Prodotto

Kit di analisi immunoenzimatica competitiva per l'analisi quantitativa del metabolita furazolidone (AOZ)

Breve descrizione:

Questo kit ELISA è progettato per rilevare AOZ in base al principio del dosaggio immunoenzimatico competitivo indiretto.I micropozzetti sono rivestiti con l'antigene di cattura legato alla BSA.L'AOZ nel campione compete con l'antigene rivestito sulla micropiastra per l'anticorpo aggiunto.Dopo l'aggiunta del coniugato enzimatico, viene utilizzato il substrato cromogenico e il segnale viene misurato mediante uno spettrofotometro.L'assorbimento è inversamente proporzionale alla concentrazione di AOZ nel campione.


Dettagli del prodotto

Tag del prodotto

Kit di immunodosaggio enzimatico competitivo per

Analisi quantitativa diMetabolita furazolidone(AOZ)

 

  1. 1.Sfondo

I nitrofurani sono antibiotici sintetici ad ampio spettro, frequentemente impiegati nella produzione animale per le loro eccellenti proprietà antibatteriche e farmacocinetiche.Sono stati utilizzati anche come promotori della crescita nella produzione suina, pollame e acquatica.In studi a lungo termine con animali da laboratorio è stato indicato che i farmaci progenitori ei loro metaboliti mostravano caratteristiche cancerogene e mutagene.Ciò ha portato a un divieto dei nitrofurani per il trattamento degli animali utilizzati per la produzione alimentare.I farmaci nitrofuranici furaltadone, nitrofurantoina e nitrofurazone sono stati vietati dall'uso nella produzione alimentare animale nell'UE nel 1993 e l'uso del furazolidone è stato vietato nel 1995.

L'analisi dei residui di farmaci nitrofuranici deve essere basata sulla rilevazione dei metaboliti legati ai tessuti dei farmaci progenitori nitrofuranici.Poiché i farmaci progenitori vengono metabolizzati molto rapidamente e i metaboliti del nitrofurano legati ai tessuti si conservano a lungo, questi metaboliti vengono utilizzati come bersaglio nella rilevazione dell'abuso di nitrofurani, che includono il metabolita del furazolidone (AOZ), il metabolita del furaltadone (AMOZ ), metabolita nitrofurantoina (AHD) e metabolita nitrofurazone (SEM).

I residui AOZ sono determinati più comunemente mediante LC-MS o LC-MS/MS.I dosaggi immunoenzimatici, rispetto ai metodi cromatografici, mostrano notevoli vantaggi in termini di sensibilità, limite di rilevabilità, attrezzatura tecnica e tempo necessario.(Costo in tempo: 45min)

  1. 2.Principio di prova

Questo kit ELISA è progettato per rilevare AOZ in base al principio del dosaggio immunoenzimatico competitivo indiretto.I micropozzetti sono rivestiti con l'antigene di cattura legato alla BSA.L'AOZ nel campione compete con l'antigene rivestito sulla micropiastra per l'anticorpo aggiunto.Dopo l'aggiunta del coniugato enzimatico, viene utilizzato il substrato cromogenico e il segnale viene misurato mediante uno spettrofotometro.L'assorbimento è inversamente proporzionale alla concentrazione di AOZ nel campione.

  1. 3.Applicazioni

Questo kit può essere utilizzato nell'analisi quantitativa e qualitativa del residuo AOZ intessuti dell'anima(muscoli, fegato ecc.), tesoro.

  1. 4.Reazioni incrociate

Metabolita furazolidone (AOZ)……………………..100%

Metabolita del furaltadone (AMOZ)……………………<0,1%

Metabolita della nitrofurantoina (AHD)……………………<0,1%

Metabolita del nitrofurazone (SEM)…………………...…<0,1%

Furazolidone…………………………………….…..…16,3%

Furaltadone………………………………………………….…<1%

Nitrofurantoina…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………..…<1%

  1. 5.Materiali richiesti

5.1Attrezzature

----Spettrofotometro a piastra per microtitolazione (450nm/630nm)

----Evaporatore rotante o strumenti di essiccazione dell'azoto

----Omogeneizzatore/stomacher

----Shaker

----Agitatore a vortice

----Centrifuga

---- Bilancia analitica (induttanza: 0,01 g)

