производ

1. 1.Позадина

Нитрофураните се синтетички антибиотици со широк спектар, кои често се користат во животинското производство поради одличните антибактериски и фармакокинетски својства.Тие исто така биле користени како поттикнувачи на раст во производството на свињи, живина и водни производи.Во долгорочните студии со лабораториски животни покажаа дека матичните лекови и нивните метаболити покажуваат канцерогени и мутагени карактеристики.Ова доведе до забрана на нитрофурани за третман на животни кои се користат за производство на храна.Нитрофуранските лекови фуралтадон, нитрофурантоин и нитрофуразон беа забранети за употреба во производството на храна за животни во ЕУ во 1993 година, а употребата на фуразолидон беше забранета во 1995 година.

Анализата на остатоците од лековите од нитрофуран треба да се заснова на откривање на метаболитите врзани за ткиво на основните лекови од нитрофуран.Бидејќи матичните лекови многу брзо се метаболизираат, а метаболитите на нитрофуранот врзани за ткиво ќе се задржат долго време, овие метаболити се користат како цел за откривање на злоупотреба на нитрофурани, кои вклучуваат фуразолидон метаболит (AOZ), метаболит Фуралтадон (AMOZ ), метаболит на нитрофурантоин (AHD) и метаболит на нитрофурантоин (SEM).

Остатоците од AOZ се определуваат најчесто со LC-MS или LC-MS/MS.Ензимските имуноанализи, во споредба со хроматографските методи, покажуваат значителни предности во однос на чувствителноста, ограничувањето на детекцијата, техничката опрема и потребното време.(Време трошоци: 45 мин.)

1. 2.Принцип на тест

Овој комплет ELISA е дизајниран да открива AOZ врз основа на принципот на индиректно-конкурентна ензимска имуноанализа.Микротитарните бунари се обложени со антиген поврзан со BSA.AOZ во примерокот се натпреварува со антигенот обложен на плочата за микротитар за додаденото антитело.По додавањето на ензимски конјугат, се користи хромоген супстрат и сигналот се мери со спектрофотометар.Апсорпцијата е обратно пропорционална со концентрацијата на AOZ во примерокот.

1. 3.Апликации

Овој комплет може да се користи во квантитативна и квалитативна анализа на остатоците од AOZ воанимални ткива(мускули, црн дроб итн), мед.

1. 4.Вкрстени реакции

Фуразолидон метаболит (АОЗ)………………………..100%

Фуралтадон метаболит (АМОЗ)……………………<0,1%

Нитрофурантоин метаболит (АХД)……………………<0,1%

Нитрофуразон метаболит (SEM)………………………<0,1%

Фуразолидон………………………………………..… 16,3%

Фуралтадон……………………………………………<1%

Нитрофурантоин……………………………………………<1%

Нитрофуразон………………………………………………<1%

1. 5.Потребни материјали

5.1Опрема

----Спектрофотометар на микротитерна плоча (450nm/630nm)

----Ротациски испарувач или инструменти за сушење со азот

----Хомогенизатор /стомач

----Шикер

----Вортекс миксер

----Центрифуга

----Аналитичка рамнотежа (индуктивност: 0,01 g)

----Дипломирана пипета: 10мл

----Сијалица од гумена пипета

----Волуметриска колба: 100мл

----Стаклена колба: 10мл

----Центрифуга од полистиренска цевка: 2ml, 50ml

----Микропипети: 20ул-200ул, 100ул-1000ул,

250 ul-мултипипета

5.2Реагенси

----Етил ацетат (AR)

----n-хексан (или n-хептан) (AR)

----Дикалиум хидроген фосфат трихидрат

(K₂HPO₄.3H₂О) (AR)

----Концентрирана хлороводородна киселина (HCl, AR)

-----Метанол

----Натриум хидроксид (NaOH, AR)

----Дејонизирана вода

1. 6.Компоненти на комплетот

l Микротитер плоча обложена со антиген, 96 бунари

l Стандардни раствори (6 шишиња, 1 ml/шише)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Стандардна контрола на шилење: (1ml/шише)........100ppb

l Концентриран ензимски конјугат 1ml.........црвено капаче

l Ензимски конјугат разредувачи 10ml………..зелена капа

l Супстрат A 7ml……………………………..бела капа

l Супстрат B 7ml……………………………..црвено капаче

l Стоп раствор 7ml………………………………жолта капа

l 20×концентриран раствор за миење 40ml

……………………………………………проѕирна капа

l 2×концентриран раствор за екстракција 60ml….сино капаче

l 2-Нитробензалдехид 15,1 mg…………………бела капа

1. 7.Подготовка на реагенси

Решение 1: дериват реагенс:

Додадете 10 ml метанол во шишето со 2-нитробензалдехид и растворете.(во концентрација од 10 mM).

Решение 2: 0,1 МК₂HPO₄решение:

Тежина 22,8 g К₂HPO₄.3H₂O до 1L дејонизирана вода да се раствори.

