フラゾリドン代謝物 (AOZ) の定量分析用競合酵素免疫測定キット
- 1.バックグラウンド
ニトロフランは合成広域スペクトル抗生物質であり、その優れた抗菌性および薬物動態特性のために動物生産に頻繁に使用されます。それらはまた、豚、家禽および水産生産における成長促進剤としても使用されていました.実験動物を用いた長期研究では、親薬とその代謝物が発がん性と変異原性を示すことが示されました。これにより、食料生産に使用される動物の治療にニトロフランを使用することが禁止されました。ニトロフラン系薬剤であるフラルタドン、ニトロフラントイン、およびニトロフラゾンは、1993 年に EU での食用動物生産での使用が禁止され、フラゾリドンの使用は 1995 年に禁止されました。
ニトロフラン薬物残留物の分析は、ニトロフラン親薬物の組織結合代謝物の検出に基づく必要があります。親薬物は非常に急速に代謝され、組織に結合したニトロフラン代謝物は長時間保持されるため、フラゾリドン代謝物 (AOZ)、フラルタドン代謝物 (AMOZ) を含むこれらの代謝物は、ニトロフランの乱用の検出におけるターゲットとして使用されます。 ）、ニトロフラントイン代謝物（AHD）およびニトロフラゾン代謝物（SEM）。
AOZ 残基は、LC-MS または LC-MS/MS によって最も一般的に測定されます。酵素イムノアッセイは、クロマトグラフィー法と比較して、感度、検出限界、技術的機器、および所要時間に関してかなりの利点を示しています。（所要時間：45分）
- 2.試験原理
この ELISA キットは、間接競合酵素免疫測定法の原理に基づいて AOZ を検出するように設計されています。マイクロタイター ウェルは、捕捉 BSA 結合抗原でコーティングされています。サンプル中の AOZ は、マイクロタイター プレートにコーティングされた抗原と競合して、添加された抗体を獲得します。酵素コンジュゲートの添加後、発色基質を使用し、シグナルを分光光度計で測定します。吸収は、サンプル中の AOZ 濃度に反比例します。
- 3.アプリケーション
このキットは、AOZ 残留物の定量および定性分析に使用できます。アニマ組織（筋肉、肝臓など）、蜂蜜。
- 4.交差反応
フラゾリドン代謝物 (AOZ)……………………..100%
フラルタドン代謝物（AMOZ）……………………<0.1%
ニトロフラントイン代謝物（AHD）……………………<0.1%
ニトロフラゾン代謝物（SEM）…………………………<0.1%
フラゾリドン…………………………………….……..…16.3%
フラルタドン…………………………………………….…<1%
ニトロフラントイン…………………………………….…….…<1%
ニトロフラゾン…………………………………………..…<1%
- 5.必要な材料
5.1設備
----マイクロタイタープレート分光光度計 (450nm/630nm)
----ロータリーエバポレーターまたは窒素乾燥器具
----ホモジナイザー/ストマッカー
- - シェーカー
----ボルテックスミキサー
- - 遠心
----分析天秤（インダクタンス：0.01g）
----目盛り付きピペット：10ml
----ラバーピペットバルブ
----メスフラスコ：100ml
----ガラスフラスコ：10ml
----ポリスチレン遠沈管：2ml、50ml
----マイクロピペット: 20ul-200ul、100ul-1000ul、
250ulマルチピペット
5.2試薬
----酢酸エチル（AR）
----n-ヘキサン (または n-ヘプタン) (AR)
----リン酸水素二カリウム三水和物
(K2HPO4.3H2O) (AR)
----濃塩酸（HCl、AR）
- - -メタノール
----水酸化ナトリウム（NaOH、AR）
- - 脱イオン水
- 6.キットの構成要素
l 抗原でコーティングされたマイクロタイター プレート、96 ウェル
l 標準液（6本、1ml/本）
0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.225ppb、0.675ppb、2.025ppb
l スパイク標準コントロール : (1ml/ボトル).....100ppb
l 濃縮酵素複合体 1ml…………赤キャップ
l 酵素複合体希釈液 10ml…………..緑キャップ
l Substrate A 7ml………………………………………………..白キャップ
l 基質 B 7ml………………………………………………..赤キャップ
l 反応停止液 7ml……………………………黄キャップ
l 20×濃縮洗浄液 40ml
…………………………………….……透明キャップ
l 2×濃縮抽出液 60ml…青キャップ
