dan posisi sampel.

9.2.5Pengenceran larutan antibodi pekat: encerkan larutan enzim pekat dengan pengencer konjugat enzim dengan perbandingan volume 1:10 (1 kali lipat larutan enzim pekat: 10 kali lipat pengencer konjugat enzim).

9.2.6Tambahkan larutan standar/sampel dan larutan konjugasi enzim: tambahkan 50µl larutan standar atau sampel yang disiapkan ke sumur yang sesuai, tambahkan 50µl larutan konjugat enzim.Aduk perlahan dengan mengocok piring secara manual dan inkubasi selama 30 menit pada suhu 25℃ dengan penutup.

9.2.7Mencuci: Lepaskan penutup dengan hati-hati dan tuangkan cairan keluar dari sumur dan bilas microwell dengan larutan pencuci encer 250µl (larutan6) dengan interval 10 detik sebanyak 4-5 kali.Serap sisa air dengan kertas penyerap (sisa gelembung udara dapat dihilangkan dengan ujung yang tidak terpakai).

9.2.8Pewarnaan: Tambahkan 50µl larutan substrat A dan 50ul larutan substrat B ke masing-masing sumur.Aduk perlahan dengan menggoyangkan plate secara manual dan inkubasi selama 15 menit pada suhu 25℃ dengan penutup (lihat 12.8).

9.2.11Ukuran: Tambahkan 50µl stop solution ke masing-masing well.Campur perlahan dengan menggoyang pelat secara manual dan ukur absorbansi pada 450nm (Disarankan mengukur dengan panjang gelombang ganda 450/630nm. Baca hasilnya dalam 5 menit setelah penambahan stop solution.)

10 Hasil

10.1Persentase penyerapan

Nilai rata-rata dari nilai absorbansi yang diperoleh untuk standar dan sampel dibagi dengan nilai absorbansi standar pertama (standar nol) dan dikalikan 100%.Standar nol dengan demikian dibuat sama dengan 100% dan nilai absorbansi dikutip dalam persentase.

=

B ——standar absorbansi (atau sampel)

B0 ——standar nol absorbansi

10.2Kurva Standar

----Untuk menggambar kurva standar: Ambil nilai absorbansi standar sebagai sumbu y, semi logaritmik dari konsentrasi larutan standar AOZ (ppb) sebagai sumbu x.

---- Konsentrasi AOZ dari setiap sampel (ppb), yang dapat dibaca dari kurva kalibrasi, dikalikan dengan faktor pengenceran yang sesuai dari setiap sampel yang diikuti, dan diperoleh konsentrasi sampel yang sebenarnya.

Harap perhatikan:

Perangkat lunak khusus telah dikembangkan untuk semua reduksi data, yang dapat disediakan berdasarkan permintaan.

Faktor pengenceran………………………………………………..……2

10.Sensitivitas, akurasi dan presisi

Kepekaan: 0,025ppb

Batas deteksi:

Jaringan (otot, hati)………………………………0.1ppb

Sayang------------------------------------------------- -0,1ppb

Ketepatan:

Jaringan hewan (otot dan hati)……………………100±20%

Sayang………………………………..………….... 100±20%

Presisi:CV kit ELISA kurang dari 10%.

11.Melihat

12.1 Nilai rata-rata nilai absorbansi yang diperoleh untuk standar dan sampel akan berkurang jika reagen dan sampel belum diatur ke suhu kamar (20-25℃).

12.2 Jangan biarkan sumur mikro mengering di antara langkah-langkah untuk menghindari reproduktifitas yang tidak berhasil dan operasikan langkah berikutnya segera setelah mengetuk penahan sumur mikro.

12.3 Kocok setiap reagen dengan lembut sebelum digunakan.

12.4 Jauhkan kulit Anda dari stop solution karena ini adalah 0,5MH₂SO₄larutan.

12.5 Jangan gunakan kit yang sudah kadaluarsa.Jangan menukar reagen dari batch yang berbeda, atau sensitivitasnya akan turun.

12.6 Kondisi penyimpanan: Simpan kit ELISA pada suhu 2-8℃, jangan dibekukan.Seal rest microwell plate, Hindari sinar matahari langsung selama semua inkubasi.Menutup pelat mikrotiter dianjurkan.

12.7 Larutan substrat harus ditinggalkan jika berubah warna.Reagen dapat rusak jika nilai absorbansi (450/630nm) dari standar nol kurang dari 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Reaksi pewarnaan membutuhkan waktu 15 menit setelah penambahan larutan substrat;Anda dapat memperpanjang waktu inkubasi hingga 20 menit atau lebih jika warnanya terlalu terang untuk ditentukan., jangan pernah melebihi 25 menit. Sebaliknya, persingkat waktu inkubasi dengan benar.

12.9 Suhu reaksi optimal adalah 25℃.Suhu yang lebih tinggi atau lebih rendah akan menyebabkan perubahan nilai sensitivitas dan absorbansi.

12.Kondisi penyimpanan dan periode penyimpanan

Kondisi penyimpanan: 2-8 ℃.

Periode penyimpanan: 12 bulan.