Furazolidone 대사체(AOZ)의 정량 분석을 위한 Competitive Enzyme Immunoassay Kit
- 1.배경
니트로푸란은 합성 광역 항생제로, 우수한 항균 및 약동학적 특성 때문에 동물 생산에 자주 사용됩니다.그들은 또한 돼지, 가금류 및 수산 생산에서 성장 촉진제로 사용되었습니다.실험실 동물을 대상으로 한 장기 연구에서 모약물과 그 대사산물이 발암성 및 변이원성을 나타내는 것으로 나타났습니다.이로 인해 식품 생산에 사용되는 동물 치료에 니트로푸란 사용이 금지되었습니다.니트로푸란 약물인 푸랄타돈, 니트로푸란토인 및 니트로푸라존은 1993년 EU에서 식용 동물 생산에 사용이 금지되었으며, 푸라졸리돈의 사용은 1995년에 금지되었습니다.
니트로푸란 약물 잔류물의 분석은 니트로푸란 모 약물의 조직 결합 대사산물의 검출을 기반으로 해야 합니다.모 약물은 매우 빠르게 대사되고 조직에 결합된 니트로푸란 대사산물은 오랫동안 유지되기 때문에 이러한 대사산물은 니트로푸란 남용 감지의 표적으로 사용되며 여기에는 Furazolidone 대사산물(AOZ), Furaltadone 대사산물(AMOZ) ), 니트로푸란토인 대사산물(AHD) 및 니트로푸라존 대사산물(SEM).
AOZ-잔기는 LC-MS 또는 LC-MS/MS에 의해 가장 일반적으로 결정됩니다.효소면역측정법은 크로마토그래피법에 비해 민감도, 검출한계, 기술적 장비, 소요시간 등에서 상당한 이점을 보인다.(소요시간: 45분)
- 2.테스트 원리
본 ELISA kit는 indirect-competitive enzyme immunoassay 원리를 기반으로 AOZ를 검출하도록 설계되었습니다.마이크로타이터 웰은 포획 BSA 연결 항원으로 코팅됩니다.샘플의 AOZ는 추가된 항체에 대해 microtiter plate에 코팅된 항원과 경쟁합니다.효소 접합체를 첨가한 후 발색 기질을 사용하고 분광 광도계로 신호를 측정합니다.흡수는 샘플의 AOZ 농도에 반비례합니다.
- 삼.애플리케이션
이 키트는 AOZ 잔류물에 대한 정량 및 정성 분석에 사용할 수 있습니다.애니마 조직(근육, 간 등), 여보.
- 4.교차 반응
푸라졸리돈 대사산물(AOZ)……………………100%
푸랄타돈 대사산물(AMOZ)…………<0.1%
니트로푸란토인 대사산물(AHD)…………<0.1%
니트로푸라존 대사산물(SEM)………………<0.1%
푸라졸리돈 ……………………………16.3%
푸랄타돈 ..................................................................<1%
니트로푸란토인…………………….……<1%
니트로푸라존 ..................................................................<1%
- 5.필요한 재료
5.1장비
----Microtiter 플레이트 분광 광도계(450nm/630nm)
----회전식 증발기 또는 질소 건조용 기구
----균질화기 /stomacher
----셰이커
----볼텍스 믹서
----원심분리기
----분석 저울(인덕턴스: 0.01g)
----졸업된 피펫: 10ml
----고무 피펫 전구
----부피 플라스크: 100ml
----유리 플라스크: 10ml
----폴리스티렌 원심 분리기 튜브: 2ml, 50ml
----마이크로피펫: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250ul-멀티파이펫
5.2시약
----에틸 아세테이트(AR)
----n-헥산(또는 n-헵탄)(AR)
----인산수소이칼륨 삼수화물
(K2HPO4.3시간2오) (AR)
----농축 염산(HCl, AR)
-----메탄올
----수산화나트륨(NaOH, AR)
----탈이온수
- 6.키트 구성품
l 항원으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트, 96웰
l 표준용액(6병, 1ml/병)
0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb
l Spiking standard control : (1ml/병).....100ppb
l 농축효소복합체 1ml.....빨간캡
l 효소 복합 희석제 10ml ...... ..녹색 캡
l 기판 A 7ml .................................. .. .. .. 흰색 캡
l 기질 B 7ml ..................................................빨간 모자
l 정지용액 7ml
l 20×농축 세척액 40ml
.........................................................투명 캡
l 2×농축추출액 60ml….청색캡
l 2-니트로벤즈알데하이드 15.1mg………………흰색 캡
- 7.시약 준비
해결책 1: 유도체 시약:
2-니트로벤즈알데히드가 들어있는 병에 메탄올 10ml를 넣고 녹인다.(10mM 농도에서).
해결책 2: 0.1MK2HPO4해결책:
무게 22.8g K2HPO4.3시간2O ~ 1L의 탈이온수를 용해합니다.
