Konkurētspējīgs enzīmu imūnanalīzes komplekts furazolidona metabolīta (AOZ) kvantitatīvai analīzei
- 1.Fons
Nitrofurāni ir sintētiskas plaša spektra antibiotikas, kuras bieži izmanto lopkopībā to lielisko antibakteriālo un farmakokinētisko īpašību dēļ.Tie tika izmantoti arī kā augšanas veicinātāji cūku, mājputnu un ūdens audzēšanā.Ilgtermiņa pētījumos ar laboratorijas dzīvniekiem tika konstatēts, ka sākotnējām zālēm un to metabolītiem bija kancerogēnas un mutagēnas īpašības.Līdz ar to ir aizliegts lietot nitrofurānus tādu dzīvnieku ārstēšanai, kurus izmanto pārtikas ražošanā.Nitrofurāna zāles furaltadons, nitrofurantoīns un nitrofurazons ES aizliedza lietot pārtikas dzīvnieku audzēšanā 1993. gadā, bet furazolidona lietošana tika aizliegta 1995. gadā.
Nitrofurāna zāļu atlieku analīzei jābalstās uz nitrofurāna pamatzāļu ar audiem saistīto metabolītu noteikšanu.Tā kā sākotnējās zāles tiek ļoti ātri metabolizētas un ar audiem saistītie nitrofurāna metabolīti saglabājas ilgu laiku, šie metabolīti tiek izmantoti kā mērķis, lai noteiktu nitrofurānu ļaunprātīgu izmantošanu, tostarp furazolidona metabolītu (AOZ), furaltadona metabolītu (AMOZ). ), nitrofurantoīna metabolīts (AHD) un nitrofurazona metabolīts (SEM).
AOZ atlikumus visbiežāk nosaka ar LC-MS vai LC-MS/MS.Enzīmu imūntesti, salīdzinot ar hromatogrāfijas metodēm, uzrāda ievērojamas priekšrocības attiecībā uz jutīgumu, noteikšanas robežu, tehnisko aprīkojumu un laika prasībām.(Laika izmaksas: 45 minūtes)
- 2.Testa princips
Šis ELISA komplekts ir paredzēts AOZ noteikšanai, pamatojoties uz netiešās konkurējošās enzīmu imūntesta principu.Mikrotitra iedobes ir pārklātas ar uztveršanas BSA saistītu antigēnu.AOZ paraugā konkurē ar antigēnu, kas pārklāts uz mikrotitrēšanas plāksnes par pievienoto antivielu.Pēc fermentu konjugāta pievienošanas izmanto hromogēno substrātu un signālu mēra ar spektrofotometru.Absorbcija ir apgriezti proporcionāla AOZ koncentrācijai paraugā.
- 3.Lietojumprogrammas
Šo komplektu var izmantot AOZ atlieku kvantitatīvā un kvalitatīvā analīzēanima audi(muskuļi, aknas utt.), medus.
- 4.Savstarpējas reakcijas
Furazolidona metabolīts (AOZ)……………………..100%
Furaltadona metabolīts (AMOZ)……………………<0,1%
Nitrofurantoīna metabolīts (AHD)……………………<0,1%
Nitrofurazona metabolīts (SEM)………………………<0,1%
Furazolidons…………………………………….…..…16,3%
Furaltadons…………………………………………….…<1%
Nitrofurantoīns…………………………………….…….…<1%
Nitrofurazons…………………………………………..<1%
- 5.Nepieciešamie materiāli
5.1Aprīkojums
----Mikrotitra plates spektrofotometrs (450nm/630nm)
----Rotācijas iztvaicētājs vai slāpekļa žāvēšanas instrumenti
----Homogenizators /vēders
----Šeikeris
----Vortex mikseris
----Centrifūga
----Analītiskie svari (induktivitāte: 0,01g)
----Pipete ar graduāciju: 10 ml
----Gumijas pipetes spuldze
----Mērkolba: 100ml
----Stikla kolba: 10ml
----Polistirola centrifūgas caurule: 2ml, 50ml
----Mikropipetes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,
250ul-multipipete
5.2Reaģenti
----Etilacetāts (AR)
----n-heksāns (vai n-heptāns) (AR)
----Dikālija hidrogēnfosfāta trihidrāts
(K2HPO4.3H2O) (AR)
----koncentrēta sālsskābe (HCl, AR)
-----Metanols
---- nātrija hidroksīds (NaOH, AR)
----Dejonizēts ūdens
- 6.Komplekta sastāvdaļas
l Ar antigēnu pārklāta mikrotitra plāksne, 96 iedobes
l Standarta šķīdumi (6 pudeles, 1 ml uz pudeli)
0ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb
l Standarta kontrole: (1ml/pudele)....100 ppb
l Koncentrēts enzīmu konjugāts 1ml.....sarkans vāciņš
l Enzīmu konjugāta šķīdinātāji 10ml………..zaļš vāciņš
l Substrāts A 7ml……………………………..balts vāciņš
l Substrāts B 7ml……………………………..sarkans vāciņš
l Stop šķīdums 7ml………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
l 20×koncentrēts mazgāšanas šķīdums 40ml
…………………………………….……caurspīdīgs vāciņš
l 2×koncentrēts ekstrakcijas šķīdums 60ml….zils vāciņš
l 2-nitrobenzaldehīds 15,1 mg………………………………………………………………………………
- 7.Reaģentu sagatavošana
Risinājums 1: atvasināts reaģents:
Pievienojiet 10 ml metanola pudelē ar 2-nitrobenzaldehīdu un izšķīdiniet.(koncentrācijā 10 mM).