l 2-ニトロベンズアルデヒド 15.1mg………………白キャップ
- 7。試薬の準備
解決 1: 誘導体試薬:
2-ニトロベンズアルデヒドの入った瓶にメタノール10mlを加えて溶かす。（10mMの濃度で）。
解決 2: 0.1MK2HPO4解決：
重量 22.8g K2HPO4.3H2０～１Ｌの脱イオン水に溶解する。
解決 3：1M塩酸溶液
濃塩酸8.3mlを溶かす 脱イオン水で 100ml にします。
解決策 4:1M NaOH溶液
4g NaOH を 100ml の脱イオン水に溶解します。
解決策 5：抽出液：
濃縮抽出液を脱イオン水で体積比 1:1 に 2 倍に希釈します。この溶液は、4℃で 1 ヶ月間保存でき、サンプルの抽出に使用されます。
解決 6: 洗浄液:
プレートを洗浄するために使用される1:19の容積比で脱イオン水で20×濃縮洗浄溶液を希釈する。この希釈液は4℃で1ヶ月保存できます。
- 8.サンプルの準備
8.1操作前の通知と注意事項：
a) 実験では 1 回限りのチップを使用し、異なる試薬を吸収する場合はチップを交換してください。
b) すべての実験器具が清潔であることを確認してください。
c) 誘導体試薬は、2～8℃で 3 ヶ月間保存できます。
d) HCl 溶液は、室温で 3 か月間保存できます。
e) NaOH 溶液は、室温で 3 か月間保存できます。
f) 未処理のサンプルを凍結保存します (-20℃)。
g) 処理したサンプルは、2～8℃の暗所で 24 時間保存できます。
8.2 動物組織および肝臓サンプル:
----ホモジナイザーでサンプルをホモジナイズします。
----ホモジナイズした組織サンプル 1.0±0.05g を 50ml ポリスチレン製遠心管に入れます。脱イオン水 4ml、1M HCl 溶液 0.5ml、および誘導体試薬 100ul を加えます (溶液 1 を参照)。2分間振ってください。
---- 37℃で一晩 (約 16 時間) インキュベートします。
---- 5ml 0.1MKを追加2HPO4 (解決2)、0.4ml 1M NaOH (解決4) および 5ml の酢酸エチル。30秒間激しく振ってください。
----室温（20～25℃）で10分間、少なくとも3000gで遠心分離します。
---- 上澄みの有機相 2.5ml を 10ml のきれいなガラス管に取り、50 ～ 60℃の窒素ガスまたはロータリーエバポレーターで乾燥させます。
---- 1ml の n-ヘキサン (または n-ヘプタン) で乾燥した残り物を溶解し、30 秒間ボルテックスし、1ml の抽出溶液 (解決5)、ボルテックス 1 分間、完全に混合します。
---- 室温で遠心分離します (20-25oC) 5 分間、少なくとも 3000g。
---- 上澄みの有機相を取り除きます。アッセイのために基質水相50μlを取る。
8.4 ハニー
----ホモジナイズした蜂蜜サンプル 1.0±0.05g を 50ml のポリスチレン遠心管に量り取ります。
----脱イオン水 4ml、1M HCl 0.5ml (解決3) および 100μl の誘導体試薬 (解決1);2 分間完全に振る。
----37℃で一晩（約16時間）インキュベートします。
----5ml 0.1MKを加える2HPO4 (解決2)、0.4ml 1M NaOH (解決4) 酢酸エチル 5ml を 30 秒間激しく振とうする。
----室温（20～25℃）で10分間、少なくとも3000gで遠心分離します。
----上澄みの有機相 2.5ml を 10ml のきれいなガラス管に取り、50 ～ 60℃の窒素ガスまたはロータリーエバポレーターで乾燥させます。
----乾燥した残り物を1mlのn-ヘキサン（またはn-ヘプタン）で溶解し、30秒間ボルテックスし、1mlの抽出溶液を加えます（解決5)、ボルテックス 1 分間、完全に混合します。
----室温で遠心分離します (20-25oC) 10 分間、少なくとも 3000g。
----上澄みの有機相を取り除きます。アッセイのために基質水相50μlを取る。
- 9.アッセイプロセス
9.1アッセイ前の注意事項
9.1.1 すべての試薬とマイクロウェルがすべて室温 (20 ～ 25℃) であることを確認します。
9.1.2 残りの試薬は、使用後すぐに 2～8℃に戻してください。
9.1.3 マイクロウェルを正しく洗浄することは、アッセイのプロセスにおける重要なステップです。これは、ELISA 分析の再現性にとって重要な要素です。
9.1.4 インキュベーション中は光を避け、マイクロウェルをカバーしてください。
9.2 アッセイ手順
9.2.1 すべての試薬を室温 (20 ～ 25℃) で 30 分以上取り出し、使用前にホモジナイズします。
