hua

1. 1.Papamuri

Ko nga Nitrofurans he rongoa paturopi whanui-a-whanui, e whakamahia ana i te nuinga o nga wa i roto i te hanga kararehe mo ona taonga antibacterial me te pharmacokinetic pai.I whakamahia ano hoki hei kaiwhakatairanga tupu i roto i te poaka, te heihei me te hanga wai.I roto i nga rangahau mo te wa roa me nga kararehe taiwhanga i tohu ko nga raau taero matua me o raatau metabolites i whakaatu nga ahuatanga mate pukupuku me te mutagenic.Na tenei i aukati i nga nitrofurans mo te maimoatanga o nga kararehe e whakamahia ana mo te hanga kai.Ko nga raau taero nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin me te nitrofurazone i aukatihia mai i te whakamahi i roto i te hanga kararehe kai i roto i te EU i te 1993, a i aukatihia te whakamahi furazolidone i te 1995.

Ko te tātaritanga o te toenga o nga raau taero nitrofuran me whai i runga i te kitenga o nga metabolites herea o te kiko o nga raau matua nitrofuran.I te mea ko nga raau taero matua he tino tere te whakakoi, a ka mau tonu nga metabolites nitrofuran e herea ana ki te kiko mo te wa roa, ka whakamahia enei metabolites hei whaainga ki te kite i te kino o nga nitrofurans, tae atu ki te Furazolidone metabolite (AOZ), Furaltadone metabolite (AMOZ). ), Nitrofurantoin metabolite (AHD) me Nitrofurazone metabolite (SEM).

Ko nga toenga AOZ ka whakatauhia e te LC-MS, LC-MS/MS ranei.He maha nga painga e pa ana ki te tairongo, te rohe kitenga, nga taputapu hangarau me te wa e whakatauritea ana ki nga tikanga chromatographic.(Wā utu: 45min)

1. 2.Tikanga Whakamatau

I hangaia tenei kete ELISA ki te kite i te AOZ i runga i te maapono o te immunoassay enaa-kore-whakataetae.Ko nga puna microtiter kua pania ki te hopu antigen hono BSA.Ko te AOZ i roto i te tauira ka whakataetae me te antigen kua pania ki te pereti microtiter mo te antibody kua tapirihia.Whai muri i te taapiri o te conjugate enzyme, ka whakamahia te taputapu chromogenic ka ine te tohu ki te spectrophotometer.Ko te whakaurunga he rerekee ki te kukū AOZ i roto i te tauira.

1. 3.Nga tono

Ka taea te whakamahi i tenei kete ki te tātari ine me te kounga o te toenga AOZ i rotokopa anima(te uaua, ate etc), honi.

1. 4.Whakawhitiwhiti

Furazolidone metabolite (AOZ)……………………..100%

Furaltadone metabolite (AMOZ)……………………<0.1%

Nitrofurantoin metabolite (AHD)……………………<0.1%

Nitrofurazone metabolite (SEM)…………………………...<0.1%

Furazolidone………………………………………………..…16.3%

Furaltadone……………………………………………………<1%

Nitrofurantoin……………………………………………….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………..…<1%

1. 5.Nga Rauemi e hiahiatia ana

5.1Nga taputapu

----Tirohanga paraharaha paraharaha (450nm/630nm)

----Whakaoho hurihuri, taputapu whakamaroke hauota ranei

----Homogenizer / puku

----Riri

----Whakaranu Vortex

----Centrifuge

----Paitika tātari (whakauru: 0.01g)

----Pitita Paetahi: 10ml

---- Pupu paipa rapa

---- Puka Puka: 100ml

----Puka karaihe: 10ml

----Polystyrene centrifuge ngongo: 2ml, 50ml

----Micropipettes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Reagents

----Ethyl acetate (AR)

----n-hexane (n-heptane ranei) (AR)

----Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Wakawa pūmāota pūmāota (HCl, AR)

-----Mewaro

----Konutai waihā (NaOH, AR)

