бүтээгдэхүүн

Furazolidone метаболит (AOZ) -ийн тоон шинжилгээнд зориулсан өрсөлдөх чадвартай ферментийн дархлаа шинжилгээний иж бүрдэл

Товч тодорхойлолт:

Энэхүү ELISA иж бүрдэл нь шууд бус өрсөлдөх чадвартай ферментийн дархлааны шинжилгээний зарчим дээр үндэслэн AOZ-ийг илрүүлэх зорилготой юм.Микротитрийн цооногууд нь BSA-тэй холбогдсон антигенээр бүрхэгдсэн байдаг.Дээж дэх AOZ нь нэмсэн эсрэгбиеийн хувьд микротитр хавтан дээр бүрсэн эсрэгтөрөгчтэй өрсөлддөг.Ферментийн коньюгат нэмсний дараа хромоген субстратыг хэрэглэж, дохиог спектрофотометрээр хэмждэг.Шингээлт нь дээж дэх AOZ концентрацитай урвуу пропорциональ байна.


Бүтээгдэхүүний дэлгэрэнгүй

Бүтээгдэхүүний шошго

Өрсөлдөх чадвартай ферментийн дархлаа судлалын иж бүрдэл

-ийн тоон шинжилгээФуразолидон метаболит(AOZ)

 

  1. 1.Суурь

Нитрофуранууд нь нянгийн эсрэг болон фармакокинетик шинж чанараараа малын үйлдвэрлэлд өргөн хэрэглэгддэг синтетик өргөн хүрээний антибиотик юм.Тэд мөн гахай, шувууны аж ахуй, усны үйлдвэрлэлд өсөлтийг дэмжигч болгон ашиглаж байсан.Лабораторийн амьтадтай хийсэн урт хугацааны судалгаагаар үндсэн эмүүд болон тэдгээрийн метаболитууд нь хорт хавдар үүсгэдэг, мутаген шинж чанартай болохыг харуулж байна.Энэ нь хүнсний үйлдвэрлэлд ашигладаг амьтдыг эмчлэхэд зориулсан нитрофураныг хориглоход хүргэсэн.Нитрофуран эм фуралтадон, нитрофурантоин, нитрофуразоныг ЕХ-нд 1993 онд малын гаралтай хүнсний үйлдвэрлэлд хэрэглэхийг хориглож, 1995 онд фуразолидоныг хэрэглэхийг хориглосон.

Нитрофураны эмийн үлдэгдэлд дүн шинжилгээ хийхдээ нитрофураны үндсэн эмийн эдэд холбогдсон метаболитуудыг илрүүлэхэд үндэслэх шаардлагатай.Үндсэн эмүүд нь маш хурдан метаболизмд ордог бөгөөд эдэд холбогдсон нитрофураны метаболитууд удаан хугацаанд хадгалагддаг тул эдгээр метаболитууд нь Фуразолидон метаболит (AOZ), Фуралтадон метаболит (AMOZ) зэрэг нитрофураны зүй бус хэрэглээг илрүүлэх зорилгоор ашигладаг. ), Нитрофурантоины метаболит (AHD) ба Нитрофуразоны метаболит (SEM).

AOZ-үлдэгдэл нь ихэвчлэн LC-MS эсвэл LC-MS/MS-ээр тодорхойлогддог.Ферментийн дархлааны шинжилгээ нь хроматографийн аргуудтай харьцуулахад мэдрэмж, илрүүлэх хязгаар, техникийн тоног төхөөрөмж, цаг хугацааны шаардлагын талаар ихээхэн давуу талтай байдаг.(Цагийн зардал: 45 мин)

  1. 2.Туршилтын зарчим

Энэхүү ELISA иж бүрдэл нь шууд бус өрсөлдөх чадвартай ферментийн дархлааны шинжилгээний зарчим дээр үндэслэн AOZ-ийг илрүүлэх зорилготой юм.Микротитрийн цооногууд нь BSA-тэй холбогдсон антигенээр бүрхэгдсэн байдаг.Дээж дэх AOZ нь нэмсэн эсрэгбиеийн хувьд микротитр хавтан дээр бүрсэн эсрэгтөрөгчтэй өрсөлддөг.Ферментийн коньюгат нэмсний дараа хромоген субстратыг хэрэглэж, дохиог спектрофотометрээр хэмждэг.Шингээлт нь дээж дэх AOZ концентрацитай урвуу пропорциональ байна.

