Produit

1. 1.Hannergrond

Nitrofuraner si synthetesch Breetspektrum Antibiotike, déi dacks an der Déiereproduktioun fir seng exzellent antibakteriell an pharmakokinetesch Eegeschafte benotzt ginn.Si goufen och als Wuesstumspromotoren an der Schwein-, Gefligel- a Waasserproduktioun benotzt.A laangfristeg Studien mat Labo Déieren uginn datt d'Elteren Drogen an hir Metaboliten carcinogenic a mutagenic Charakteristiken gewisen.Dëst huet zu engem Verbuet vun Nitrofuraner gefouert fir d'Behandlung vun Déieren fir Liewensmëttelproduktioun benotzt.D'Nitrofuran Medikamenter Furaltadon, Nitrofurantoin an Nitrofurazon goufen an der EU an der Liewensmëtteldéiereproduktioun am Joer 1993 verbueden, an d'Benotzung vu Furazolidon war 1995 verbueden.

D'Analyse vun Nitrofuran Drogenreschter muss op der Detektioun vun den Tissu gebonnene Metaboliten vun den Nitrofuran Elterendeel baséiert ginn.Zënter datt d'Elteremedikamenter ganz séier metaboliséiert ginn, an d'Tissue gebonnen Nitrofuran Metaboliten fir eng laang Zäit behalen, ginn dës Metaboliten als Zil an der Detektioun vum Mëssbrauch vun Nitrofuranen benotzt, déi Furazolidon Metabolit (AOZ), Furaltadon Metabolit (AMOZ) enthalen. ), Nitrofurantoin Metabolit (AHD) an Nitrofurazon Metabolit (SEM).

AOZ-Reschte ginn am meeschten duerch LC-MS oder LC-MS/MS bestëmmt.Enzymimmunoassays, am Verglach mat chromatographesche Methoden, weisen bedeitend Virdeeler betreffend Sensibilitéit, Detektiounslimit, technesch Ausrüstung an Zäitbedarf.(Zäitpräis: 45min)

1. 2.Test Prinzip

Dësen ELISA Kit ass entwéckelt fir AOZ z'entdecken baséiert op dem Prinzip vun indirekt-kompetitiven Enzym Immunoassay.D'Mikrotiter Wells si mat capture BSA-verbonne Antigen beschichtet.AOZ an der Probe konkurréiert mam Antigen deen op der Mikrotiterplack beschichtet ass fir den Antikörper dobäigesat.No der Zousatz vun Enzymkonjugat gëtt chromogene Substrat benotzt an d'Signal gëtt mat engem Spektrofotometer gemooss.D'Absorptioun ass ëmgekéiert proportional zu der AOZ Konzentratioun an der Probe.

1. 3.Uwendungen

Dëse Kit kann a quantitativer a qualitativer Analyse vun AOZ Reschter benotzt ginnanima Stoffer(Muskel, Liewer etc), Hunneg.

1. 4.Kräiz-Reaktiounen

Furazolidon Metabolit (AOZ) …………………………..100%

Furaltadon Metabolit (AMOZ)………………… <0,1%

Nitrofurantoin Metabolit (AHD)………………………<0,1%

Nitrofurazon Metabolit (SEM)……………………………<0,1%

Furazolidon………………………………………………..…16,3%

Furaltadon………………………………………………..<1%

Nitrofurantoin………………………………………………………..<1%

Nitrofurazon…………………………………………………..…<1%

1. 5.Material néideg

5.1Equipementer

---- Mikrotiterplackspektrofotometer (450nm/630nm)

---- Rotary evaporator oder Stéckstoff drëschenen Instrumenter

---- Homogenisator / Stomacher

----Schacker

----Wirbelmixer

---- Zentrifuge

---- Analytesch Balance (Induktioun: 0.01g)

---- Graduéiert Pipette: 10ml

----Gummi Pipette Glühbir

----Volumetresch Fläsch: 100ml

----Glas Fläsch: 10ml

---- Polystyrol Zentrifuge Röhre: 2ml, 50ml

---- Mikropipetten: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Reagens

---- Ethylacetat (AR)

---- n-hexan (oder n-heptan) (AR)

----Dikaliumwaasserstoffphosphattrihydrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Konzentréiert Salzsäure (HCl, AR)

----- Methanol

----Natriumhydroxid (NaOH, AR)