---- Pipetta graduata: 10 ml

---- Bulbo pipetta in gomma

---- Pallone volumetrico: 100 ml

---- Boccetta di vetro: 10 ml

----Provetta da centrifuga in polistirene: 2 ml, 50 ml

---- Micropipette: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipetta

5.2Reagenti

---- Acetato di etile (AR)

----n-esano (o n-eptano) (AR)

----Dipotassio idrogeno fosfato triidrato

(K2HPO4.3H2O) (AR)

----Acido cloridrico concentrato (HCl, AR)

-----Metanolo

---- Idrossido di sodio (NaOH, AR)

----Acqua deionizzata

  1. 6.Componenti del kit

l Piastra per microtitolazione rivestita con antigene, 96 pozzetti

l Soluzioni standard (6 flaconi, 1 ml/flacone)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Spiking standard di controllo: (1 ml/flacone)....….100ppb

l Coniugato enzimatico concentrato 1ml...…..tappo rosso

l Diluenti coniugati enzimatici 10ml………..tappo verde

l Substrato A 7ml………..............…....…..…..tappo bianco

l Substrato B 7ml………..............…........….…..tappo rosso

l Stop solution 7ml……………………………tappo giallo

l 20×soluzione di lavaggio concentrata 40ml

…………………………………….……tappo trasparente

l 2×soluzione di estrazione concentrata 60ml….tappo blu

l 2-Nitrobenzaldeide 15.1mg………………tappo bianco

  1. 7.Preparazione dei reagenti

Soluzione 1: reagente derivato:

Aggiungere 10 ml di metanolo alla bottiglia contenente 2-nitrobenzaldeide e sciogliere.(alla concentrazione di 10 mM).

Soluzione 2: 0,1 MB2HPO4soluzione:

Pesa 22,8 g K2HPO4.3H2O a 1L di acqua deionizzata da sciogliere.

Soluzione 3: soluzione di HCl 1M

Sciogliere 8,3 ml di acido cloridrico concentrato con acqua deionizzata a 100 ml.

Soluzione 4:Soluzione 1M di NaOH

Sciogliere 4 g di NaOH con 100 ml di acqua deionizzata.

Soluzione 5: soluzione di estrazione:

Diluire la soluzione di estrazione concentrata 2× con acqua deionizzata nel rapporto volumetrico di 1:1.Questa soluzione può essere conservata per 1 mese a 4℃, che verrà utilizzata per estrarre i campioni.

Soluzione 6: soluzione di lavaggio:

Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 20× con acqua deionizzata nel rapporto volumetrico di 1:19, che verrà utilizzata per lavare le piastre.Questa soluzione diluita può essere conservata per 1 mese a 4℃.

  1. 8.Preparazioni del campione

8.1Avviso e precauzioni prima del funzionamento:

a) Si prega di utilizzare punte una tantum nell'esperimento e di cambiare le punte quando si assorbe un reagente diverso.

b) Assicurarsi che tutti gli strumenti sperimentali siano puliti.

c) il reagente derivato può essere conservato a 2-8℃ per tre mesi;

d) La soluzione di HCl può essere conservata a temperatura ambiente per 3 mesi;

e) La soluzione di NaOH può essere conservata per 3 mesi a temperatura ambiente;

f) Conservare i campioni non trattati in congelamento (-20 ℃);

g) I campioni trattati possono essere conservati per 24 ore a 2-8°C al buio.

8.2 Campioni di tessuto e fegato animali:

----Omogeneizzare i campioni con l'omogeneizzatore;

----Pesare 1,0 ± 0,05 g del campione di tessuto omogeneizzato in una provetta da centrifuga in polistirene da 50 ml.Aggiungere 4 ml di acqua deionizzata, 0,5 ml di soluzione HCl 1M e 100 ul di reagente derivato (vedere soluzione 1).Agitare per 2 minuti.