  1. 3.Хэрэглээ

Энэхүү иж бүрдэл нь AOZ-ийн үлдэгдлийг тоон болон чанарын шинжилгээнд ашиглаж болноанима эдүүд(булчин, элэг гэх мэт), зөгийн бал.

  1. 4.Хөндлөнгийн урвал

Фуразолидон метаболит (AOZ)……………………..100%

Фуралтадоны метаболит (AMOZ) ……………………<0.1%

Нитрофурантоины метаболит (AHD) ……………………<0.1%

Нитрофуразоны метаболит (SEM)………………………<0.1%

Фуразолидон…………………………………….…..…16.3%

Фуралтадон………………………………………….…<1%

Нитрофурантоин…………………………………….…….…<1%

Нитрофуразон…………………………………………..…<1%

  1. 5.Шаардлагатай материал

5.1Тоног төхөөрөмж

---- Микротитр хавтангийн спектрофотометр (450нм/630нм)

----Эргэдэг ууршуулагч буюу азотоор хатаах багаж

----Гомогенжүүлэгч /ходоод

---- Шейкер

---- Vortex холигч

---- Центрифуг

----Аналитик тэнцвэр (индукц: 0.01г)

----Төгссөн пипетк: 10мл

---- Резинэн пипеткийн чийдэн

----Эзэлхүүний колбо: 100мл

----Шилэн колбо: 10мл

----Полистирол центрифугийн хоолой: 2мл, 50мл

----Микропипетк: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Урвалжууд

----Этил ацетат (AR)

----н-гексан (эсвэл н-гептан) (AR)

----Дикалийн устөрөгчийн фосфатын трихидрат

(K2HPO4.3H2O) (AR)

---- Төвлөрсөн давсны хүчил (HCl, AR)

-----Метанол

---- Натрийн гидроксид (NaOH, AR)

----Ионгүйжүүлсэн ус

  1. 6.Иж бүрдэл хэсгүүд

л Антигенээр бүрсэн микротитр хавтан, 96 худаг

л Стандарт уусмал (6 шил, 1 мл/шил)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Баяжуулалтын стандарт хяналт: (1мл/шил)........100ppb

l Баяжуулсан ферментийн коньюгат 1мл........улаан малгай

л Ферментийн коньюгат шингэрүүлэгч 10мл………..ногоон таг

l Субстрат А 7мл…………………………..цагаан таг

l Субстрат В 7мл……………………………..улаан малгай

l Зогсоолын уусмал 7мл……………………………шар малгай

л 20×өтгөрүүлсэн угаалгын уусмал 40мл

…………………………………………………………………………………………………………………………

л 2×өтгөрүүлсэн экстракцийн уусмал 60мл….цэнхэр таг

л 2-нитробензальдегид 15.1мг………………цагаан малгай

  1. 7.Урвалж бэлтгэх

Шийдэл 1: дериватив урвалж:

2-нитробензальдегид агуулсан лонхонд 10 мл метанол нэмээд уусгана.(10мМ концентрацид).

Шийдэл 2: 0.1MK2HPO4шийдэл:

22.8 гр жинтэй2HPO4.3H2Уусахын тулд ионгүйжүүлсэн усыг 1 л хүртэл хийнэ.

Шийдэл 3: 1М HCl уусмал

8.3мл концентрацитай давсны хүчил уусгана ионгүйжүүлсэн усаар 100 мл хүртэл.

Шийдэл 4:1М NaOH уусмал

4 г NaOH-ийг 100 мл ионгүйжүүлсэн усаар уусгана.

Шийдэл 5: олборлох шийдэл:

2× концентрацитай экстракцийн уусмалыг ионгүйжүүлсэн усаар 1:1 харьцаагаар шингэлнэ.Энэ уусмалыг 4 хэмийн температурт 1 сар хадгалах боломжтой бөгөөд үүнийг дээжийг гаргаж авахад хэрэглэнэ.