---- Deioniséiert Waasser

1. 6.Kit Komponente

l Mikrotiterplack mat Antigen beschichtet, 96 Wells

l Standard Léisungen (6 Fläschen, 1ml / Fläsch)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Spiking Standard Kontroll: (1ml / Fläsch).......100 ppb

l Konzentréiert Enzymkonjugat 1ml......roude Kap

l Enzymkonjugat Verdünnungsmëttel 10ml………..gréng Kap

l Substrat A 7ml……………………………………………….. wäiss Kap

l Substrat B 7ml………………………………………………..rot Kap

l Stop Léisung 7ml………………………………… giel Kap

l 20 × konzentréiert wäschen Léisung 40ml

………………………………………………………..transparent Kap

l 2× konzentréiert Extraktiounsléisung 60ml….blo Kap

l 2-Nitrobenzaldehyd 15.1mg ……………… wäiss Kap

1. 7.Reagens Virbereedung

Léisung 1: Derivatreagens:

Füügt 10ml Methanol an d'Fläsch mat 2-Nitrobenzaldehyd a léist op.(bei der Konzentratioun vun 10mM).

Léisung 2: 0,1 MK₂HPO₄Léisung:

Gewiicht 22,8g K₂HPO₄.3H₂O bis 1L deioniséiertem Waasser fir opzeléisen.

Léisung 3: 1M HCl Léisung

Opléisen 8,3 ml konzentréiert Salzsäure mat deioniséiertem Waasser op 100ml.

Léisung 4:1M NaOH Léisung

Opléisen 4g NaOH mat 100ml deioniséiertem Waasser.

Léisung 5: Extraktioun Léisung:

Verdünnt 2 × konzentréiert Extraktiounsléisung mat deioniséiertem Waasser am Volumenverhältnis vun 1: 1.Dës Léisung kann fir 1 Mount bei 4 ℃ konservéiert ginn, déi benotzt gëtt fir Proben ze extrahéieren.

Léisung 6: wäschen Léisung:

Verdünnt d'20 × konzentréiert Wäschléisung mat deioniséiertem Waasser an der Volumenverhältnis vun 1:19, déi benotzt gëtt fir d'Placken ze wäschen.Dës verdënntem Léisung kann 1 Mount bei 4 ℃ konservéiert ginn.

1. 8.Prouf Virbereedungen

8.1Notiz a Virsiichtsmoossname virun der Operatioun:

a) Benotzt w.e.g. eemoleg Tipps am Experiment, a ännert d'Spëtze wann Dir verschidde Reagens absorbéiert.

b) Vergewëssert Iech datt all experimentell Instrumenter propper sinn.

c) den Derivatreagens ka bei 2-8 ℃ fir dräi Méint konservéiert ginn;

d) D'HCl Léisung kann bei Raumtemperatur fir 3 Méint konservéiert ginn;

e) D'NaOH Léisung kann fir 3 Méint bei Raumtemperatur konservéiert ginn;

f) Halt onbehandelt Proben am Gefrier (-20 ℃);

g) Behandelt Proben kënne fir 24h bei 2-8 ℃ an der Däischtert konservéiert ginn.

8.2 Déier Tissue an Liewer Echantillon:

---- Homogenize d'Proben mat Homogenisator;

---- Gewiicht 1,0 ± 0,05g vun der homogenized Tissue Prouf an 50ml polystyrene Zentrifuge Rouer.Füügt 4ml deioniséiertem Waasser, 0,5ml 1M HCl Léisung an 100ul Derivatreagens (kuckt Léisung 1).Shake et fir 2min.

---- Inkubéiert bei 37 ℃ Iwwernuechtung (ongeféier 16h);

---- Add 5ml 0.1MK₂HPO₄ (Léisung2), 0,4 ml 1M NaOH (Léisung4) an 5 ml Ethylacetat.Schüttelen hefteg fir 30s;

---- Zentrifuge bei Raumtemperatur (20-25 ℃) fir 10min, op d'mannst 3000g;

---- Huelt 2.5ml vun der supernatant organescher Phase an en 10ml proppert Glasröhre, dréchent mat 50-60 ℃ Stickstoffgas oder Rotatiounsverdamper;

---- Opléisen déi dréchen Iwwerreschter mat 1ml n-Hexan (oder n-Heptan), vortex fir 30s, add 1ml Extraktiounsléisung (Léisung5), vortex 1min, komplett mixen.