---- Incubare a 37℃ durante la notte (circa 16 ore);

---- Aggiungi 5ml 0.1MK2HPO4 (soluzione2), 0,4 ml di NaOH 1M (soluzione4) e 5 ml di acetato di etile.Agitare ferocemente per 30 secondi;

---- Centrifugare a temperatura ambiente (20-25℃) per 10min, almeno 3000g;

---- Prendere 2,5 ml della fase organica surnatante in un tubo di vetro pulito da 10 ml, asciugare con azoto gassoso a 50-60 ℃ o evaporatore rotante;

---- Sciogliere il residuo secco con 1 ml di n-esano (o n-eptano), vortexare per 30 secondi, aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione (soluzione5), vortexare per 1 minuto, mescolare completamente.

---- Centrifugare a temperatura ambiente (20-25oC) per 5min, almeno 3000g;

---- Rimuovere la fase organica surnatante;prendere 50μl della fase acquosa del substrato per l'analisi.

 

8.4 Miele

---- pesare 1,0 ± 0,05 g del campione di miele omogeneizzato in una provetta da centrifuga in polistirene da 50 ml;

---- Aggiungere 4 ml di acqua deionizzata, 0,5 ml di HCl 1M (soluzione3) e 100μl di reagente derivato (soluzione1);agitare completamente per 2 minuti;

----Incubare a 37℃ durante la notte (circa 16 ore);

----Aggiungere 5ml 0.1MK2HPO4 (soluzione2), 0,4 ml di NaOH 1M (soluzione4) e 5 ml di acetato di etile, agitare ferocemente per 30 secondi;

----Centrifugare a temperatura ambiente (20-25℃) per 10 minuti, almeno 3000 g;

----Prendere 2,5 ml della fase organica surnatante in un tubo di vetro pulito da 10 ml, asciugare con azoto gassoso a 50-60 ℃ o evaporatore rotante;

---- Sciogliere il residuo secco con 1 ml di n-esano (o n-eptano), vortexare per 30 secondi, aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione (soluzione5), vortexare per 1 minuto, mescolare completamente.

----Centrifugare a temperatura ambiente (20-25oC) per 10min, almeno 3000g;

----Rimuovere la fase organica surnatante;prendere 50μl della fase acquosa del substrato per l'analisi.

  1. 9.Processo di analisi

9.1Avviso prima del test

9.1.1 Assicurarsi che tutti i reagenti e i micropozzetti siano tutti a temperatura ambiente (20-25 ℃).

9.1.2 Riportare tutti i restanti reagenti a 2-8℃ immediatamente dopo l'uso.

9.1.3 Il lavaggio corretto dei micropozzetti è un passaggio importante nel processo di analisi;è il fattore vitale per la riproducibilità dell'analisi ELISA.

9.1.4 Evitare la luce e coprire i micropozzetti durante l'incubazione.

9.2 Fasi del test

9.2.1 Estrarre tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 ℃) per più di 30 minuti, omogeneizzare prima dell'uso.

9.2.2 Estrarre i micropozzetti necessari e rimettere immediatamente il resto nel sacchetto con chiusura lampo a 2-8℃.

9.2.3 La soluzione di lavaggio concentrata e la soluzione di estrazione concentrata devono essere riscaldate a temperatura ambiente prima dell'uso.

9.2.4Numero:Le posizioni numerate di ogni micropozzetto e tutti gli standard ei campioni devono essere analizzati in duplicato.Registrare le posizioni degli standard e dei campioni.

9.2.5Diluizione della soluzione concentrata di anticorpi: diluire la soluzione enzimatica concentrata con diluenti coniugati enzimatici nel rapporto in volume di 1:10 (1 volta soluzione enzimatica concentrata: 10 volte diluenti coniugati enzimatici).

9.2.6Aggiungere la soluzione standard/campione e la soluzione di coniugato enzimatico: aggiungere 50 µl di soluzione standard o campione preparato nei pozzetti corrispondenti, aggiungere 50 µl di soluzione di coniugato enzimatico.Miscelare delicatamente agitando manualmente la piastra e incubare per 30 minuti a 25°C con coperchio.

9.2.7Lavaggio: Rimuovere delicatamente il coperchio e versare il liquido fuori dai pozzetti e risciacquare i micropozzetti con 250 µl di soluzione di lavaggio diluita (soluzione6) ad intervalli di 10s per 4-5 volte.Assorbire l'acqua residua con carta assorbente (la bolla d'aria residua può essere eliminata con la punta inutilizzata).