Шийдэл 6: угаах уусмал:

20× концентрацитай угаалгын уусмалыг ионгүйжүүлсэн усаар 1:19 харьцаатай усаар шингэлнэ.Энэхүү шингэрүүлсэн уусмалыг 4 хэмд 1 сарын турш хадгалах боломжтой.

  1. 8.Бэлтгэл дээж

8.1Ажиллуулахын өмнө анхааруулга, урьдчилан сэргийлэх арга хэмжээ:

a) Туршилтанд нэг удаагийн зөвлөмжийг ашиглаж, өөр өөр урвалж шингээх үед зөвлөмжийг өөрчилнө үү.

б) Туршилтын бүх багаж хэрэгсэл цэвэр байгаа эсэхийг шалгаарай.

в) дериватив урвалжийг гурван сарын турш 2-8 хэмд хадгалах боломжтой;

d) HCl уусмалыг тасалгааны температурт 3 сарын турш хадгалах боломжтой;

e) NaOH уусмалыг тасалгааны температурт 3 сарын турш хадгалах боломжтой;

f) Боловсруулаагүй дээжийг хөлдөөгчид (-20 ℃) ​​хадгална;

g) Боловсруулсан дээжийг 2-8 хэмийн температурт 24 цагийн турш харанхуйд хадгалж болно.

8.2 Амьтны эд ба элэгний дээж:

---- Дээжийг нэгэн төрлийн болгогчоор нэгэн төрлийн болгох;

---- 1.0±0.05 г нэгэн төрлийн эдийн дээжийг 50 мл полистирол центрифугийн хоолойд хийнэ.4 мл ионгүйжүүлсэн ус, 0.5 мл 1М HCl уусмал, 100ул дериватив урвалж нэмнэ (1-р уусмалыг үзнэ үү).2 минутын турш сэгсэрнэ.

---- 37 хэмд шөнийн турш өсгөвөрлөнө (ойролцоогоор 16 цаг);

---- 5мл 0.1МК нэмнэ2HPO4 (шийдэл2), 0.4мл 1М NaOH (шийдэл4) ба 5 мл этил ацетат.30 секундын турш хүчтэй сэгсэрнэ;

---- Өрөөний температурт (20-25 ℃) 10 минутын турш центрифуг, дор хаяж 3000 гр;

---- 2.5 мл органик фазыг 10 мл цэвэр шилэн хоолойд хийж, 50-60 ℃ азотын хий эсвэл эргэлтэт ууршуулагчаар хатаана;

---- Хуурай үлдэгдлийг 1 мл н-гексан (эсвэл н- гептан) -аар уусгаж, 30 секунд эргүүлж, 1 мл экстракцийн уусмал нэмнэ (шийдэл5), 1мин эргүүлээд бүрэн холино.

---- Өрөөний температурт центрифуг (20-25oC) 5 минутын турш дор хаяж 3000 гр;

---- Дээд давхаргын органик фазыг зайлуулах;Шинжилгээнд зориулж субстратын усны фазаас 50 мкл авна.

 

8.4 Зөгийн бал

----1.0±0.05г нэгэн төрлийн зөгийн балны дээжийг жинлэн авч 50 мл-ийн полистирол центрифугийн хоолойд хийнэ;

----4мл ионгүйжүүлсэн ус, 0.5мл 1М HCl (шийдэл3) ба 100 мкл дериватив урвалж (шийдэл1);2 минутын турш бүрэн сэгсэрнэ;

---- 37 хэмд шөнийн турш өсгөвөрлөнө (ойролцоогоор 16 цаг);

---- 5мл 0.1МК нэмнэ2HPO4 (шийдэл2), 0.4мл 1М NaOH (шийдэл4) ба 5 мл этил ацетат, 30 секундын турш хүчтэй сэгсэрнэ;

---- Центрифуг тасалгааны температурт (20-25 ℃) 10 минут, дор хаяж 3000 гр;

---- 2.5 мл-ийн органик фазыг 10 мл цэвэр шилэн хоолойд хийж, 50-60 ℃ азотын хий эсвэл эргэлтэт ууршуулагчаар хатаана;

---- Хуурай үлдэгдлийг 1 мл н-гексан (эсвэл н- гептан) -аар уусгаж, 30 секунд эргүүлж, 1 мл экстракцийн уусмал нэмнэ (шийдэл5), 1мин эргүүлээд бүрэн холино.