---- Zentrifuge bei Raumtemperatur (20-25^oC) fir 5min, op d'mannst 3000g;

---- Ewechzehuelen der supernatant organesch Phase;huelt 50μl vun der Substrat Waasserphase fir Assay.

8.4 Hunneg

---- Gewiicht 1,0 ± 0,05 g vun der homogeniséierter Hunnegprobe an e 50ml Polystyrol Zentrifuge Röhre;

---- 4ml deioniséiertem Waasser derbäi, 0,5ml 1M HCl (Léisung3) an 100μl Derivatreagens (Léisung1);2min komplett schüttelen;

---- Inkubéiert bei 37 ℃ Iwwernuechtung (ongeféier 16h);

---- 5ml 0.1MK derbäisetzen₂HPO₄ (Léisung2), 0,4 ml 1M NaOH (Léisung4) an 5ml Ethylacetat, schüttelen fir 30s hefteg;

---- Zentrifuge bei Raumtemperatur (20-25 ℃) fir 10min, op d'mannst 3000g;

---- Huelt 2.5ml vun der supernatant organescher Phase an en 10ml proppert Glasröhrchen, dréchent mat 50-60 ℃ Stickstoffgas oder Rotary evaporator;

----Léiss déi trocken Iwwerreschter mat 1ml n-Hexan (oder n-Heptan) op, vortex fir 30s, füügt 1ml Extraktiounsléisung (Léisung5), vortex 1min, komplett mixen.

---- Zentrifuge bei Raumtemperatur (20-25^oC) fir 10min, op d'mannst 3000g;

---- Ewechzehuelen der supernatant organesch Phase;huelt 50μl vun der Substrat Waasserphase fir Assay.

1. 9.Assay Prozess

9.1Notiz virum Assay

9.1.1 Vergewëssert Iech datt all Reagenzen a Mikrowellen all bei Raumtemperatur (20-25 ℃) sinn.

9.1.2 Gitt all d'Reschtreagenz direkt nom Gebrauch op 2-8 ℃ zréck.

9.1.3 D'Mikrowellen richteg wäschen ass e wichtege Schrëtt am Prozess vun der Assay;et ass de vitale Faktor fir d'Reproduktioun vun der ELISA Analyse.

9.1.4 Vermeit d'Liicht an deckt d'Mikrowellen während der Inkubatioun.

9.2 Assay Schrëtt

9.2.1 Huelt all Reagenz bei Raumtemperatur (20-25 ℃) fir méi wéi 30min eraus, homogeniséiert virum Gebrauch.

9.2.2 Huelt déi néideg Mikrowellen eraus a bréngt de Rescht direkt an d'Zip-Lockbeutel bei 2-8 ℃ zréck.

9.2.3 D'konzentréiert Wäschléisung an d'konzentréiert Extraktiounsléisung solle virum Gebrauch erwiermt ginn fir bei Raumtemperatur ze sinn.

9.2.4Zuel:Nummeréiert all Mikrowell Positiounen an all Standarden a Proben sollen an Duplikat lafen.Notéiert d'Standarden a Proben Positiounen.

9.2.5Verdünnung vu konzentréierter Antikörperléisung: verdünnt déi konzentréiert Enzymléisung mat Enzymkonjugatverdünnungen am Volumenverhältnis vun 1:10 (1-fach konzentréiert Enzymléisung: 10-fach Enzymkonjugatverdünnter).

9.2.6Füügt Standardléisung / Probe an Enzymkonjugatléisung derbäi: füügt 50 μl Standardléisung oder preparéiert Probe an entspriechend Wellen derbäi, füügt 50 μl Enzymkonjugatléisung.Mix sanft andeems Dir d'Plack manuell rëselt a fir 30min bei 25 ℃ mat Deckel inkubéiert.

9.2.7Wäschen: Huelt den Deckel sanft ewech a schëdd d'Flëssegkeet aus de Brunnen a spült d'Mikrowellen mat 250µl verdënntem Wäschléisung (Léisung6) am Intervall vun 10s fir 4-5 Mol.Absorbéieren de Rescht Waasser mat absorbéierend Pabeier (déi Rescht Loftblase kann mat onbenotzten Tipp eliminéiert ginn).

9.2.8Faarf: Fügt 50μl Substratléisung A an 50μl Substratléisung B an all Brunn.Mix sanft andeems Dir d'Plack manuell rutscht a fir 15min bei 25 ℃ mat Deckel inkubéieren (kuckt 12.8).