Risinājums 2: 0,1 MK2HPO4risinājums:
Sver 22,8 g K2HPO4.3H2O līdz 1 l dejonizēta ūdens, lai izšķīdinātu.
Risinājums 3: 1M HCl šķīdums
Izšķīdiniet 8,3 ml koncentrētas sālsskābes ar dejonizētu ūdeni līdz 100 ml.
4. risinājums:1M NaOH šķīdums
Izšķīdiniet 4 g NaOH ar 100 ml dejonizēta ūdens.
5. risinājums: ekstrakcijas šķīdums:
Atšķaida 2x koncentrētu ekstrakcijas šķīdumu ar dejonizētu ūdeni tilpuma attiecībā 1:1.Šo šķīdumu var uzglabāt 1 mēnesi 4 ℃ temperatūrā, ko izmantos paraugu ekstrahēšanai.
Risinājums 6: mazgāšanas šķīdums:
20x koncentrēto mazgāšanas šķīdumu atšķaida ar dejonizētu ūdeni tilpuma attiecībā 1:19, kas tiks izmantots plākšņu mazgāšanai.Šo atšķaidīto šķīdumu var uzglabāt 1 mēnesi 4 ℃ temperatūrā.
- 8.Paraugu sagatavošana
8.1Paziņojums un piesardzības pasākumi pirms darbības:
a) Lūdzu, eksperimentā izmantojiet vienreizējus uzgaļus un mainiet uzgaļus, absorbējot dažādus reaģentus.
b) Pārliecinieties, vai visi eksperimentālie instrumenti ir tīri.
c) atvasināto reaģentu var uzglabāt 2-8 ℃ temperatūrā trīs mēnešus;
d) HCl šķīdumu var uzglabāt istabas temperatūrā 3 mēnešus;
e) NaOH šķīdumu istabas temperatūrā var uzglabāt 3 mēnešus;
f) Glabājiet neapstrādātus paraugus sasaldē (-20 ℃);
g) Apstrādātos paraugus var uzglabāt 24 stundas 2–8 ℃ tumsā.
8.2. Dzīvnieku audu un aknu paraugi:
----Homogenizēt paraugus ar homogenizatoru;
----Iesveriet 1,0±0,05 g homogenizētā audu parauga 50 ml polistirola centrifūgas mēģenē.Pievienojiet 4 ml dejonizēta ūdens, 0,5 ml 1 M HCl šķīduma un 100 ul atvasinātā reaģenta (skatīt 1. šķīdumu).Kratiet to 2 minūtes.
---- Inkubēt 37℃ nakti (apmēram 16h);
---- Pievienot 5ml 0,1MK2HPO4 (risinājums2), 0,4 ml 1 M NaOH (risinājums4) un 5 ml etilacetāta.Spēcīgi krata 30s;
---- Centrifugēt istabas temperatūrā (20-25℃) 10 min, vismaz 3000g;
---- Ņem 2,5 ml supernatanta organiskās fāzes 10 ml tīra stikla mēģenē, nosusina ar 50-60 ℃ slāpekļa gāzi vai rotācijas iztvaicētāju;
---- Izšķīdiniet sauso atlikumu ar 1 ml n-heksāna (vai n-heptāna), maisiet vorteksu 30 sekundes, pievienojiet 1 ml ekstrakcijas šķīduma (risinājums5), maisīt 1 minūti, pilnībā samaisīt.