9.2.8Colorazione: Aggiungere 50 µl di soluzione di substrato A e 50 µl di soluzione di substrato B in ciascun pozzetto.Miscelare delicatamente agitando manualmente la piastra e incubare per 15 minuti a 25°C con coperchio (vedere 12.8).

9.2.11Misurare: Aggiungere 50 µl della soluzione di arresto in ciascun pozzetto.Miscelare delicatamente facendo oscillare manualmente la piastra e misurare l'assorbanza a 450 nm (si suggerisce di misurare con la doppia lunghezza d'onda di 450/630 nm. Leggere il risultato entro 5 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto).

10 Risultati

10.1Assorbanza percentuale

I valori medi dei valori di assorbanza ottenuti per gli standard ei campioni vengono divisi per il valore di assorbanza del primo standard (standard zero) e moltiplicati per 100%.Lo standard zero è quindi reso uguale al 100% ei valori di assorbanza sono riportati in percentuale.

=

B ——standard di assorbanza (o campione)

B0 ——assorbanza zero standard

10.2Curva standard

----Per tracciare una curva standard: Prendi il valore di assorbanza degli standard come asse y, semilogaritmico della concentrazione della soluzione standard AOZ (ppb) come asse x.

----La concentrazione AOZ di ciascun campione (ppb), che può essere letta dalla curva di calibrazione, viene moltiplicata per il corrispondente fattore di diluizione di ciascun campione seguito e si ottiene la concentrazione effettiva del campione.

Si prega di notare:

Per la riduzione di tutti i dati è stato sviluppato un software speciale, che può essere fornito su richiesta.

Fattore di diluizione………………………………………..……2

10.Sensibilità, accuratezza e precisione

Sensibilità: 0,025 ppm

Limite di rilevamento:

Tessuto (muscolo, fegato)…………………………0.1ppb

Tesoro------------------------------------------------- -0,1ppb

Precisione:

Tessuto animale (muscolo e fegato)……...…………100±20%

Miele………………………………..………….... 100±20%

Precisione:Il CV del kit ELISA è inferiore al 10%.

11.Avviso

12.1 I valori medi dei valori di assorbanza ottenuti per gli standard e i campioni saranno ridotti se i reagenti e i campioni non sono stati regolati a temperatura ambiente (20-25 ℃).

12.2 Non lasciare asciugare i micropozzetti tra una fase e l'altra per evitare una riproducibilità non riuscita e passare alla fase successiva immediatamente dopo aver picchiettato il supporto per micropozzetti.

12.3 Agitare delicatamente ciascun reagente prima dell'uso.

12.4 Tenere la pelle lontana dalla soluzione di arresto perché è 0,5 MH2SO4soluzione.

12.5 Non utilizzare i kit scaduti.Non scambiare i reagenti di lotti diversi, altrimenti diminuirà la sensibilità.

12.6 Condizioni di conservazione: conservare i kit ELISA a 2-8 ℃, non congelare.Sigillare le piastre per micropozzetti, evitare la luce diretta del sole durante tutte le incubazioni.Si consiglia di coprire le micropiastre.

12.7 La soluzione del substrato dovrebbe essere abbandonata se vira i colori.I reagenti possono deteriorarsi se il valore di assorbanza (450/630nm) dello standard zero è inferiore a 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 La reazione di colorazione richiede 15 minuti dopo l'aggiunta della soluzione di substrato;È possibile prolungare il tempo di incubazione a 20 minuti o più se il colore è troppo chiaro per essere determinato., non superare mai i 25 minuti. Al contrario, accorciare correttamente il tempo di incubazione.

12.9 La temperatura di reazione ottimale è 25℃.Una temperatura più alta o più bassa porterà a cambiamenti dei valori di sensibilità e assorbanza.

12.Condizioni di conservazione e periodo di conservazione

Condizioni di conservazione: 2-8 ℃.

Periodo di conservazione: 12 mesi.

 

 


  • Precedente:
  • Prossimo:

  • Scrivi qui il tuo messaggio e inviacelo

    prodotti correlati