өнім

1. 1.Фон

Нитрофурандар синтетикалық кең спектрлі антибиотиктер болып табылады, олар керемет бактерияға қарсы және фармакокинетикалық қасиеттері үшін жануарлар өндірісінде жиі қолданылады.Олар шошқа, құс және су өндірісінде өсу промоутерлері ретінде де қолданылған.Зертханалық жануарлармен жүргізілген ұзақ мерзімді зерттеулер негізгі препараттар мен олардың метаболиттерінің канцерогендік және мутагендік сипаттар көрсеткенін көрсетті.Бұл азық-түлік өндірісі үшін пайдаланылатын жануарларды емдеуге арналған нитрофурандарға тыйым салуға әкелді.Нитрофуран препараттары фуралтадон, нитрофурантоин және нитрофуразон ЕО-да 1993 жылы жануарларға арналған азық-түлік өндірісінде қолдануға тыйым салынды, ал 1995 жылы фуразолидонды қолдануға тыйым салынды.

Нитрофуран препараттарының қалдықтарын талдау нитрофуранның негізгі препараттарының тіндермен байланысқан метаболиттерін анықтауға негізделуі керек.Негізгі препараттар өте жылдам метаболизденетіндіктен және тінмен байланысқан нитрофуран метаболиттері ұзақ уақыт бойы сақталатындықтан, бұл метаболиттер нитрофурандардың теріс пайдаланылуын анықтауда мақсат ретінде пайдаланылады, оның ішінде Фуразолидон метаболиті (АОЗ), Фуралтадон метаболиті (АМОЗ). ), нитрофурантоин метаболиті (AHD) және нитрофуразон метаболиті (SEM).

AOZ-қалдықтары көбінесе LC-MS немесе LC-MS/MS арқылы анықталады.Хроматографиялық әдістермен салыстырғанда ферменттік иммундық талдаулар сезімталдық, анықтау шегі, техникалық жабдықталуы және уақыт талабы бойынша айтарлықтай артықшылықтарды көрсетеді.(Уақыт құны: 45 мин)

1. 2.Сынақ принципі

Бұл ELISA жинағы жанама бәсекелес ферментті иммундық талдау принципіне негізделген AOZ анықтауға арналған.Микротитр ұңғымалары BSA-байланыстырылған антигенмен қапталған.Үлгідегі AOZ қосылған антидене үшін микротитр тақтасында қапталған антигенмен бәсекелеседі.Фермент конъюгаты қосылғаннан кейін хромогенді субстрат қолданылады және сигнал спектрофотометрмен өлшенеді.Абсорбция үлгідегі AOZ концентрациясына кері пропорционал.

1. 3.Қолданбалар

Бұл жинақты АОЗ қалдығының сандық және сапалық талдауында қолдануға боладыанимациялық ұлпалар(бұлшық ет, бауыр, т.б.), бал.

1. 4.Айқас реакциялар

Фуразолидон метаболиті (АОЗ)……………………..100%

Фуралтадон метаболиті (АМОЗ)……………………<0,1%

Нитрофурантоин метаболиті (AHD)……………………<0,1%

Нитрофуразон метаболиті (SEM)………………………<0,1%

Фуразолидон…………………………………….…..…16,3%

Фуралтадон………………………………………….…<1%

Нитрофурантоин…………………………………….…….…<1%

Нитрофуразон…………………………………………..…<1%

1. 5.Қажетті материалдар

5.1Жабдықтар

----Микротитр пластинасының спектрофотометрі (450нм/630нм)

----Айналмалы буландырғыш немесе азот кептіргіш аспаптар

----Гомогенизатор /асқазан

----Шейкер

----Құйын араластырғыш

----Центрифуга

----Аналитикалық баланс (индуктивтілік: 0,01г)

----Бөлген тамшуыр: 10 мл

----Резеңке тамшуыр шамы

----Көлемді колба: 100мл

----Шыны колба: 10мл

----Полистирол центрифуга түтігі: 2мл, 50мл

----Микропипеттер: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ул-мультипитет

5.2Реагенттер

----Этилацетат (AR)

----n-гексан (немесе n-гептан) (AR)

----Дикалий сутегі фосфаты тригидраты

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

---- Концентрлі тұз қышқылы (HCl, AR)

-----Метанол

----Натрий гидроксиді (NaOH, AR)