---- Centrifūga istabas temperatūrā (20-25oC) 5 minūtes, vismaz 3000g;
---- Noņem virspusē esošo organisko fāzi;ņem 50 μl substrāta ūdens fāzes analīzei.
8.4 Medus
----iesver 1,0±0,05 g homogenizētā medus parauga 50 ml polistirola centrifūgas mēģenē;
---- Pievienojiet 4 ml dejonizēta ūdens, 0,5 ml 1 M HCl (risinājums3) un 100 μl atvasināta reaģenta (risinājums1);pilnībā krata 2 minūtes;
----Inkubēt 37℃ nakti (apmēram 16h);
----Pievieno 5ml 0,1MK2HPO4 (risinājums2), 0,4 ml 1 M NaOH (risinājums4) un 5 ml etilacetāta, spēcīgi krata 30 sekundes;
----Centrifugēt istabas temperatūrā (20-25℃) 10 min, vismaz 3000g;
----Ieliet 2,5 ml supernatanta organiskās fāzes 10 ml tīra stikla mēģenē, nosusiniet ar slāpekļa gāzi 50-60 ℃ vai rotācijas iztvaicētāju;
---- Izšķīdiniet sauso atlikumu ar 1 ml n-heksāna (vai n-heptāna), maisiet vorteksu 30 sekundes, pievienojiet 1 ml ekstrakcijas šķīduma (risinājums5), maisīt 1 minūti, pilnībā samaisīt.
----Centrifugēt istabas temperatūrā (20-25oC) 10 min, vismaz 3000g;
----Noņemiet virspusē esošo organisko fāzi;ņem 50 μl substrāta ūdens fāzes analīzei.
- 9.Pārbaudes process
9.1Piezīme pirms testa
9.1.1 Pārliecinieties, vai visi reaģenti un mikroiedobes ir istabas temperatūrā (20-25 ℃).
9.1.2 Tūlīt pēc lietošanas visus atlikušos reaģentus atgrieziet uz 2–8 ℃.
9.1.3. Pareiza mikrodobumu mazgāšana ir svarīgs testa procesa posms;tas ir būtisks ELISA analīzes reproducējamības faktors.
9.1.4. Inkubācijas laikā izvairieties no gaismas un pārklājiet mikroiedobes.
9.2. Pārbaudes soļi
9.2.1 Izņemiet visus reaģentus istabas temperatūrā (20-25 ℃) ilgāk par 30 minūtēm, pirms lietošanas homogenizējiet.
9.2.2 Nekavējoties izņemiet vajadzīgās mikroiedobes un pārējās ielieciet atpakaļ maisā ar rāvējslēdzēju 2–8 ℃ temperatūrā.
9.2.3. Koncentrētais mazgāšanas šķīdums un koncentrētais ekstrakcijas šķīdums pirms lietošanas atkārtoti jāsasilda, lai tie būtu istabas temperatūrā.
9.2.4Numurs:Numurētas katras mikroiedobes pozīcijas un visi standarti un paraugi ir jāpalaiž divos eksemplāros.Ierakstiet standartus un paraugu pozīcijas.
9.2.5Koncentrēta antivielu šķīduma atšķaidīšana: atšķaida koncentrēto enzīmu šķīdumu ar enzīmu konjugāta šķīdinātājiem tilpuma attiecībā 1:10 (1 reizi koncentrēts enzīmu šķīdums: 10 reizes enzīmu konjugāta šķīdinātāji).
9.2.6Pievienojiet standartšķīdumu/paraugu un fermentu konjugāta šķīdumu: pievienojiet 50 µl standartšķīduma vai sagatavotā parauga attiecīgajām iedobēm, pievienojiet 50 µl fermentu konjugāta šķīduma.Viegli samaisiet, manuāli kratot plati, un inkubējiet 30 minūtes 25 ℃ ar vāku.
9.2.7Mazgāt: Uzmanīgi noņemiet vāku un izlejiet šķidrumu no iedobēm un izskalojiet mikroiedobes ar 250 µl atšķaidīta mazgāšanas šķīduma (risinājums6) ar intervālu 10s 4-5 reizes.Absorbējiet atlikušo ūdeni ar absorbējošu papīru (pārējo gaisa burbuli var likvidēt ar neizmantoto galu).