---- Өрөөний температурт центрифуг (20-25oC) 10 минутын турш дор хаяж 3000 гр;

----Устгасан органик фазыг зайлуулах;Шинжилгээнд зориулж субстратын усны фазаас 50 мкл авна.

  1. 9.Шинжилгээний үйл явц

9.1Шинжилгээ хийхээс өмнө анхаарна уу

9.1.1 Бүх урвалж болон бичил цооногууд бүгд өрөөний температурт (20-25℃) байгаа эсэхийг шалгаарай.

9.1.2 Үлдсэн бүх урвалжийг хэрэглэсний дараа шууд 2-8 ℃ хүртэл буцаана.

9.1.3 Бичил цооногийг зөв угаах нь шинжилгээний ажлын чухал үе шат юм;Энэ нь ELISA шинжилгээний дахин давтагдахад чухал хүчин зүйл юм.

9.1.4 Инкубацийн үед гэрлээс зайлсхийж, бичил цооногийг таглана.

9.2 Шинжилгээний алхамууд

9.2.1 Бүх урвалжийг тасалгааны температурт (20-25 ℃) 30 минутаас дээш хугацаагаар гаргаж, хэрэглэхийн өмнө нэгэн төрлийн болгоно.

9.2.2 Шаардлагатай бичил цооногийг гаргаж, үлдсэнийг нь 2-8 хэмийн температурт нэн даруй цахилгаан цоожтой уутанд хийнэ.

9.2.3 Баяжуулсан угаалгын уусмал ба өтгөрүүлсэн экстракцийн уусмалыг хэрэглэхийн өмнө тасалгааны температурт дахин халаана.

9.2.4Тоо:Бичил цооногийн байрлал бүрийг дугаарлаж, бүх стандарт, дээжийг давхардсан байх ёстой.Стандарт болон дээжийн байрлалыг тэмдэглэ.

9.2.5Төвлөрсөн эсрэгбиеийн уусмалыг шингэлэх: концентрацитай ферментийн уусмалыг 1:10 эзэлхүүний харьцаагаар ферментийн коньюгат шингэрүүлэгчээр шингэлнэ (1 дахин баяжуулсан ферментийн уусмал: 10 нугалж ферментийн коньюгат шингэрүүлэгч).

9.2.6Стандарт уусмал / дээж ба ферментийн коньюгат уусмал нэмнэ: 50 мкл стандарт уусмал эсвэл бэлтгэсэн дээжийг харгалзах нүхэнд нэмж, 50 мкл ферментийн коньюгат уусмал нэмнэ.Хавтанг гараар сэгсэрч зөөлөн хольж, таглаад 25 хэмд 30 минут байлгана.

9.2.7Угаах: Бүрхүүлийг зөөлөн авч, цооногоос шингэнийг асгаж, бичил цооногийг 250 мкл шингэрүүлсэн угаалгын уусмалаар зайлна (шийдэл6) 10 секундын зайд 4-5 удаа.Үлдэгдэл усыг шингээгч цаасаар шингээнэ (ашиглагдаагүй үзүүрээр үлдсэн агаарын бөмбөлгийг арилгах боломжтой).

9.2.8Өнгө: Худаг тус бүрт 50мкл субстратын уусмал, 50ул субстратын В уусмал нэмнэ.Хавтанг гараар сэгсэрч зөөлөн хольж, таглаад 25 хэмд 15 минут байлгана (12.8-ыг үзнэ үү).

9.2.11Хэмжих: Цооног бүрт 50 мкл зогсоолын уусмал нэмнэ.Хавтанг гараар сэгсэрч зөөлөн хольж, шингээлтийг 450 нм-д хэмжинэ (Энэ нь 450/630 нм давхар долгионы урттай хэмжихийг санал болгож байна. Үр дүнг зогсоох уусмал нэмсний дараа 5 минутын дотор уншина уу.)

