პროდუქტი

1. 1.ფონი

ნიტროფურანები არის სინთეზური ფართო სპექტრის ანტიბიოტიკები, რომლებიც ხშირად გამოიყენება ცხოველთა წარმოებაში შესანიშნავი ანტიბაქტერიული და ფარმაკოკინეტიკური თვისებების გამო.ისინი ასევე გამოიყენებოდა როგორც ზრდის ხელშემწყობი ღორის, ფრინველის და წყლის წარმოებაში.ლაბორატორიულ ცხოველებთან გრძელვადიან კვლევებში აჩვენა, რომ ძირითადი პრეპარატები და მათი მეტაბოლიტები აჩვენებდნენ კანცეროგენულ და მუტაგენურ მახასიათებლებს.ამან გამოიწვია ნიტროფურანების აკრძალვა საკვების წარმოებისთვის გამოყენებული ცხოველების სამკურნალოდ.ნიტროფურანული პრეპარატები ფურალტადონი, ნიტროფურანტოინი და ნიტროფურაზონი 1993 წელს აიკრძალა ევროკავშირში საკვებ ცხოველთა წარმოებაში გამოყენება, ხოლო ფურაზოლიდონის გამოყენება აიკრძალა 1995 წელს.

ნიტროფურანული პრეპარატების ნარჩენების ანალიზი უნდა დაფუძნდეს ნიტროფურანის ძირითადი პრეპარატების ქსოვილზე შეკრული მეტაბოლიტების გამოვლენაზე.ვინაიდან ძირითადი წამლები ძალიან სწრაფად მეტაბოლიზდება და ქსოვილთან დაკავშირებული ნიტროფურანის მეტაბოლიტები დიდხანს შენარჩუნდება, ეს მეტაბოლიტები გამოიყენება როგორც სამიზნე ნიტროფურანების ბოროტად გამოყენების გამოვლენისას, მათ შორისაა ფურაზოლიდონის მეტაბოლიტი (AOZ), ფურალტადონის მეტაბოლიტი (AMOZ). ), ნიტროფურანტოინის მეტაბოლიტი (AHD) და ნიტროფურაზონის მეტაბოლიტი (SEM).

AOZ-ის ნარჩენები განისაზღვრება ყველაზე ხშირად LC-MS ან LC-MS/MS მიერ.ფერმენტული იმუნოანალიზები, ქრომატოგრაფიულ მეთოდებთან შედარებით, აჩვენებენ მნიშვნელოვან უპირატესობებს მგრძნობელობის, გამოვლენის ლიმიტის, ტექნიკური აღჭურვილობისა და დროის მოთხოვნილებასთან დაკავშირებით.(დროის ღირებულება: 45 წუთი)

1. 2.ტესტის პრინციპი

ეს ELISA ნაკრები შექმნილია AOZ-ის გამოსავლენად, არაპირდაპირ-კონკურენტული ფერმენტის იმუნოანალიზის პრინციპზე დაყრდნობით.მიკროტიტრული ჭები დაფარულია დაჭერის BSA-თან დაკავშირებული ანტიგენით.ნიმუშში AOZ კონკურენციას უწევს მიკროტიტრულ ფირფიტაზე დაფარულ ანტიგენს დამატებული ანტისხეულისთვის.ფერმენტის კონიუგატის დამატების შემდეგ გამოიყენება ქრომოგენული სუბსტრატი და სიგნალი იზომება სპექტროფოტომეტრით.აბსორბცია უკუპროპორციულია ნიმუშში AOZ-ის კონცენტრაციის.

1. 3.აპლიკაციები

ეს ნაკრები შეიძლება გამოყენებულ იქნას AOZ-ის ნარჩენების რაოდენობრივ და ხარისხობრივ ანალიზშიანიმა ქსოვილები(კუნთები, ღვიძლი და ა.შ.), თაფლი.

1. 4.ჯვარედინი რეაქციები

ფურაზოლიდონის მეტაბოლიტი (AOZ)………………………..100%

ფურალტადონის მეტაბოლიტი (AMOZ)……………………<0,1%

ნიტროფურანტოინის მეტაბოლიტი (AHD)……………………<0,1%

ნიტროფურაზონის მეტაბოლიტი (SEM)………………………<0,1%

ფურაზოლიდონი……………………………………………….. 16.3%

ფურალტადონი………………………………………………<1%

ნიტროფურანტოინი……………………………………………<1%

ნიტროფურაზონი……………………………………………<1%

1. 5.საჭირო მასალები

5.1მოწყობილობები

---- მიკროტიტრული ფირფიტის სპექტროფოტომეტრი (450 ნმ/630 ნმ)