해결책 3: 1M HCl 용액
8.3ml 진한 염산을 녹이십시오 탈 이온수로 100ml까지.
해결책 4:1M NaOH 용액
4g NaOH를 탈이온수 100ml에 녹입니다.
솔루션 5: 추출 용액:
1:1의 부피비로 탈이온수로 2× 농축 추출 용액을 희석한다.이 용액은 4℃에서 1개월 동안 보존할 수 있으며 추출된 시료에 사용됩니다.
해결책 6: 세척액:
플레이트를 세척하는 데 사용할 부피 비율이 1:19인 탈이온수로 20× 농축 세척 용액을 희석합니다.이 희석액은 4℃에서 1개월간 보존할 수 있다.
- 8.샘플 준비
8.1작동 전 주의 사항:
a) 실험 시 일회용 팁을 사용하고, 다른 시약을 흡수할 경우 팁을 교체하십시오.
b) 모든 실험 도구가 깨끗한지 확인합니다.
c) 유도체 시약은 2-8℃에서 3개월 동안 보존될 수 있다.
d) HCl 용액은 실온에서 3개월 동안 보존할 수 있습니다.
e) NaOH 용액은 실온에서 3개월 동안 보존할 수 있습니다.
f) 처리되지 않은 시료는 동결(-20℃) 상태로 보관하십시오.
g) 처리된 시료는 암실 2-8℃에서 24시간 동안 보존할 수 있습니다.
8.2 동물 조직 및 간 샘플:
----균질기로 샘플을 균질화합니다.
----균질화된 조직 샘플 1.0±0.05g을 50ml 폴리스티렌 원심분리기 튜브에 넣습니다.4ml 탈이온수, 0.5ml 1M HCl 용액 및 100ul 유도체 시약을 첨가합니다(용액 1 참조).2분간 흔든다.
---- 37℃에서 밤새 배양(약 16시간);
---- 5ml 0.1MK 추가2HPO4 (해결책2), 0.4ml 1M NaOH(해결책4) 및 5ml 에틸 아세테이트.30초 동안 격렬하게 흔든다.
---- 실온(20-25℃)에서 10분간 원심분리, 최소 3000g;
---- 10ml 깨끗한 유리관에 상등액 유기상 2.5ml를 취하고 50-60℃ 질소 가스 또는 회전 증발기로 건조시킵니다.
---- 건조하고 남은 찌꺼기를 n-헥산(또는 n-헵탄) 1ml로 녹이고, 30초 동안 vortex하고, 추출 용액 1ml를 추가합니다(해결책5) 1분간 vortex하여 완전히 섞는다.
---- 실온에서 원심분리기(20-25oC) 5분 동안, 적어도 3000g;
---- 상등액 유기상을 제거합니다.분석을 위해 기질 수상의 50μl를 취하십시오.
8.4 꿀
----균질화된 꿀 샘플 1.0±0.05g을 50ml 폴리스티렌 원심분리기 튜브에 넣습니다.
----탈이온수 4ml, 1M HCl 0.5ml(해결책3) 및 100μl 유도체 시약(해결책1);2분 동안 완전히 흔든다;
----37℃에서 하룻밤 동안 배양하십시오(약 16시간).
----5ml 0.1MK 추가2HPO4 (해결책2), 0.4ml 1M NaOH(해결책4) 에틸 아세테이트 5ml를 넣고 30초 동안 격렬하게 흔듭니다.
----상온(20-25℃)에서 10분간 원심분리, 최소 3000g;
----10ml의 깨끗한 유리관에 상등액 유기상 2.5ml를 취하고 50-60℃ 질소 가스 또는 회전 증발기로 건조시킵니다.
----건조한 잔여물을 n-헥산(또는 n-헵탄) 1ml로 녹이고 30초 동안 vortex하고 추출 용액 1ml를 추가합니다(해결책5) 1분간 vortex하여 완전히 섞는다.
----상온에서 원심분리기(20-25oC) 10분 동안, 적어도 3000g;
----상등액 유기상을 제거합니다.분석을 위해 기질 수상의 50μl를 취하십시오.
- 9.분석 과정
9.1분석 전 주의 사항
9.1.1 모든 시약과 마이크로웰은 모두 실온(20~25℃)에 있어야 합니다.
9.1.2 나머지 시약은 모두 사용 후 즉시 2-8℃로 되돌린다.
9.1.3 마이크로웰을 올바르게 세척하는 것은 분석 과정에서 중요한 단계입니다.이는 ELISA 분석의 재현성에 중요한 요소입니다.
9.1.4 배양하는 동안 빛을 피하고 마이크로웰을 덮습니다.
9.2 분석 단계
9.2.1 모든 시약은 실온(20-25℃)에서 30분 이상 꺼내어 균질화한 후 사용한다.
