vokatra

1. 1.lafika

Ny Nitrofurans dia antibiotika synthetic malalaka, izay ampiasaina matetika amin'ny famokarana biby noho ny fananana antibakteria sy pharmacokinetic tena tsara.Nampiasaina koa izy ireo ho fampiroboroboana ny fitomboana amin'ny famokarana kisoa, akoho amam-borona ary rano.Tao anatin'ny fandalinana maharitra miaraka amin'ny biby laboratoara dia naneho fa ny zava-mahadomelina sy ny metabolitany dia naneho toetra karsinogène sy mutagenic.Izany dia nitarika ho amin'ny fandrarana ny nitrofurans amin'ny fitsaboana ny biby ampiasaina amin'ny famokarana sakafo.Ny zava-mahadomelina nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin ary nitrofurazone dia voarara tsy hampiasaina amin'ny famokarana biby sakafo ao amin'ny EU tamin'ny 1993, ary voarara ny fampiasana furazolidone tamin'ny 1995.

Ny famakafakana ny sisa tavela amin'ny zava-mahadomelina nitrofuran dia tokony hiorina amin'ny fahitana ny metabolites mifatotra amin'ny tavy amin'ny zava-mahadomelina nitrofuran.Koa satria ny zava-mahadomelina ray aman-dreny dia tena haingana metabolized, ary ny tasy mifatotra nitrofuran metabolites hihazona nandritra ny fotoana ela, ireo metabolites dia ampiasaina ho lasibatra amin'ny fitadiavana ny fanararaotana ny nitrofurans, izay ahitana Furazolidone metabolite (AOZ), Furaltadone metabolite (AMOZ). ), Nitrofurantoin metabolite (AHD) ary Nitrofurazone metabolite (SEM).

Ny sisa AOZ dia voafaritra matetika amin'ny LC-MS na LC-MS/MS.Enzyme immunoassays, raha ampitahaina amin'ny fomba chromatography, dia mampiseho tombony lehibe momba ny fahatsapana, ny fetran'ny fitiliana, ny fitaovana ara-teknika ary ny fitakiana fotoana.(Lany fotoana: 45min)

1. 2.Fitsipika fitsapana

Ity kitapo ELISA ity dia natao hamantarana ny AOZ mifototra amin'ny fitsipiky ny immunoassay anzima tsy mivantana-mifaninana.Ny lavaka fantsakana microtiter dia rakotra antigène mifandray amin'ny BSA.Ny AOZ amin'ny santionany dia mifaninana amin'ny antigène mipetaka amin'ny takelaka microtiter ho an'ny antibody ampiana.Aorian'ny fampidirana ny conjugate anzima, ny substrate chromogenic dia ampiasaina ary ny famantarana dia refesina amin'ny spectrophotometer.Mifanohitra amin'ny fifantohan'ny AOZ ao amin'ny santionany ny fisoronana.

1. 3.Applications

Ity kitapo ity dia azo ampiasaina amin'ny famakafakana quantitative sy qualitative ny sisa AOZ intissues anima(hozatra, aty sns), tantely.

1. 4.Fihetseham-po

Furazolidone metabolite (AOZ) ………………………..100%

Furaltadone metabolite (AMOZ)……………………<0.1%

Nitrofurantoin metabolite (AHD)……………………<0.1%

Nitrofurazone metabolite (SEM)…………………………...<0.1%

Furazolidone………………………………………………..16.3%

Furaltadone……………………………………………………<1%

Nitrofurantoin……………………………………………….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………..<1%

1. 5.Fitaovana ilaina

5.1Fitaovana

----Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)

----Evaporator rotary na fitaovana fanamainana azota

----Homogenizer / vavony

----Shaker

----Vortex mixer

----Centrifuge

----Mandanjalanja analytique (inductance: 0.01g)

----Pipette nahazo diplaoma: 10ml

----Fingotra pipette takamoa

---- Tavoahangy volumétrique: 100ml

---- Tavoahangy vera: 10ml

----Polystyrene centrifuge fantsona: 2ml, 50ml

----Micropipettes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Reagents

----Ethyl acetate (AR)

----n-heksana (na n-heptana) (AR)

----Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Asidra hydrochloric (HCl, AR)

-----Methanol

----Sodium hydroxide (NaOH, AR)