----მბრუნავი აორთქლების ან აზოტის საშრობი ინსტრუმენტები

----ჰომოგენიზატორი /კუჭის

----შეიქერი

----Vortex მიქსერი

----ცენტრიფუგა

----ანალიტიკური ბალანსი (ინდუქციურობა: 0,01გრ)

----გრადუირებული პიპეტი: 10მლ

----რეზინის პიპეტის ნათურა

----მოცულობითი კოლბა: 100მლ

----შუშის კოლბა: 10მლ

----პოლისტიროლის ცენტრიფუგა ტუბი: 2მლ, 50მლ

---- მიკროპიპეტები: 20ულ-200ულლ, ​​100ულ-1000ულლ,

250 მულტიპიპეტი

5.2რეაგენტები

----ეთილის აცეტატი (AR)

----n-ჰექსანი (ან n-ჰეპტანი) (AR)

----დიკალიუმის წყალბადოფოსფატის ტრიჰიდრატი

(K₂HPO₄.3სთ₂O) (AR)

----კონცენტრირებული მარილმჟავა (HCl, AR)

-----მეთანოლი

----ნატრიუმის ჰიდროქსიდი (NaOH, AR)

----დეიონიზებული წყალი

1. 6.ნაკრების კომპონენტები

ლ მიკროტიტრის ფირფიტა დაფარული ანტიგენით, 96 ჭაბურღილი

ლ სტანდარტული ხსნარები (6 ბოთლი, 1 მლ/ბოთლი)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Spiking სტანდარტული კონტროლი: (1მლ/ბოთლი).......100ppb

ლ კონცენტრირებული ფერმენტის კონიუგატი 1მლ.......წითელი თავსახურით

l ფერმენტის კონიუგატის გამხსნელები 10მლ………..მწვანე თავსახური

ლ სუბსტრატი A 7მლ............................................. თეთრი ქუდი

ლ სუბსტრატი B 7მლ.............................................. წითელი თავსახური

ლ შესაჩერებელი ხსნარი 7მლ………………………………ყვითელი თავსახურით

ლ 20×კონცენტრირებული სარეცხი ხსნარი 40მლ

………………………………………………გამჭვირვალე ქუდი

ლ 2×კონცენტრირებული ექსტრაქციის ხსნარი 60მლ….ლურჯი თავსახური

ლ 2-ნიტრობენზალდეჰიდი 15.1მგ………………თეთრი ქუდი

1. 7.რეაგენტების მომზადება

გამოსავალი 1: წარმოებული რეაგენტი:

2-ნიტრობენზალდეჰიდის შემცველ ბოთლს დაამატეთ 10 მლ მეთანოლი და გახსენით.(10 მმ კონცენტრაციით).

გამოსავალი 2: 0.1 მკ₂HPO₄გამოსავალი:

წონა 22,8 გ კ₂HPO₄.3სთ₂O-დან 1 ლ დეიონიზებული წყალი გასახსნელად.

გამოსავალი 3: 1 მ HCl ხსნარი

იხსნება 8.3 მლ კონცენტრირებული მარილმჟავა დეიონიზებული წყლით 100მლ.

გამოსავალი 4:1 მ NaOH ხსნარი

გახსენით 4 გ NaOH 100 მლ დეიონიზებულ წყალში.

გამოსავალი 5: ექსტრაქციის ხსნარი:

განზავდეს 2×კონცენტრირებული ექსტრაქციის ხსნარი დეიონიზებული წყლით მოცულობითი თანაფარდობით 1:1.ამ ხსნარის შენახვა შესაძლებელია 1 თვის განმავლობაში 4℃ ტემპერატურაზე, რომელიც გამოყენებული იქნება მოპოვებული ნიმუშებისთვის.

გამოსავალი 6: სარეცხი ხსნარი:

20×კონცენტრირებული სარეცხი ხსნარი განზავდეს დეიონირებული წყლით მოცულობითი თანაფარდობით 1:19, რომელიც გამოყენებული იქნება ფირფიტების გასარეცხად.ამ გაზავებული ხსნარის შენახვა შესაძლებელია 1 თვის განმავლობაში 4℃ ტემპერატურაზე.

1. 8.ნიმუშების მომზადება

8.1გაფრთხილება და სიფრთხილის ზომები ოპერაციამდე:

ა) გთხოვთ გამოიყენოთ ერთჯერადი რჩევები ექსპერიმენტში და შეცვალოთ რჩევები სხვადასხვა რეაგენტის შთანთქმისას.