9.2.2 必要なマイクロウェルを取り出し、残りを 2 ～ 8℃のジップロックバッグにすぐに戻します。
9.2.3 濃縮洗浄溶液と濃縮抽出溶液は、使用前に室温に戻す必要があります。
9.2.4番号：すべてのマイクロウェル位置に番号を付け、すべての標準とサンプルを重複して実行する必要があります。標準とサンプルの位置を記録します。
9.2.5濃縮抗体溶液の希釈: 濃縮酵素溶液を酵素複合体希釈剤で 1:10 の体積比で希釈します (1 倍濃縮酵素溶液: 10 倍酵素複合体希釈剤)。
9.2.6標準液・サンプルと酵素複合体溶液を加える: 50µl の標準溶液または調製済みサンプルを対応するウェルに加え、50µl の酵素複合体溶液を加えます。プレートを手で軽く振って混合し、蓋をして 25℃で 30 分間インキュベートします。
9.2.7洗う: カバーをそっと取り外し、ウェルから液体を注ぎ出し、250µl の希釈洗浄液でマイクロウェルをすすぎます (解決6) 10 秒間隔で 4 ～ 5 回。吸収紙で残りの水を吸収します (残りの気泡は未使用のチップで除去できます)。
9.2.8着色: 50µl の基質溶液 A と 50ul の基質溶液 B を各ウェルに加えます。プレートを手で揺り動かして静かに混合し、カバーをして 25℃で 15 分間インキュベートします (12.8 参照)。
9.2.11測定: 50µl の停止液を各ウェルに加えます。プレートを手で揺り動かして穏やかに混合し、450nm での吸光度を測定します (450/630nm の 2 波長で測定することをお勧めします。停止液の添加後 5 分以内に結果を読み取ります。)
10 結果
10.1パーセンテージ吸光度
標準およびサンプルについて得られた吸光度値の平均値を、最初の標準 (ゼロ標準) の吸光度値で割り、100% を掛けます。したがって、ゼロ標準は 100% に等しくなり、吸光度の値はパーセンテージで示されます。
=
B —— 吸光度標準 (またはサンプル)
B0 ——吸光度ゼロ標準
10.2標準曲線
----検量線の作成方法: Y 軸に標準液の吸光度、X 軸に AOZ 標準液の濃度 (ppb) の片対数をとります。
----検量線から読み取れる各サンプルの AOZ 濃度 (ppb) に、対応する各サンプルの希釈倍率を乗じて、サンプルの実際の濃度を求めます。
注意してください:
すべてのデータ削減用に特別なソフトウェアが開発されており、ご要望に応じて提供できます。
希釈倍率………………………………………..……2
10.感度、精度、精度
感度: 0.025ppb
検出限界:
組織（筋肉、肝臓）…………………………0.1ppb
ハニー - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -0.1ppb
正確さ：
動物組織（筋肉・肝臓）……………………100±20%
はちみつ……………………………………………………100±20%
精度：ELISA キットの CV は 10% 未満です。
11.知らせ
12.1 試薬およびサンプルが室温 (20 ～ 25℃) に調整されていない場合、標準およびサンプルについて得られた吸光度値の平均値は減少します。
12.2 ステップ間でマイクロウェルを乾燥させないでください。再現性が損なわれるのを防ぎ、マイクロウェル ホルダーをタップした直後に次のステップを操作してください。
12.3 使用前に各試薬を軽く振ってください。
12.4 停止液は 0.5MH であるため、肌に近づけないでください。2SO4解決。
12.5 期限切れのキットを使用しないでください。異なるバッチの試薬を交換しないでください。感度が低下します。
12.6 保存条件：ELISA キットは 2～8℃で保存し、凍結しないでください。残りのマイクロウェル プレートをシールします。すべてのインキュベーション中、直射日光を避けてください。マイクロタイター プレートをカバーすることをお勧めします。
12.7 基質溶液が変色した場合は、廃棄する必要があります。ゼロスタンダードの吸光度（450/630nm）が0.5未満（A450nm＜0.5）の場合、試薬が劣化している可能性があります。
12.8 基質溶液の添加後、発色反応には 15 分かかります。色が薄すぎて判断できない場合は、インキュベーション時間を 20 分以上に延長できます。ただし、25 分を超えないようにしてください。逆に、インキュベーション時間を適切に短くしてください。
12.9 至適反応温度は25℃です。温度が高いまたは低いと、感度と吸光度の値が変化します。
12.保管状態と保管期間
保管条件：2～8℃。
保管期間：12ヶ月.