----Дионсыздандырылған су

1. 6.Жинақтың құрамдас бөліктері

l Антигенмен қапталған микротитр тақтасы, 96 шұңқыр

l Стандартты ерітінділер (6 бөтелке, 1 мл/бөтелке)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Шығудың стандартты бақылауы: (1 мл/бөтелке)........100бб

l Концентрленген фермент конъюгаты 1мл.........қызыл қалпақ

l Фермент конъюгатының еріткіштері 10 мл……….. жасыл қақпақ

l A субстрат 7мл……………………………..ақ қалпақ

l B субстраты 7мл………………………………..қызыл қалпақ

l Тоқтатқыш ерітінді 7мл……………………………сары қалпақ

л 20×концентрлі жуу ерітіндісі 40мл

…………………………………….……мөлдір қалпақ

л 2×концентрлі экстракция ерітіндісі 60мл….көк қақпақ

л 2-нитробензальдегид 15,1 мг………………ақ қалпақ

1. 7.Реагенттерді дайындау

Шешім 1: туынды реагент:

2-нитробензальдегиді бар бөтелкеге ​​10 мл метанол қосып, ерітіңіз.(10мМ концентрациясында).

Шешім 2: 0,1МК₂HPO₄шешім:

Салмағы 22,8 г К₂HPO₄.3H₂Еріту үшін 1 л деиондандырылған суға дейін.

Шешім 3: 1М HCl ерітіндісі

8,3 мл концентрлі тұз қышқылын ерітіңіз ионсыздандырылған сумен 100 мл дейін.

4-шешім:1М NaOH ерітіндісі

4 г NaOH 100 мл ионсыздандырылған сумен ерітіңіз.

Шешім 5: экстракциялық ерітінді:

2×концентрлі экстракциялық ерітіндіні 1:1 көлемдік қатынасында ионсыздандырылған сумен сұйылтыңыз.Бұл ерітіндіні 4℃ температурада 1 ай бойы сақтауға болады, ол алынған үлгілер үшін пайдаланылады.

Шешім 6: жуу ерітіндісі:

20 × концентрлі жуу ерітіндісін 1:19 көлемдік қатынасында ионсыздандырылған сумен сұйылтыңыз, ол пластиналарды жуу үшін қолданылады.Бұл сұйылтылған ерітіндіні 4°C температурада 1 ай бойы сақтауға болады.

1. 8.Дайындау үлгілері

8.1Жұмыс алдында ескерту және сақтық шаралары:

a) Тәжірибеде бір реттік кеңестерді пайдаланыңыз және әртүрлі реагентті сіңірген кезде кеңестерді өзгертіңіз.

б) Тәжірибелік аспаптардың барлығының таза екеніне көз жеткізіңіз.

в) туынды реагент 2-8℃ температурада үш ай бойы сақталуы мүмкін;

г) HCl ерітіндісін бөлме температурасында 3 ай бойы сақтауға болады;

д) NaOH ерітіндісін бөлме температурасында 3 ай сақтауға болады;

f) Өңделмеген үлгілерді мұздатқышта (-20℃) сақтаңыз;

g) Өңделген үлгілерді қараңғыда 2-8℃ температурада 24 сағат бойы сақтауға болады.

8.2 Жануарлардың тіндері мен бауыр үлгілері:

----Үлгілерді гомогенизатормен гомогенизациялау;

---- 50 мл полистирол центрифуга түтігіне гомогенизацияланған тін үлгісінің салмағы 1,0±0,05 г.4 мл ионсыздандырылған суды, 0,5 мл 1М HCl ерітіндісін және 100ул туынды реагентті қосыңыз (1-ерітіндіні қараңыз).Оны 2 минут шайқаңыз.

---- Түнде 37℃ температурада инкубациялаңыз (шамамен 16 сағат);

---- 5мл 0,1МК қосыңыз₂HPO₄ (шешім2), 0,4мл 1М NaOH (шешім4) және 5 мл этилацетат.30 секунд бойы қатты шайқаңыз;

---- Бөлме температурасында (20-25℃) 10 мин, кем дегенде 3000 г центрифугалау;

---- 2,5 мл органикалық фазаның үстіңгі қабатын 10 мл таза шыны түтікке алыңыз, 50-60 ℃ азот газымен немесе айналмалы буландырғышпен кептіріңіз;

---- Құрғақ қалдықты 1 мл н-гексанмен (немесе n- гептанмен) ерітіңіз, 30 секунд құйыңыз, 1 мл экстракция ерітіндісін қосыңыз (шешім5), 1 мин құйыңыз, толығымен араластырыңыз.