ბ) დარწმუნდით, რომ ყველა ექსპერიმენტული ინსტრუმენტი სუფთაა.

გ) წარმოებული რეაგენტის კონსერვაცია შესაძლებელია 2-8℃ ტემპერატურაზე სამი თვის განმავლობაში;

დ) HCl ხსნარის შენახვა შესაძლებელია ოთახის ტემპერატურაზე 3 თვის განმავლობაში;

ე) NaOH ხსნარის შენახვა შესაძლებელია 3 თვის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე;

ვ) დაუმუშავებელი ნიმუშების შენახვა ყინვაში (-20℃);

ზ) დამუშავებული ნიმუშების შენახვა შესაძლებელია 24 საათის განმავლობაში 2-8℃ სიბნელეში.

8.2 ცხოველთა ქსოვილისა და ღვიძლის ნიმუშები:

----ნიმუშების ჰომოგენიზაცია ჰომოგენიზატორით;

----აწონეთ 1.0±0.05გ ჰომოგენიზებული ქსოვილის ნიმუში 50მლ პოლისტიროლის ცენტრიფუგა მილში.დაამატეთ 4 მლ დეიონიზებული წყალი, 0.5 მლ 1M HCl ხსნარი და 100 მლ წარმოებული რეაგენტი (იხ. ხსნარი 1).შეანჯღრიეთ 2 წუთის განმავლობაში.

---- ინკუბაცია 37℃-ზე ღამით (დაახლოებით 16სთ);

---- დაამატეთ 5მლ 0.1მკ₂HPO₄ (გამოსავალი2), 0.4 მლ 1 მ NaOH (გამოსავალი4) და 5 მლ ეთილის აცეტატი.სასტიკად შეანჯღრიეთ 30 წთ;

---- ცენტრიფუგა ოთახის ტემპერატურაზე (20-25℃) 10 წუთის განმავლობაში, მინიმუმ 3000 გ;

---- აიღეთ 2,5მლ ზენატანის ორგანული ფაზა 10მლ სუფთა მინის მილში, გააშრეთ 50-60℃ აზოტის გაზით ან მბრუნავი ამაორთქლებელით;

---- მშრალი ნარჩენი გავხსნათ 1მლ ნ-ჰექსანთან (ან ნ-ჰეპტანთან), მორევით 30 წმ, დავამატოთ 1მლ ექსტრაქციის ხსნარი (გამოსავალი5), მორევა 1 წთ, აურიეთ მთლიანად.

---- ცენტრიფუგა ოთახის ტემპერატურაზე (20-25^oგ) 5 წუთის განმავლობაში, მინიმუმ 3000 გ;

---- ამოიღეთ სუპერნატანტის ორგანული ფაზა;აიღეთ 50 მკლ სუბსტრატის წყლის ფაზა ანალიზისთვის.

8.4 თაფლი

---- აწონეთ 1,0±0,05გ ჰომოგენიზებული თაფლის ნიმუში 50მლ პოლისტიროლის ცენტრიფუგის მილში;

----დაამატეთ 4 მლ დეიონიზებული წყალი, 0,5 მლ 1 მ HCl (გამოსავალი3) და 100 მკლ წარმოებული რეაგენტი (გამოსავალი1);შეანჯღრიეთ მთლიანად 2 წუთის განმავლობაში;

----ინკუბაცია 37℃-ზე ღამით (დაახლოებით 16სთ);

----დაამატეთ 5მლ 0.1მკ₂HPO₄ (გამოსავალი2), 0.4 მლ 1 მ NaOH (გამოსავალი4) და 5 მლ ეთილის აცეტატი, სასტიკად შეანჯღრიეთ 30 წამის განმავლობაში;

---- ოთახის ტემპერატურაზე (20-25℃) ცენტრიფუგა 10 წუთის განმავლობაში, მინიმუმ 3000 გ;

---- აიღეთ 2,5 მლ ზენატანის ორგანული ფაზა 10 მლ სუფთა მინის მილში, გააშრეთ 50-60℃ აზოტის გაზით ან მბრუნავი აორთქლების საშუალებით;

----მშრალი ნარჩენი გავხსნათ 1მლ ნ-ჰექსანთან (ან ნ-ჰეპტანთან), მორევით 30 წმ, დავამატოთ 1მლ ექსტრაქციის ხსნარი (გამოსავალი5), მორევა 1 წთ, აურიეთ მთლიანად.