Решение 3: 1M раствор на HCl

Растворете 8,3 ml концентрирана хлороводородна киселина со дејонизирана вода до 100мл.

Решение 4:1M раствор на NaOH

Растворете 4 g NaOH со 100 ml дејонизирана вода.

Решение 5: раствор за екстракција:

Разредете 2×концентриран раствор за екстракција со дејонизирана вода во волуменски сооднос 1:1.Овој раствор може да се конзервира 1 месец на 4℃, што ќе се користи за извлечени примероци.

Решение 6: раствор за миење:

Разредете го 20×концентрираниот раствор за миење со дејонизирана вода во волумен од 1:19, што ќе се користи за миење на плочите.Овој разреден раствор може да се чува 1 месец на 4℃.

1. 8.Примероци за подготовки

8.1Забелешка и мерки на претпазливост пред операцијата:

а) Ве молиме користете еднократни совети во експериментот и променете ги советите кога апсорбирате различен реагенс.

б) Проверете дали сите експериментални инструменти се чисти.

в) дериватниот реагенс може да се чува на 2-8℃ три месеци;

г) Растворот на HCl може да се чува на собна температура 3 месеци;

д) Растворот на NaOH може да се конзервира 3 месеци на собна температура;

ѓ) Нетретираните примероци чувајте ги во замрзнување (-20℃);

е) Третираните примероци може да се конзервираат 24 часа на 2-8℃ во темнина.

8.2 Примероци од животинско ткиво и црн дроб:

----Хомогенизирајте ги примероците со хомогенизатор;

---- Тежина 1,0±0,05 g од хомогенизираниот примерок од ткиво во епрувета за центрифуга од полистирен од 50 ml.Додадете 4 ml дејонизирана вода, 0,5 ml 1M раствор на HCl и 100 ml дериват реагенс (види раствор 1).Протресете го 2 мин.

---- Инкубирајте на 37 ℃ преку ноќ (околу 16 часа);

---- Додадете 5ml 0,1MK₂HPO₄ (решение2), 0,4 ml 1M NaOH (решение4) и 5 ​​ml етил ацетат.Силно протресете 30-ти;

---- Центрифугирајте на собна температура (20-25℃) 10 мин, најмалку 3000 g;

---- Земете 2,5 ml од органската фаза на супернатантот во чиста стаклена цевка од 10 ml, исушете со азотен гас од 50-60 ° C или ротационен испарувач;

---- Растворете го сувиот остаток со 1ml n-хексан (или n-хептан), вртлог за 30 секунди, додадете 1ml раствор за екстракција (решение5), вртлог 1мин, се меша целосно.

---- Центрифугирајте на собна температура (20-25^oВ) за 5 мин, најмалку 3000 g;

---- Отстранете ја органската фаза на супернатантот;земете 50 μl од фазата на водата на подлогата за анализа.

8.4 Мед

---- измерете 1,0±0,05 g од хомогенизираниот примерок од мед во епрувета за центрифуга од полистирен од 50 ml;

----Додадете 4 ml дејонизирана вода, 0,5 ml 1M HCl (решение3) и 100μl дериват реагенс (решение1);целосно протресете 2 минути;

----Инкубирајте на 37℃ преку ноќ (околу 16 часа);

----Додадете 5ml 0,1MK₂HPO₄ (решение2), 0,4 ml 1M NaOH (решение4) и 5 ​​ml етил ацетат, жестоко протресете 30 секунди;

----Центрифугирајте на собна температура (20-25℃) 10 мин, најмалку 3000 g;

---- Земете 2,5 ml од органската фаза на супернатантот во чиста стаклена цевка од 10 ml, исушете со азотен гас од 50-60 ° C или ротационен испарувач;

---- Растворете го сувиот остаток со 1ml n-хексан (или n-хептан), вртлог за 30 секунди, додадете 1ml раствор за екстракција (решение5), вртлог 1мин, се меша целосно.

----Центрифугирајте на собна температура (20-25^oВ) за 10 мин, најмалку 3000 g;

----Отстранете ја органската фаза на супернатантот;земете 50 μl од фазата на водата на подлогата за анализа.

1. 9.Процесот на анализа

9.1Забележете пред анализата

9.1.1 Проверете дали сите реагенси и микробунари се на собна температура (20-25℃).

9.1.2 Вратете ги сите останати реагенси на 2-8℃ веднаш по употреба.

9.1.3 Правилното миење на микробунарите е важен чекор во процесот на анализа;тоа е витален фактор за репродуктивноста на ELISA анализата.

9.1.4 Избегнувајте ја светлината и покријте ги микробунарите за време на инкубацијата.

9.2 Чекори на анализа

9.2.1 Извадете ги сите реагенси на собна температура (20-25℃) повеќе од 30 минути, хомогенизирајте ги пред употреба.