9.2.8Krāsojums: Katrai iedobei pievienojiet 50 µl substrāta A šķīduma un 50 ul substrāta šķīduma B.Viegli samaisiet, manuāli šūpojot plati, un inkubējiet 15 minūtes 25 ℃ ar vāku (skatīt 12.8.).
9.2.11Mērs: katrā iedobē pievienojiet 50 µl apturēšanas šķīduma.Viegli samaisiet, manuāli šūpojot plāksni, un izmēra absorbciju pie 450 nm (ieteica mērīt ar dubultviļņu garumu 450/630 nm. Nolasiet rezultātu 5 minūšu laikā pēc apturēšanas šķīduma pievienošanas.)
10 Rezultāti
10.1Procentuālā absorbcija
Standartiem un paraugiem iegūtās absorbcijas vērtību vidējās vērtības dala ar pirmā standarta absorbcijas vērtību (nulles standarts) un reizina ar 100%.Tādējādi nulles standarts ir vienāds ar 100%, un absorbcijas vērtības ir norādītas procentos.
=
B — absorbcijas standarts (vai paraugs)
B0 — absorbcijas nulles standarts
10.2Standarta līkne
----Lai uzzīmētu standarta līkni: Ņemiet standartu absorbcijas vērtību kā y asi, bet AOZ standartšķīduma koncentrācijas (ppb) puslogaritmisko vērtību kā x asi.
----Katra parauga AOZ koncentrāciju (ppb), ko var nolasīt no kalibrēšanas līknes, reizina ar katra parauga atbilstošo atšķaidījuma koeficientu un iegūst parauga faktisko koncentrāciju.
Lūdzu, ievērojiet:
Visai datu samazināšanai ir izstrādāta speciāla programmatūra, kuru var nodrošināt pēc pieprasījuma.
Atšķaidīšanas koeficients……………………………………………………2
10.Jutīgums, precizitāte un precizitāte
Jutīgums: 0,025 ppb
Atklāšanas ierobežojums:
Audi (muskuļi, aknas)………………………… 0,1 ppb
Mīļā-------------------------------------------------- -0,1 ppb
Precizitāte:
Dzīvnieku audi (muskuļi un aknas)…………………100±20%
Medus………………………………………………….. 100±20%
Precizitāte:ELISA komplekta CV ir mazāks par 10%.
11.Paziņojums
12.1. Standartiem un paraugiem iegūtās absorbcijas vērtību vidējās vērtības tiks samazinātas, ja reaģenti un paraugi nav noregulēti līdz istabas temperatūrai (20-25℃).
12.2. Neļaujiet mikroiedobēm izžūt starp soļiem, lai izvairītos no neveiksmīgas reproducēšanas, un veiciet nākamo darbību uzreiz pēc tam, kad piesitiet mikrodobumu turētājam.
12.3 Pirms lietošanas katru reaģentu viegli sakratiet.
12.4. Sargājiet ādu no pieturas šķīduma, jo tas ir 0,5 MH2SO4risinājums.
12.5. Neizmantojiet novecojušus komplektus.Nemainiet dažādu partiju reaģentus, pretējā gadījumā samazināsies jutība.
12.6 Uzglabāšanas nosacījumi: Glabājiet ELISA komplektus 2–8 ℃ temperatūrā, nesasaldējiet.Aizveriet atlikušās mikroiedobes plāksnes. Visu inkubāciju laikā izvairieties no tiešas saules gaismas.Ieteicams pārklāt mikrotitrēšanas plāksnes.
12.7. Pamatnes šķīdums ir jāatsakās, ja tas iekrāsojas.Reaģenti var tikt bojāti, ja nulles standarta absorbcijas vērtība (450/630 nm) ir mazāka par 0,5 (A450 nm < 0,5).
12.8. Krāsošanas reakcijai nepieciešamas 15 minūtes pēc substrāta šķīduma pievienošanas;Jūs varat pagarināt inkubācijas laiku līdz 20 min vai ilgāk, ja krāsa ir pārāk gaiša, lai noteiktu, nekad nepārsniedziet 25 min. Gluži pretēji, pareizi saīsiniet inkubācijas laiku.
12.9 Optimālā reakcijas temperatūra ir 25 ℃.Augstāka vai zemāka temperatūra izraisīs jutības un absorbcijas vērtību izmaiņas.
12.Uzglabāšanas stāvoklis un uzglabāšanas laiks
Uzglabāšanas stāvoklis: 2-8℃.
Uzglabāšanas laiks: 12 mēneši.