---- ცენტრიფუგა ოთახის ტემპერატურაზე (20-25^oგ) 10 წუთის განმავლობაში, მინიმუმ 3000 გ;

---- ამოიღეთ სუპერნატანტის ორგანული ფაზა;აიღეთ 50 მკლ სუბსტრატის წყლის ფაზა ანალიზისთვის.

1. 9.ანალიზის პროცესი

9.1შენიშვნა ანალიზის წინ

9.1.1 დარწმუნდით, რომ ყველა რეაგენტი და მიკროჭაჭა ოთახის ტემპერატურაზეა (20-25℃).

9.1.2 დააბრუნეთ ყველა დანარჩენი რეაგენტი 2-8℃ ტემპერატურაზე გამოყენებისთანავე.

9.1.3 მიკროჭის სწორად გარეცხვა მნიშვნელოვანი ნაბიჯია ანალიზის პროცესში;ეს არის ELISA ანალიზის განმეორებადობის სასიცოცხლო ფაქტორი.

9.1.4 მოერიდეთ შუქს და დააფარეთ მიკროჭები ინკუბაციის დროს.

9.2 ანალიზის საფეხურები

9.2.1 გამოიღეთ ყველა რეაგენტი ოთახის ტემპერატურაზე (20-25℃) 30 წუთზე მეტი ხნის განმავლობაში, გამოყენებამდე ჰომოგენიზაცია.

9.2.2 ამოიღეთ საჭირო მიკროჭები და დაუყონებლივ დააბრუნეთ ელვა შესაკრავის ჩანთაში 2-8℃ ტემპერატურაზე.

9.2.3 კონცენტრირებული სარეცხი ხსნარი და კონცენტრირებული ექსტრაქციის ხსნარი გამოყენებამდე უნდა გაათბოს ოთახის ტემპერატურაზე.

9.2.4ნომერი:დანომრილი ყველა მიკროჭის პოზიციები და ყველა სტანდარტი და ნიმუში უნდა იყოს გაშვებული დუბლიკატად.ჩაწერეთ სტანდარტები და ნიმუშების პოზიციები.

9.2.5კონცენტრირებული ანტისხეულების ხსნარის განზავება: განზავდეს კონცენტრირებული ფერმენტის ხსნარი ფერმენტის კონიუგატის გამხსნელებით მოცულობითი თანაფარდობით 1:10 (1-ჯერ კონცენტრირებული ფერმენტის ხსნარი: 10 ჯერ ფერმენტის კონიუგატის გამხსნელები).

9.2.6დაამატეთ სტანდარტული ხსნარი / ნიმუში და ფერმენტის კონიუგატის ხსნარი: დაამატეთ 50 μl სტანდარტული ხსნარი ან მომზადებული ნიმუში შესაბამის ჭაბურღილებში, დაამატეთ 50 μl ფერმენტის კონიუგატის ხსნარი.ნაზად აურიეთ თეფში ხელით შეანჯღრიეთ და ინკუბაცია 30 წუთის განმავლობაში 25℃ სახურავით.

9.2.7Სარეცხი: ნაზად ამოიღეთ საფარი და დაასხით სითხე ჭებიდან და ჩამოიბანეთ მიკროჭები 250 მკლ განზავებული სარეცხი ხსნარით (გამოსავალი6) 10 წამის ინტერვალით 4-5 ჯერ.შეიწოვეთ ნარჩენი წყალი შთამნთქმელი ქაღალდით (დარჩენილი ჰაერის ბუშტი შეიძლება აღმოიფხვრას გამოუყენებელი წვერით).

9.2.8შეღებვა: თითოეულ ჭაბურღილს დაამატეთ 50 μl სუბსტრატის ხსნარი A და 50 მლ სუბსტრატის ხსნარი B.ნაზად აურიეთ ფირფიტის ხელით ქანქარით და ინკუბაცია 15 წუთის განმავლობაში 25℃-ზე საფარით (იხ. 12.8).

9.2.11გაზომე: თითოეულ ჭაბურღილს დაუმატეთ 50µl საცობი ხსნარი.ნაზად აურიეთ ფირფიტის ხელით ქანქარით და გაზომეთ შთანთქმა 450 ნმ-ზე (ის შემოთავაზებული იყო გაზომვა ორმაგი ტალღის სიგრძით 450/630 ნმ. წაიკითხეთ შედეგი გაჩერების ხსნარის დამატების შემდეგ 5 წუთში. )

10 შედეგები

10.1პროცენტული შთანთქმა

სტანდარტებისთვის და ნიმუშებისთვის მიღებული შთანთქმის მნიშვნელობების საშუალო მნიშვნელობები იყოფა პირველი სტანდარტის შთანთქმის მნიშვნელობაზე (ნულოვანი სტანდარტი) და მრავლდება 100%-ზე.ნულოვანი სტანდარტი ამგვარად კეთდება 100%-ის ტოლი და შთანთქმის მნიშვნელობები ციტირებულია პროცენტებში.