10 Үр дүн

10.1Шингээлтийн хувь

Стандарт болон дээжийн хувьд олж авсан шингээлтийн утгын дундаж утгыг эхний стандартын (тэг стандарт) шингээлтийн утгад хувааж, 100% -иар үржүүлнэ.Тиймээс тэг стандартыг 100% -тай тэнцүү болгож, шингээлтийн утгыг хувиар илэрхийлнэ.

=

B ——шингээлтийн стандарт (эсвэл дээж)

B0 ——шингээлтийн 0 стандарт

10.2Стандарт муруй

----Стандарт муруй зурахдаа: Стандартуудын шингээлтийн утгыг y тэнхлэгээр, AOZ стандарт уусмалын концентрацийн хагас логарифмийг (ppb) x тэнхлэгээр авна.

---- Шалгалт тохируулгын муруйгаас уншиж болох дээж бүрийн AOZ концентрацийг (ppb) дагаж мөрдсөн дээж бүрийн шингэрүүлэлтийн харгалзах коэффициентоор үржүүлж, дээжийн бодит концентрацийг гаргана.

Анхаарна уу:

Бүх өгөгдлийг багасгах тусгай программ хангамжийг боловсруулсан бөгөөд үүнийг хүсэлтээр гаргаж болно.

Шингэрүүлэх хүчин зүйл…………………………………………………2

10.Мэдрэмж, нарийвчлал, нарийвчлал

Мэдрэмж: 0.025ppb

Илрүүлэх хязгаар:

Эд (булчин, элэг)…………………………0.1ppb

Зөгийн бал------------------------------------------------- -0.1ppb

Нарийвчлал:

Амьтны эд (булчин ба элэг)…………………100±20%

Зөгийн бал………………………………………………….. 100±20%

Нарийвчлал:ELISA багцын CV нь 10% -иас бага байна.

11.Анхаар

12.1 Урвалж болон дээжийг тасалгааны температурт (20-25℃) тохируулаагүй тохиолдолд стандарт болон дээжийн шингээлтийн дундаж утгыг бууруулна.

12.2 Амжилтгүй давтагдахаас зайлсхийхийн тулд бичил цооногийг үе шат хооронд хатаахыг бүү зөвшөөр, бичил цооногийн тавиурыг тогшсоны дараа шууд дараагийн алхамыг хийнэ.

12.3 Хэрэглэхийн өмнө урвалж бүрийг зөөлөн сэгсэрнэ.

12.4 Арьсаа зогсоох уусмалаас хол байлга, учир нь энэ нь 0.5MH юм2SO4шийдэл.

12.5 Хугацаа нь дууссан иж бүрдлийг бүү ашигла.Янз бүрийн багцын урвалжуудыг сольж болохгүй, эс тэгвээс энэ нь мэдрэмжийг бууруулна.

12.6 Хадгалах нөхцөл: ELISA иж бүрдлийг 2-8℃ хэмд байлгана, хөлдөж болохгүй.Бичил цооногийн хавтангуудыг битүүмжилж, бүх инкубацийн үед нарны шууд тусгалаас зайлсхий.Микротитрийн хавтанг таглахыг зөвлөж байна.

12.7. Субстратын уусмал өнгө болж хувирвал түүнийг орхих хэрэгтэй.Тэг стандартын шингээлтийн утга (450/630нм) 0.5-аас бага (A450nm<0.5) байвал урвалжууд муудаж болзошгүй.

12.8 Субстратын уусмал нэмснээс хойш 15 минутын дараа өнгөний урвал явагдана;Хэрэв өнгө нь хэтэрхий цайвар байвал та инкубацийн хугацааг 20 минут ба түүнээс дээш хугацаагаар сунгаж болно. 25 минутаас хэтрүүлж болохгүй. Харин эсрэгээр инкубацийн хугацааг зөв богиносго.

12.9 Урвалын оновчтой температур нь 25℃ байна.Өндөр эсвэл бага температур нь мэдрэмж, шингээлтийн утгыг өөрчлөхөд хүргэдэг.

12.Хадгалах нөхцөл, хадгалах хугацаа

Хадгалах нөхцөл: 2-8℃.

Хадгалах хугацаа: 12 сар.

 

 


  • Өмнөх:
  • Дараачийн:

  • Энд мессежээ бичээд бидэнд илгээгээрэй

    Холбоотой бүтээгдэхүүн