----Rano deionized

1. 6.Kit Components

l Microtiter takelaka misy antigène, 96 lavadrano

L vahaolana mahazatra (6 tavoahangy, 1ml / tavoahangy)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Fanaraha-maso manara-penitra : (1ml/tavoahangy)........100ppb

l conjugate anzima mivondrona 1ml ........ satroka mena

l Enzyme conjugate diluent 10ml...........maitso

l substrate A 7ml……………………………………………………..satroka fotsy

l Sobika B 7ml………………………………………………..satroka mena

l Vahaolana atsaharo 7ml…………………………………satroka mavo

l 20 × vahaolana fanasan-damba 40ml

…………………………………..kapiny mangarahara

l 2 × vahaolana fitrandrahana mivondrona 60ml….satrony manga

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………white cap

1. 7.Reagents fanomanana

vahaolana 1: réagent derivative:

Ampio methanol 10ml ny tavoahangy misy 2-Nitrobenzaldehyde ary levona.(amin'ny fifantohana amin'ny 10mM).

vahaolana 2: 0.1MK₂HPO₄vahaolana:

Lanja 22.8g K₂HPO₄.3H₂O hatramin'ny 1L ny rano deionized mba levona.

vahaolana 3: Vahaolana HCl 1M

Levona 8.3ml asidra hydrochloric miaraka amin'ny rano deionized hatramin'ny 100ml.

Vahaolana 4:1M NaOH solution

levona 4g NaOH amin'ny 100ml deionized rano.

Vahaolana 5: vahaolana fitrandrahana:

Dilute 2×concentrated extraction solution with deionized water in the volume ratio of 1:1.Ity vahaolana ity dia azo tehirizina mandritra ny 1 volana amin'ny 4 ℃, izay hampiasaina amin'ny fitrandrahana santionany.

vahaolana 6: vahaolana manasa:

Esory amin'ny rano deionized ny vahaolana 20 × concentrated amin'ny fatran'ny volume 1:19, izay ampiasaina hanasana ny takelaka.Ity vahaolana voalefona ity dia azo tehirizina mandritra ny 1 volana amin'ny 4 ℃.

1. 8.Fanomanana santionany

8.1Fampandrenesana sy fitandremana alohan'ny fandidiana:

a) Azafady, ampiasao toro-hevitra tokana amin'ny fanandramana, ary ovay ny toro-hevitra rehefa misintona reagent samihafa.

b) Ataovy azo antoka fa madio avokoa ny fitaovana andrana rehetra.

c) ny derivative reagent azo voatahiry amin'ny 2-8 ℃ mandritra ny telo volana;

d) Ny vahaolana HCl dia azo tehirizina amin'ny mari-pana mandritra ny 3 volana;

e) Ny vahaolana NaOH dia azo tehirizina mandritra ny 3 volana amin'ny mari-pana amin'ny efitrano;

f) Tehirizo ny santionany tsy voatsabo ao anaty mangatsiaka (-20 ℃);

g) Ny santionany voatsabo dia azo tehirizina mandritra ny 24h amin'ny 2-8 ℃ ao anaty haizina.

8.2 Santionan'ny tavy sy atiny:

----Ataovy ny santionany amin'ny homogenizer;

---- Weight 1.0±0.05g ny homogenized sela santionany ho 50ml polystyrene centrifuge fantsona.Ampio rano deionized 4ml, vahaolana HCl 0,5ml 1M ary réagent derivative 100ul (jereo ny vahaolana 1).Afangaro mandritra ny 2 minitra.

---- Incubate amin'ny 37 ℃ mandritra ny alina (tokony ho 16h);

---- Ampio 5ml 0.1MK₂HPO₄ (vahaolana2), 0.4ml 1M NaOH (vahaolana4) ary 5ml ethyl acetate.Mihozongozona mafy mandritra ny 30s;

---- Centrifuge amin'ny mari-pana (20-25 ℃) mandritra ny 10min, farafahakeliny 3000g;

---- Raiso 2.5ml ny supernatant organika dingana ho 10ml madio fantsona fitaratra, maina amin`ny 50-60 ℃ entona azota na rotary evaporator;

---- Levona miaraka amin'ny 1ml n-hexane (na n-heptane) ny sisa maina, vortex mandritra ny 30s, ampio 1ml solution extraction (vahaolana5), vortex 1min, afangaro tanteraka.

---- Centrifuge amin'ny mari-pana (20-25^oC) mandritra ny 5min, farafahakeliny 3000g;

---- Esory ny dingana organika supernatant;Makà 50μl ny dingan'ny rano substrate ho an'ny fitiliana.