9.2.2 Извадете ги потребните микробунари и вратете го остатокот во кесата со патент на температура од 2-8℃ веднаш.

9.2.3 Концентрираниот раствор за миење и концентрираниот раствор за екстракција треба повторно да се загреат за да бидат на собна температура пред употреба.

9.2.4Број:Нумерирани позиции на секој микробунар и сите стандарди и примероци треба да се користат во дупликат.Запишете ги стандардите и позициите на примероците.

9.2.5Разредување на концентриран раствор на антитела: разредете го концентрираниот ензимски раствор со ензимски конјугирани разредувачи во волуменски сооднос од 1:10 (1 пати концентриран ензимски раствор: 10 пати ензимски конјугирани разредувачи).

9.2.6Додадете стандарден раствор / примерок и ензимски конјугат: додадете 50µl стандарден раствор или подготвен примерок во соодветните бунари, додадете 50µl ензимски конјугатен раствор.Нежно измешајте со рачно протресување на плочата и инкубирајте 30 минути на 25℃ со капак.

9.2.7Измијте: Нежно извадете го капакот и истурете ја течноста од бунарите и исплакнете ги микробунарите со 250µl разреден раствор за миење (решение6) во интервал од 10 секунди за 4-5 пати.Преостанатата вода впивајте ја со впивачка хартија (останатиот воздушен меур може да се отстрани со неискористен врв).

9.2.8Боење: Додадете 50µl раствор на супстрат А и 50 ul раствор на супстрат Б во секоја бунар.Нежно измешајте со рачно лулање на плочата и инкубирајте 15 минути на 25℃ со капак (види 12.8).

9.2.11Мерка: Додадете 50 µl стоп раствор во секоја буна.Нежно измешајте со рачно нишање на плочата и измерете ја апсорпцијата на 450 nm (Се предложи мерење со двојна бранова должина од 450/630 nm. Прочитајте го резултатот во рок од 5 минути по додавањето на стоп раствор. )

10 Резултати

10.1Процентуална апсорпција

Средните вредности на вредностите на апсорпција добиени за стандардите и примероците се поделени со вредноста на апсорпција на првиот стандард (нулта стандард) и се множат со 100%.Така, нултиот стандард е еднаков на 100%, а вредностите на апсорпција се цитирани во проценти.

=

Б —-стандард за апсорпција (или примерок)

B0 ——стандард за апсорпција нула

10.2Стандардна крива

----За цртање стандардна крива: Земете ја вредноста на апсорпција на стандардите како y-оска, полулогаритамска на концентрацијата на стандардниот раствор на AOZ (ppb) како x-оска.

----Концентрацијата на AOZ на секој примерок (ppb), која може да се прочита од кривата на калибрација, се множи со соодветниот фактор на разредување на секоја следена мостра и се добива вистинската концентрација на мострата.

Ве молиме забележете:

Развиен е специјален софтвер за намалување на сите податоци, кој може да се обезбеди на барање.

Фактор на разредување…………………………………………………2

10.Чувствителност, точност и прецизност

Чувствителност: 0,025ppb

Ограничување за откривање:

Ткиво (мускули, црн дроб)……………………………0,1 ppb

Мед------------------------------------------------- -0,1ppb

Точност:

Животинско ткиво (мускули и црн дроб)…………………100±20%

Душо…………………………………………….. 100±20%

Прецизност:CV на комплетот ELISA е помала од 10%.

11.Забележете

12.1 Средните вредности на вредностите на апсорпција добиени за стандардите и примероците ќе се намалат доколку реагенсите и примероците не се регулирани на собна температура (20-25℃).

12.2.

12.3 Нежно протресете го секој реагенс пред употреба.

12.4 Држете ја вашата кожа подалеку од растворот за стопирање бидејќи е 0,5 MH₂SO₄решение.

12.5 Не користете ги застарените комплети.Не менувајте ги реагенсите од различни серии, во спротивно ќе ја намалите чувствителноста.

12.6 Состојба на складирање: Чувајте ги ELISA комплетите на температура од 2-8℃, не замрзнувајте.Запечатете ги микробунарските плочи за одмор, избегнувајте директна сончева светлина за време на сите инкубации.Се препорачува покривање на микротитарните плочи.

12.7 Растворот на подлогата треба да се напушти ако се обои.Реагенсите може да се влошат ако вредноста на апсорпција (450/630 nm) на нулта стандард е помала од 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 За реакцијата на боење потребни се 15 минути по додавањето на растворот на подлогата;Можете да го продолжите времето на инкубација на 20 мин или повеќе ако бојата е премногу светла за да се одреди, никогаш не надминувајте 25 минути. Напротив, правилно скратете го времето на инкубација.

12,9 Оптималната температура на реакцијата е 25℃.Повисоката или пониската температура ќе доведе до промена на чувствителноста и вредностите на апсорпција.

12.Состојба на складирање и период на складирање

Состојба на чување: 2-8℃.

Период на чување: 12 месеци.