9.2.11Moossnam: Füügt 50μl der Stoppléisung an all Brunn.Mix sanft andeems Dir d'Plack manuell rutscht a moosst d'Absorptioun bei 450nm (Et huet virgeschloen Moossname mat der Dual-Wellelängt vu 450/630nm. Liest d'Resultat bannent 5min no der Zousatz vun der Stopléisung.)

10 Resultater

10.1Prozentsaz Absorptioun

D'Duerchschnëttswäerter vun den Absorptiounswäerter, déi fir d'Standarden an d'Proben kritt goufen, ginn gedeelt duerch den Absorptiounswäert vum éischte Standard (Nullstandard) a multiplizéiert mat 100%.Den Nullstandard gëtt also gläich 100% gemaach an d'Absorptiounswäerter ginn a Prozentzuelen zitéiert.

=

B - Absorptiounsstandard (oder Probe)

B0 - Absorptioun Null Norm

10.2Standard Curve

---- Fir eng Standardkurve ze zéien: Huelt den Absorptiounswäert vun de Standarden als Y-Achs, semi-logarithmesch vun der Konzentratioun vun der AOZ Standardléisung (ppb) als x-Achs.

---- D'AOZ Konzentratioun vun all Probe (ppb), déi aus der Kalibrierungskurve gelies ka ginn, gëtt multiplizéiert mam entspriechende Verdünnungsfaktor vun all Probe gefollegt, an déi aktuell Konzentratioun vun der Probe gëtt kritt.

Notéiert w.e.g.:

Fir all Datereduktioun gouf speziell Software entwéckelt, déi op Ufro zur Verfügung gestallt ka ginn.

Verdünnungsfaktor………………………………………………… 2

10.Sensibilitéit, Genauegkeet a Präzisioun

Sensibilitéit: 0.025 ppb

Detektioun Limit:

Tissue (Muskel, Liewer)…………………………0.1ppb

Hunneg------------------------------------------------- -0.1 ppb

Genauegkeet:

Déieregewebe (Muskel a Liewer)…………………………100±20%

Hunneg……………………………………………………… 100±20%

Präzisioun:CV vum ELISA Kit ass manner wéi 10%.

11.Notiz

12.1 D'Duerchschnëttswäerter vun den Absorptiounswäerter, déi fir d'Standarden an d'Proben kritt goufen, ginn reduzéiert wann d'Reagenser a Proben net op Raumtemperatur (20-25 ℃) geregelt goufen.

12.2 Erlaabt d'Mikrowellen net tëscht Schrëtt ze dréchen fir net erfollegräich Reproduzibilitéit ze vermeiden an de nächste Schrëtt direkt nodeems Dir de Mikrowellhalter tippt.

12.3 Shake all Reagent virum Gebrauch.

12.4 Halt Är Haut ewech vun der Stoppléisung well et den 0.5MH ass₂SO₄Léisung.

12.5 Benotzt d'Kits net aus dem Datum.Tauscht d'Reagente vu verschiddene Chargen net aus, soss fällt d'Sensibilitéit erof.

12.6 Späicherkonditioun: Halt d'ELISA Kits bei 2-8 ℃, net afréieren.Seal Rescht Mikrowell Placke, Vermeit direkt Sonneliicht wärend all Inkubatioun.Et ass recommandéiert d'Mikrotiterplacke ze decken.

12,7 Substrat Léisung soll opginn wann et Faarwen gëtt.D'Reagense kënnen verschlechtert ginn wann den Absorptiounswäert (450/630nm) vum Nullstandard manner wéi 0,5 (A450nm <0,5) ass.

12.8 D'Faarfreaktioun brauch 15min no der Zousatz vun der Substratléisung;Dir kënnt d'Inkubatiounszäit op 20min oder méi verlängeren, wann d'Faarf ze hell ass fir ze bestëmmen., ni iwwerschreiden 25min. Am Géigendeel, verkierzt d'Inkubatiounszäit richteg.

12.9 Déi optimal Reaktiounstemperatur ass 25 ℃.Méi héich oder manner Temperatur féiert zu Verännerunge vun der Empfindlechkeet an der Absorptiounswäerter.

12.Stockage Zoustand an Stockage Period

Stockage Zoustand: 2-8 ℃.

Stockage Period: 12 Méint.