----Wai whakakorehia

1. 6.Nga Waahanga Kete

l pereti Microtiter kua pania ki te antigen, 96 puna

l Nga otinga paerewa(6 ipu,1ml/pounamu)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Te mana whakahaere paerewa : (1ml/pounamu)........100ppb

l Whakakotahitanga whākōkī pūmua 1ml........potae whero

l Nga waimeha conjugate enzyme 10ml...........potae matomato

l Raupapa A 7ml……………………………………………..potae ma

l Raupapa B 7ml………………………………………………..potae whero

l Whakamutua te wairewa 7ml………………………………….potae kōwhai

l 20×te otinga horoi horoi 40ml

………………………………….……puata maramara

l 2×te otinga tangohanga 60ml….potae puru

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg……………… potae ma

1. 7.Te Whakaritenga Reagents

Rongoā 1: reagent pärönaki:

Tāpirihia he 10ml o te mewaro ki te pounamu he 2-Nitrobenzaldehyde ka memeha.(i te kukū o te 10mM).

Rongoā 2: 0.1MK₂HPO₄otinga:

Paunatia 22.8g K₂HPO₄.3H₂O ki te 1L o te wai kaoona hei memeha.

Rongoā 3: 1M HCl otinga

Whakarewa 8.3ml waikawa pūmāota pūmāota ki te wai deionized ki te 100ml.

Otinga 4:1M NaOH otinga

Whakarewahia te 4g NaOH me te 100ml wai whakaheke.

Otinga 5: otinga tangohanga:

Waimeha 2×tohanga otinga tangohanga ki te wai deionized i roto i te ōwehenga rōrahi o 1:1.Ka taea te pupuri i tenei otinga mo te 1 marama i te 4 ℃, ka whakamahia hei tango tauira.

Rongoā 6: otinga horoi:

Waimeha i te otinga horoi 20×kuiti ki te wai deionized i roto i te ration rōrahi o 1:19, e ka whakamahia ki te horoi i nga papa.Ka taea te pupuri i tenei wairewa waimeha mo te 1 marama i te 4 ℃.

1. 8.Tauira Whakaritenga

8.1Panui me nga whakatupato i mua i te mahi:

a) Tena koa whakamahia nga tohutohu kotahi-atu i roto i te whakamatautau, me te whakarereke i nga tohutohu ka ngohia nga reagent rereke.

b) Me mohio kei te ma katoa nga taputapu whakamatautau.

c) ka taea te pupuri i te reagent pärönaki ki te 2-8 ℃ mo te toru marama;

d) Ka taea te pupuri i te otinga HCl i te pāmahana rūma mo te 3 marama;

e) Ka taea te pupuri i te otinga NaOH mo te 3 marama i te pāmahana rūma;

f) Puritia nga tauira kaore i rongoatia ki te whakatio (-20 ℃);

g) Ka taea te tiaki i nga tauira kua rongoa mo te 24h i te 2-8 ℃ i te pouri.

8.2 Tauira kiko kararehe me te ate:

----Whakaritea nga tauira ki te homogenizer;

---- Taumaha 1.0±0.05g o te tauira kiko homogenized ki 50ml polystyrene centrifuge ngongo.Tāpirihia he 4ml wai whakaheke, 0.5ml 1M HCl otinga me te 100ul reagent pärönaki (tirohia te otinga 1).Ruperupea mo te 2min.

---- Incubate i te 37 ℃ mo te po ( mo te 16 haora);

---- Tāpirihia te 5ml 0.1MK₂HPO₄ (otinga2), 0.4ml 1M NaOH (otinga4) me te 5ml ethyl acetate.wiriwiri kaha mo te 30s;

---- Centrifuge i te pāmahana rūma (20-25 ℃) mo te 10min, i te iti rawa 3000g;

---- Tangohia te 2.5ml o te wahanga waro nui ki roto i te ngongo karaihe 10ml, whakamaroke ki te hau hauota 50-60 ℃, whakaetonga hurihuri ranei;

---- Whakarewahia te toenga maroke ki te 1ml n-hexane (n-heptane ranei), vortex mo te 30s, taapirihia te 1ml wairewa tangohanga (otinga5), vortex 1min, uru rawa.

---- Centrifuge i te pāmahana rūma (20-25^oC) mo te 5min, i te iti rawa 3000g;

---- Tangohia te wahanga waro tino nui;tango 50μl o te wahanga wai tïpako hei whakamatautau.