---- Бөлме температурасында центрифугалау (20-25^oC) 5 мин, кем дегенде 3000 г;

---- Жоғарғы органикалық фазаны алып тастаңыз;талдау үшін субстрат су фазасынан 50 мкл алыңыз.

8.4 Бал

---- 1,0±0,05 г гомогенизацияланған бал үлгісін 50 мл полистирол центрифугалық түтікке өлшеңіз;

----4 мл ионсыздандырылған су, 0,5 мл 1 М HCl (шешім3) және 100 мкл туынды реагент (шешім1);2 минут бойы толығымен шайқаңыз;

---- Түнде 37℃ температурада инкубациялаңыз (шамамен 16 сағат);

----5мл 0,1МК қосыңыз₂HPO₄ (шешім2), 0,4мл 1М NaOH (шешім4) және 5 мл этилацетат, 30 секунд бойы қатты шайқаңыз;

----Бөлме температурасында (20-25℃) 10 мин, кем дегенде 3000 г центрифугалау;

---- 2,5 мл үстіңгі заттың органикалық фазасын 10 мл таза шыны түтікке алыңыз, 50-60 ℃ азот газымен немесе айналмалы буландырғышпен құрғатыңыз;

---- Құрғақ қалдықты 1 мл н-гексанмен (немесе n- гептанмен) ерітіңіз, 30 секунд құйыңыз, 1 мл экстракция ерітіндісін қосыңыз (шешім5), 1 мин құйыңыз, толығымен араластырыңыз.

----Бөлме температурасында центрифугалау (20-25^oC) 10 мин, кем дегенде 3000 г;

----Ауыздық органикалық фазаны алып тастаңыз;талдау үшін субстрат су фазасынан 50 мкл алыңыз.

1. 9.Талдау процесі

9.1Талдау алдында ескертіңіз

9.1.1 Барлық реагенттер мен шағын түтіктердің барлығы бөлме температурасында (20-25℃) екеніне көз жеткізіңіз.

9.1.2 Қалған реагенттерді қолданғаннан кейін бірден 2-8℃ температурасына қайтарыңыз.

9.1.3 Микроқұдықтарды дұрыс жуу талдау процесіндегі маңызды қадам болып табылады;бұл ELISA талдауының қайталану мүмкіндігінің маңызды факторы болып табылады.

9.1.4 Инкубация кезінде жарықтан аулақ болыңыз және шағын түтіктерді жабыңыз.

9.2 Талдау қадамдары

9.2.1 Барлық реагенттерді бөлме температурасында (20-25℃) 30 минуттан астам уақытқа алыңыз, қолданар алдында гомогенизациялаңыз.

9.2.2 Қажетті шағын шұңқырларды алыңыз да, қалғандарын 2-8℃ температурада дереу құлыпталатын қапшыққа салыңыз.

9.2.3 Концентрлі жуу ерітіндісі мен концентрлі экстракция ерітіндісін қолданар алдында бөлме температурасында қайта жылыту керек.

9.2.4Саны:Әрбір шағын түтік позициялары нөмірленген және барлық стандарттар мен үлгілер екі данада орындалуы керек.Стандарттар мен үлгілердің позицияларын жазып алыңыз.

9.2.5Концентрлі антидене ерітіндісін сұйылту: концентрацияланған фермент ерітіндісін 1:10 көлемдік қатынасында ферментті конъюгаттық еріткіштермен сұйылтыңыз (1 есе конъюгаттық фермент ерітіндісі: 10 қатпарлы фермент конъюгаттық еріткіштер).

9.2.6Стандартты ерітінді/үлгі және фермент конъюгат ерітіндісін қосыңыз: 50 мкл стандартты ерітінді немесе дайындалған үлгіні сәйкес ұңғымаларға қосыңыз, 50 мкл фермент конъюгат ерітіндісін қосыңыз.Пластинаны қолмен шайқау арқылы ақырын араластырыңыз және қақпағымен 25°C температурада 30 минут бойы инкубациялаңыз.

9.2.7Жуу: Қақпақты ақырын алып тастаңыз және сұйықтықты ұңғымалардан төгіп тастаңыз және шағын түтіктерді 250 мкл сұйылтылған жуу ерітіндісімен шайыңыз (шешім6) 10с аралықпен 4-5 рет.Қалған суды сіңіргіш қағазбен сорыңыз (қалған ауа көпіршігі пайдаланылмаған ұшымен жойылуы мүмкін).

9.2.8Түс беру: Әрбір ұңғымаға 50 мкл субстрат A ерітіндісін және 50 ул субстрат B ерітіндісін қосыңыз.Пластинаны қолмен шайқау арқылы ақырын араластырыңыз және қақпақпен 25℃ температурада 15 минут инкубациялаңыз (12.8 қараңыз).