8.4 Tantely

----mandanja 1.0±0.05g ny santionany tantely homogenized ho 50ml polystyrene centrifuge fantsona;

----Ampiana rano 4ml deionized, 0,5ml 1M HCl (vahaolana3) ary 100μl derivative reagent (vahaolana1);kobanina tanteraka mandritra ny 2mn;

----Incubate amin'ny 37 ℃ mandritra ny alina (tokony ho 16h);

----Ampiana 5ml 0.1MK₂HPO₄ (vahaolana2), 0.4ml 1M NaOH (vahaolana4) ary 5ml ethyl acetate, mihozongozona mafy mandritra ny 30s;

----Centrifuge amin'ny mari-pana (20-25 ℃) mandritra ny 10min, farafahakeliny 3000g;

---- Raiso 2.5ml ny supernatant organika dingana ho 10ml madio fantsona fitaratra, maina amin`ny 50-60 ℃ entona azota na rotary evaporator;

----Aleo ny sisa maina miaraka amin'ny 1ml n-hexane (na n-heptane), vortex mandritra ny 30s, asio 1ml solution extraction (vahaolana5), vortex 1min, afangaro tanteraka.

----Centrifuge amin'ny mari-pana (20-25^oC) mandritra ny 10 minitra, farafahakeliny 3000g;

---- Esory ny dingana organika supernatant;Makà 50μl ny dingan'ny rano substrate ho an'ny fitiliana.

1. 9.Proces de assay

9.1Mariho alohan'ny fitsapana

9.1.1 Ataovy azo antoka fa ao amin'ny mari-pana (20-25 ℃) ny reagents sy microwell rehetra.

9.1.2 Avereno amin'ny 2-8 ℃ ny reagents sisa rehetra aorian'ny fampiasana azy.

9.1.3 Ny fanasana tsara ny microwells dia dingana lehibe amin'ny dingan'ny fitiliana;Izany no antony lehibe amin'ny famerenana indray ny fanadihadiana ELISA.

9.1.4 Halaviro ny hazavana ary sarony ny lavadrano mikraoba mandritra ny incubation.

9.2 Dingana Fanamarinana

9.2.1 Esory ny reagents rehetra amin'ny mari-pana (20-25 ℃) mihoatra ny 30min, homogenize alohan'ny fampiasana.

9.2.2 Esory ny microwells ilaina ary avereno any amin'ny kitapo zip-hidy amin'ny 2-8 ℃ avy hatrany ny ambiny.

9.2.3 Ny vahaolana fanasan-damba mivondrona sy ny vahaolana fitrandrahana mivondrona dia tokony havaozina mba ho amin'ny mari-pana alohan'ny hampiasana azy.

9.2.4laharana:Ny toeran'ny microwell rehetra ary ny fenitra sy ny santionany rehetra dia tokony atao dika mitovy.Raketo ny toerana misy ny fenitra sy ny santionany.

9.2.5Fandotoana ny vahaolana antibody mivondrona: manalefaka ny vahaolana anzima mivondrona miaraka amin'ny diluent anzima conjugate ao amin'ny tahan'ny volume 1:10 (vahan'ny anzima mivondrona 1: 10 miforitra ny diluent anzima conjugate).

9.2.6Ampio vahaolana / santionany sy vahaolana conjugate anzima: ampio 50µl ny vahaolana manara-penitra na santionany voaomana amin'ny fantsakana mifanandrify aminy, asio 50µl enzyme conjugate solution.Afangaro moramora amin'ny alalan'ny fanozongozonana ny lovia amin'ny tanana ary atsofohy mandritra ny 30 minitra amin'ny 25 ℃ miaraka amin'ny fonony.

9.2.7sasao madio: Esory moramora ny fonony ary aidino ny ranon-javatra avy amin'ny lavaka fantsakana ary kobanina amin'ny 250µl vahaolana fanasan-damba ny microwell (vahaolana6) amin'ny elanelan'ny 10s ho an'ny in-4-5.Atsofohy amin'ny taratasy misoroka ny rano sisa tavela (azo esorina amin'ny tendrony tsy ampiasaina ny bubble rivotra sisa).

9.2.8Fandokoana: Asio 50µl substrate solution A sy 50ul substrate solution B isaky ny lavadrano.Afangaro moramora amin'ny alalan'ny fanozongozonana ny takelaka amin'ny tanana ary atsangano mandritra ny 15min amin'ny 25 ℃ miaraka amin'ny fonony (jereo ny 12.8).