8.4 Honi

----pauna 1.0±0.05g o te tauira honi kua rite ki roto i te ngongo polystyrene centrifuge 50ml;

----Taapirihia te 4ml wai whakaheke, 0.5ml 1M HCl (otinga3) me te 100μl reagent pärönaki (otinga1);ruru rawa mo te 2min;

---- Whakawhanaua ki te 37 ℃ mo te po ( mo te 16 haora);

---- Tāpirihia te 5ml 0.1MK₂HPO₄ (otinga2), 0.4ml 1M NaOH (otinga4) me te 5ml ethyl acetate, ruru kaha mo te 30s;

----Centrifuge i te pāmahana rūma (20-25 ℃) mo te 10min, i te iti rawa 3000g;

----Tangohia te 2.5ml o te wahanga waro nui ki roto i te ngongo karaihe 10ml, whakamaroke ki te hau hauota 50-60 ℃, whakaetonga hurihuri ranei;

----Warekahia te toenga maroke ki te 1ml n-hexane (n-heptane ranei), vortex mo te 30s, tāpirihia te 1ml otinga tangohanga (otinga5), vortex 1min, uru rawa.

----Centrifuge i te pāmahana rūma (20-25^oC) mo te 10min, i te iti rawa 3000g;

----Tangohia te wahanga waro tino nui;tango 50μl o te wahanga wai tïpako hei whakamatautau.

1. 9.Te tukanga whakamatautau

9.1Panui i mua i te whakamatautau

9.1.1 Me mohio kei te noho katoa nga reagents me nga microwell i te pāmahana rūma (20-25 ℃).

9.1.2 Whakahokia nga toenga reagents katoa ki te 2-8 ℃ i muri tonu i te whakamahinga.

9.1.3 Ko te horoi tika i nga microwells tetahi mahi nui i roto i te mahi whakamatautau;Koia te mea nui ki te whakahoki ano i te tātaritanga ELISA.

9.1.4 Me karo i te marama, ka uhia nga microwells i te wa e whakangote ana.

9.2 Nga Mahi Whakatau

9.2.1 Tangohia nga reagents katoa ki waho i te pāmahana rūma (20-25 ℃) mo te neke atu i te 30 meneti, whakakotahi i mua i te whakamahi.

9.2.2 Kawea mai nga microwells e hiahiatia ana ka whakahoki i te toenga ki roto i te putea raka-kotu i te 2-8 ℃ tonu.

9.2.3 Me whakamahana ano te wairewa horoi kukū me te wairewa tangohanga kia noho ki te pāmahana rūma i mua i te whakamahi.

9.2.4Tau:Whakatauhia nga waahi moroiti katoa me nga paerewa me nga tauira katoa me whakahaere kia takirua.Tuhia nga paerewa me nga tuunga tauira.

9.2.5Te waimehatanga o te otinga antibody: waimeha i te wairewa whākōkī kukū ki ngā waimeha whākōkī conjugate i roto i te ōwehenga rōrahi o te 1:10(1 whakakopa wairewa whākōkī kukū: 10 whakakopa whākōkī conjugate diluents).

9.2.6Tāpirihia he otinga paerewa / tauira me te wairewa conjugate whākōkī: tāpirihia te 50µl o te wairewa paerewa, tauira rite ranei ki nga puna e rite ana, taapirihia te 50µl wairewa conjugate enzyme.Whakaranu marietia ma te wiri a ringa i te pereti ka whakamakuku mo te 30 meneti i te 25℃ me te uhi.

9.2.7Horoi: Tango ata te uhi ka ringihia te wai i roto i nga puna ka horoi i nga microwells ki te 250µl wairewa horoi horoi (otinga6) i te wa o te 10s mo nga wa 4-5.Horoihia te toenga wai me te pepa mimiti (ka taea te whakakore i te toenga o te mirumiru hau me te pito kaore i whakamahia).

9.2.8Tae: Taapirihia te wairewa tïpako A 50µl me te wairewa tïpako B 50ul ki ia puna.Whakaranu marietia ma te toka-a-ringa i te pereti ka whakamakuku mo te 15 meneti i te 25 ℃ me te uhi (tirohia te 12.8).