=

B - შთანთქმის სტანდარტი (ან ნიმუში)

B0 — — შთანთქმის ნულოვანი სტანდარტი

10.2სტანდარტული მრუდი

----სტანდარტული მრუდის დახაზვა: აიღეთ სტანდარტების შთანთქმის მნიშვნელობა, როგორც y ღერძი, ნახევრად ლოგარითმული AOZ სტანდარტული ხსნარის კონცენტრაციის (ppb) x ღერძის სახით.

----თითოეული ნიმუშის AOZ კონცენტრაცია (ppb), რომლის წაკითხვაც შესაძლებელია კალიბრაციის მრუდიდან, მრავლდება ყოველი ნიმუშის შესაბამისი განზავების კოეფიციენტზე და მიიღება ნიმუშის რეალური კონცენტრაცია.

Გთხოვთ, გაითვალისწინოთ:

შემუშავებულია სპეციალური პროგრამული უზრუნველყოფა ყველა მონაცემის შესამცირებლად, რომლის მოწოდებაც შესაძლებელია მოთხოვნით.

განზავების ფაქტორი……………………………………………………2

10.მგრძნობელობა, სიზუსტე და სიზუსტე

მგრძნობელობა: 0.025ppb

გამოვლენის ლიმიტი:

ქსოვილი (კუნთები, ღვიძლი)…………………………… 0.1ppb

თაფლი----------------------------------------------- -0.1ppb

სიზუსტე:

ცხოველური ქსოვილი (კუნთები და ღვიძლი)…………………100±20%

ძვირფასო……………………………………………. 100±20%

სიზუსტე:ELISA ნაკრების CV 10%-ზე ნაკლებია.

11.გაფრთხილება

12.1 სტანდარტებისა და ნიმუშებისთვის მიღებული შთანთქმის მნიშვნელობების საშუალო მნიშვნელობები შემცირდება, თუ რეაგენტები და ნიმუშები არ იქნება დარეგულირებული ოთახის ტემპერატურაზე (20-25℃).

12.2 არ დაუშვათ მიკროჭის გაშრობა საფეხურებს შორის, რათა თავიდან აიცილოთ წარუმატებელი გამეორება და ამუშავეთ შემდეგი ნაბიჯი მიკროჭების დამჭერის შეხებისთანავე.

12.3 გამოყენებამდე ნაზად შეანჯღრიეთ თითოეული რეაგენტი.

12.4 შეინახეთ კანი შორს, რადგან ის არის 0.5MH₂SO₄გამოსავალი.

12.5 არ გამოიყენოთ მოძველებული ნაკრები.არ შეცვალოთ სხვადასხვა პარტიების რეაგენტები, თორემ დაქვეითდება მგრძნობელობა.

12.6 შენახვის პირობები: შეინახეთ ELISA ნაკრები 2-8℃ ტემპერატურაზე, არ გაყინოთ.დალუქეთ მიკროჭის ფირფიტები, მოერიდეთ მზის პირდაპირ სხივებს ყველა ინკუბაციის დროს.რეკომენდებულია მიკროტიტრული ფირფიტების დაფარვა.

12.7 სუბსტრატის ხსნარი უნდა იყოს მიტოვებული, თუ ის ფერადდება.რეაგენტები შეიძლება გაუარესდეს, თუ ნულოვანი სტანდარტის შთანთქმის მნიშვნელობა (450/630 ნმ) არის 0.5-ზე ნაკლები (A450 ნმ<0.5).

12.8 შეღებვის რეაქციას სჭირდება 15 წუთი სუბსტრატის ხსნარის დამატების შემდეგ;შეგიძლიათ გააგრძელოთ ინკუბაციის დრო 20 წთ-მდე ან მეტზე, თუ ფერი ძალიან ღიაა და არ უნდა დადგინდეს, არასოდეს აღემატებოდეს 25 წუთს. პირიქით, სწორად შეამცირეთ ინკუბაციის დრო.

12.9 რეაქციის ოპტიმალური ტემპერატურაა 25℃.უფრო მაღალი ან დაბალი ტემპერატურა გამოიწვევს მგრძნობელობისა და შთანთქმის მნიშვნელობების ცვლილებას.

12.შენახვის პირობები და შენახვის ვადა

შენახვის პირობები: 2-8℃.

შენახვის ვადა: 12 თვე.