9.2.11ohatra: Asio 50µl ny solution stop isaky ny lavadrano.Afangaro moramora amin'ny alàlan'ny fanozongozonana ny takelaka amin'ny tanana ary refesina amin'ny 450nm ny fandrefesana ny haavon'ny rivotra (Nanomboka tamin'ny fandrefesana ny halavan'ny onjam-droa 450/630nm.

10 vokatra

10.1Fisorohana isan-jato

Ny sandan'ny sandan'ny absorbance azo ho an'ny fenitra sy ny santionany dia zaraina amin'ny sandan'ny absorbance amin'ny fenitra voalohany (standard zero) ary ampitomboina amin'ny 100%.Ny fenitra aotra dia atao mitovy amin'ny 100% ary ny soatoavin'ny absorbance dia voatonona amin'ny isan-jato.

=

B ——manara-penitra (na santionany)

B0 ——absorbance zero standard

10.2Standard Curve

----Mba hanao filaharana manara-penitra: Raiso ho axis y ny sandan'ny fatran'ny fenitra, semi-logarithmika ny fifantohan'ny vahaolana manara-penitra AOZ (ppb) ho x-axis.

----Ny fifantohan'ny AOZ isaky ny santionany (ppb), izay azo vakiana avy amin'ny curve calibration, dia ampitomboina amin'ny fandotoana mifanandrify amin'ny santionany tsirairay arahina, ary azo ny tena fifantohan'ny santionany.

Mariho azafady:

Ny rindrambaiko manokana dia novolavolaina ho an'ny fampihenana ny angona rehetra, izay azo omena amin'ny fangatahana.

Dilution factor……………………………………………..2

10.Fahatsapana, fahitsiana ary fahitsiana

fahatsapana: 0.025ppb

fetra hita maso:

Tavy (hozatra, aty)………………………………0.1ppb

Tantely --------------------------------------------------- -0.1ppb

Fahamarinana:

Tavy biby (hozatra sy atiny)…………………………100±20%

Tantely…………………………………………………… 100±20%

Precision:Ny CV an'ny kitapo ELISA dia latsaky ny 10%.

11.Mariho

12.1 Ny sandan'ny sandan'ny absorbance azo amin'ny fenitra sy ny santionany dia hihena raha toa ka tsy voafehy amin'ny mari-pana amin'ny efitrano ny reagents sy ny santionany (20-25 ℃).

12.2 Aza avela ho maina eo anelanelan'ny dingana ny microwells mba hialana amin'ny tsy fahombiazan'ny famokarana ary mandehana ny dingana manaraka avy hatrany aorian'ny fikapohana ny fitoeran'ny microwell.

12.3 Ahozongozona moramora ny reagent tsirairay alohan'ny hampiasana azy.

12.4 Arovy ny hoditrao amin'ny vahaolana fiatoana fa io no 0.5MH₂SO₄vahaolana.

12.5 Aza mampiasa ny kitapo efa lany andro.Aza mifanakalo ny reagents amin'ny andiany samihafa, fa raha tsy izany dia hampidina ny fahatsapana izany.

12.6 Toetran'ny fitahirizana: Tazony amin'ny 2-8 ℃ ny kitapo ELISA, aza mivaingana.Asio tombo-kase ny takelaka microwell, Fadio ny tara-masoandro mivantana mandritra ny incubation rehetra.Ny fandrakofana ny takelaka microtiter dia soso-kevitra.

12.7 Ny vahaolana amin'ny substrate dia tokony hajanona raha miova loko.Mety hiharatsy ny reagents raha latsaky ny 0.5 (A450nm <0.5) ny sandan'ny absorbance (450/630nm) amin'ny fenitra aotra.

12.8 Ny fanehoan-kevitra loko dia mila 15min aorian'ny fanampiana ny vahaolana substrate;Azonao atao ny manalava ny fotoana incubation hatramin'ny 20min na mihoatra raha maivana loatra ny lokony mba hamaritana., aza mihoatra ny 25min. Ny mifanohitra amin'izany, fohy ny fotoana incubation araka ny tokony ho.

12.9 Ny mari-pana fanehoan-kevitra tsara indrindra dia 25 ℃.Ny mari-pana ambony na ambany kokoa dia hitarika amin'ny fiovan'ny soatoavin'ny fahatsapan-tena sy ny assorance.

12.Fepetra fitahirizana sy fe-potoana fitahirizana

Toe-javatra fitahirizana: 2-8 ℃.

Fe-potoana fitahirizana: 12 volana.