9.2.11Ine: Taapirihia te 50µl te otinga mutu ki ia puna.Whakaranu marietia ma te toka-a-ringa i te pereti ka ine i te urunga ki te 450nm (I whakaarohia me ine me te roangaru-rua o 450/630nm. Panuitia te hua i roto i te 5miniti i muri i te taapiri o te otinga mutu.)

10 Hua

10.1Te örau o te horonga

Ko nga uara toharite o nga uara urunga kua whiwhi mo nga paerewa me nga tauira ka wehewehea e te uara whakauru o te paerewa tuatahi (kore paerewa) ka whakareatia ki te 100%.Ko te paerewa kore ka hangaia kia rite ki te 100% ka whakahuahia nga uara urunga i roto i nga ōrau.

=

B ——paerewa horonga (tauira ranei)

B0 ——te horomanga kore paerewa

10.2Anau Paerewa

----Ki te tuhi i te anau paerewa: Tangohia te uara mimiti o nga paerewa hei tuaka-y, hauruarua o te kukū o te otinga paerewa AOZ (ppb) hei tuaka-x.

----Ko te kukū AOZ o ia tauira (ppb), ka taea te panui mai i te ananga whakatikatika, ka whakareatia ki te tauwehe waimeha e rite ana o ia tauira ka whai, ka whiwhi te kukū o te tauira.

Kia mahara:

Kua whakawhanakehia he rorohiko motuhake mo te whakahekenga raraunga katoa, ka taea te whakarato i runga i te tono.

Tauwehe waimeha………………………………………………………2

10.Te tairongo, te tika me te tika

Te tairongo: 0.025ppb

Tepe rapunga:

Kopa (uaua, ate)………………………………0.1ppb

Honi------------------------------------------------ -0.1ppb

Tika:

Te kiko kararehe (te uaua me te ate)……………………100±20%

Honi…………………………………………………… 100±20%

Tika:Ko te CV o te kete ELISA he iti iho i te 10%.

11.Panui

12.1 Ko nga uara toharite o nga uara urunga ka riro mai mo nga paerewa me nga tauira ka whakahekehia mena karekau nga reagents me nga tauira i whakaritea ki te pāmahana rūma (20-25 ℃).

12.2 Kaua e tukua nga poka moroiti kia maroke i waenga i nga hikoinga kia kore ai e taea te whakaputa me te mahi i te mahi e whai ake nei i muri tonu i te paato i te kaipupuri microwells.

12.3 ruru atahia ia reagent i mua i te whakamahi.

12.4 Tiakina to kiri mai i te otinga mutu mo te mea ko te 0.5MH₂SO₄otinga.

12.5 Kaua e whakamahia nga kete kua tawhitotia.Kaua e whakawhitia nga reagents o nga roopu rereke, ki te kore ka heke te aro.

12.6 Te ahua rokiroki: Kia mau ki nga kete ELISA ki te 2-8 ℃, kaua e whakatio.Hirihia nga pereti microwell okiokinga, karohia te ra tika i nga wa katoa o te heki.E taunaki ana kia uhia nga pereti microtiter.

12.7 Me whakarērea te otinga o te papapa ki te huri te tae.Ka kino pea nga reagents ki te iti iho te uara whakauru (450/630nm) o te paerewa kore i te 0.5 (A450nm<0.5).

12.8 Ko te tauhohenga tae me 15min i muri i te taapiri o te otinga tïpako;Ka taea e koe te whakaroa i te wa incubation ki te 20min neke atu ranei mena he maamaa te tae ki te whakatau., kaua rawa e neke ake i te 25min. Engari, whakapotohia te wa incubation tika.

12.9 Ko te pāmahana tauhohenga tino pai ko te 25 ℃.Ko te teitei ake, te iti iho ranei o te pāmahana ka arahi ki nga huringa o te tairongo me nga uara whakauru.

12.Te waahi rokiroki me te waa rokiroki

Te ahua rokiroki: 2-8 ℃.

Te wa rokiroki: 12 marama.