9.2.11Өлшеу: Әрбір ұңғымаға 50 мкл тоқтату ерітіндісін қосыңыз.Пластинаны қолмен шайқау арқылы ақырын араластырыңыз және сіңіруді 450 нм-де өлшеңіз (Ол 450/630 нм қос толқын ұзындығымен өлшеуді ұсынады. Тоқтатқыш ерітіндіні қосқаннан кейін 5 минут ішінде нәтижені оқыңыз. )

10 Нәтижелер

10.1Пайыздық сіңіру

Стандарттар мен үлгілер үшін алынған сіңіру мәндерінің орташа мәндері бірінші эталонның (нөлдік эталон) сіңіру мәніне бөлінеді және 100% көбейтіледі.Осылайша, нөлдік стандарт 100% тең етіп жасалады және сіңіру мәндері пайызбен белгіленеді.

=

B —— сіңіру стандарты (немесе үлгі)

B0 —— жұтылу нөлдік стандарты

10.2Стандартты қисық

----Стандартты қисық сызу үшін: Стандарттардың жұтылу мәнін y осі ретінде, AOZ стандартты ерітіндісінің концентрациясының жартылай логарифмдік мәнін (ppb) x осі ретінде алыңыз.

----Калибрлеу қисығынан оқуға болатын әрбір үлгінің AOZ концентрациясы (ppb) бақыланатын әрбір үлгінің сәйкес сұйылту коэффициентіне көбейтіледі және үлгінің нақты концентрациясы алынады.

Назар аударыңыз:

Барлық деректерді қысқарту үшін арнайы бағдарламалық қамтамасыз ету әзірленді, ол сұраныс бойынша ұсынылуы мүмкін.

Сұйылту коэффициенті…………………………………………………2

10.Сезімталдық, дәлдік және дәлдік

Сезімталдық: 0,025бб

Анықтау шегі:

Тін (бұлшықет, бауыр)…………………………0,1 ppb

Бал------------------------------------------------- -0,1 ppb

Дәлдігі:

Жануарлардың ұлпасы (бұлшықет және бауыр)…………………100±20%

Бал………………………………………………….. 100±20%

Дәлдік:ELISA жинағының түйіндемесі 10%-дан аз.

11.Ескерту

12.1 Стандарттар мен үлгілер үшін алынған сіңіру мәндерінің орташа мәндері, егер реагенттер мен үлгілер бөлме температурасына (20-25℃) дейін реттелмесе, төмендейді.

12.2 Сәтсіз қайталануды болдырмау үшін қадамдар арасында шағын түтіктердің кептірілуіне жол бермеңіз және шағын түтік ұстағышын түрткеннен кейін бірден келесі қадамды орындаңыз.

12.3 Қолданар алдында әрбір реагентті ақырын шайқаңыз.

12.4 Теріңізді тоқтату ерітіндісінен алыс ұстаңыз, себебі ол 0,5 МГ₂SO₄шешім.

12.5 Ескірген жинақтарды пайдаланбаңыз.Әртүрлі партиялардың реагенттерін алмастырмаңыз, әйтпесе ол сезімталдықты төмендетеді.

12.6 Сақтау жағдайы: ELISA жинақтарын 2-8℃ температурада сақтаңыз, қатып қалмаңыз.Шағын шұңқырларды жабыңыз, барлық инкубациялар кезінде тікелей күн сәулесінен аулақ болыңыз.Микротитрлік тақталарды жабу ұсынылады.

12.7 Субстрат ерітіндісінің түсі өзгерсе, оны тастау керек.Нөлдік стандарттың сіңіру мәні (450/630 нм) 0,5 (A450nm<0,5) төмен болса, реагенттер нашарлауы мүмкін.

12.8 Бояу реакциясы субстрат ерітіндісін қосқаннан кейін 15 мин қажет;Түс анықтау үшін тым ашық болса, инкубация уақытын 20 минутқа немесе одан да көп ұзартуға болады., ешқашан 25 минуттан асырмаңыз. Керісінше, инкубация уақытын дұрыс қысқартыңыз.

12.9 Оңтайлы реакция температурасы 25℃.Жоғары немесе төмен температура сезімталдық пен сіңіру мәндерінің өзгеруіне әкеледі.

12.Сақтау жағдайы және сақтау мерзімі

Сақтау жағдайы: 2-8℃.

Сақтау мерзімі: 12 ай.