9.2.2 필요한 마이크로웰을 꺼내고 나머지는 즉시 2-8℃의 지퍼백에 다시 넣습니다.
9.2.3 농축 세척액과 농축 추출액은 사용하기 전에 상온이 되도록 재가열해야 합니다.
9.2.4숫자:모든 마이크로웰 위치에 번호가 매겨져 있으며 모든 표준 및 샘플은 이중으로 실행되어야 합니다.표준 및 샘플 위치를 기록합니다.
9.2.5농축된 항체 용액의 희석: 농축된 효소용액을 효소복합체희석제로 1:10의 부피비로 희석한다.
9.2.6표준용액/시료 및 효소접합액 첨가: 표준용액 또는 준비된 시료 50µl를 해당 well에 넣고 효소결합액 50µl를 넣는다.플레이트를 수동으로 흔들어 부드럽게 혼합하고 25℃에서 30분 동안 뚜껑을 덮고 배양합니다.
9.2.7씻다: 덮개를 부드럽게 제거하고 웰에서 액체를 부어 마이크로웰을 250µl의 희석된 세척액으로 헹굽니다(해결책6) 10초 간격으로 4~5회 실시한다.흡수지로 남은 수분을 흡수합니다(남은 기포는 사용하지 않은 팁으로 제거할 수 있습니다).
9.2.8천연색: 각 well에 기질용액 A 50ul와 기질용액 B 50ul를 첨가합니다.플레이트를 수동으로 흔들어 부드럽게 혼합하고 25℃에서 15분 동안 덮개를 덮고 배양합니다(12.8 참조).
9.2.11측정하다: stop solution을 각 well에 50µl씩 넣는다.손으로 plate를 가볍게 흔들어 섞은 후 450nm에서 흡광도를 측정한다.
10 결과
10.1백분율 흡광도
표준물질과 시료에 대해 얻은 흡광도 값의 평균값을 첫 번째 표준물질(제로 표준물질)의 흡광도 값으로 나누고 100%를 곱합니다.따라서 제로 표준은 100%와 같게 만들고 흡광도 값은 백분율로 표시됩니다.
=
B ——흡광도 표준(또는 시료)
B0 ——흡광도 영점 기준
10.2표준 곡선
----표준 곡선을 그리려면: 표준의 흡광도 값을 y축으로, AOZ 표준 용액 농도(ppb)의 반로그를 x축으로 합니다.
----검량선에서 읽을 수 있는 각 샘플의 AOZ 농도(ppb)에 각 샘플의 해당 희석 계수를 곱하고 샘플의 실제 농도를 얻습니다.
주의하십시오:
모든 데이터 축소를 위한 특수 소프트웨어가 개발되었으며 요청 시 제공할 수 있습니다.
희석배수.........................................2
10.감도, 정확도 및 정밀도
감광도: 0.025ppb
탐지 한계:
조직(근육, 간) ........................0.1ppb
꿀------------------------------------------------- -0.1ppb
정확성:
동물 조직(근육 및 간) ...... 100±20%
꿀 .................................................................................. 100±20%
정도:ELISA 키트의 CV는 10% 미만입니다.
11.알아채다
12.1 시약과 시료가 실온(20-25℃)으로 조절되지 않으면 표준물질과 시료에 대해 얻은 흡광도 값의 평균값이 감소합니다.
12.2 실패한 재현성을 피하기 위해 단계 사이에 마이크로웰이 건조되지 않도록 하고 마이크로웰 홀더를 탭한 직후 다음 단계를 작동합니다.
12.3 사용하기 전에 각 시약을 부드럽게 흔든다.
12.4 정지 용액에서 피부를 멀리 유지하십시오. 0.5MH입니다.2SO4해결책.
12.5 오래된 키트를 사용하지 마십시오.다른 배치의 시약을 교환하지 마십시오. 그렇지 않으면 감도가 떨어집니다.
12.6 보관 조건: ELISA 키트는 2-8℃에서 보관하고 동결하지 마십시오.나머지 마이크로웰 플레이트를 밀봉하고, 모든 배양 동안 직사광선을 피하십시오.마이크로타이터 플레이트를 덮는 것이 좋습니다.
12.7 기질 용액이 변색되면 버려야 합니다.제로 표준의 흡광도 값(450/630nm)이 0.5 미만(A450nm<0.5)인 경우 시약이 변질될 수 있습니다.
12.8 착색 반응은 기질 용액 첨가 후 15분이 소요된다.색이 너무 연한 경우에는 배양시간을 20분 이상 연장할 수 있으며, 25분을 초과하지 마십시오.
12.9 최적 반응온도는 25℃이다.온도가 높거나 낮으면 감도 및 흡광도 값이 변경됩니다.
12.보관조건 및 보관기간
보관 조건: 2-8℃.
보관기간 : 12개월.
