उत्पादन

1. १.पार्श्वभूमी

नायट्रोफुरन्स हे सिंथेटिक ब्रॉड-स्पेक्ट्रम अँटीबायोटिक्स आहेत, जे त्यांच्या उत्कृष्ट बॅक्टेरियाच्या वाढीस प्रतिबंध करणारा पदार्थ आणि फार्माकोकिनेटिक गुणधर्मांसाठी प्राण्यांच्या उत्पादनात वारंवार वापरले जातात.त्यांचा उपयोग डुक्कर, कुक्कुटपालन आणि जलचर उत्पादनामध्ये वाढ प्रवर्तक म्हणून देखील केला गेला होता.प्रयोगशाळेतील प्राण्यांच्या दीर्घकालीन अभ्यासात असे दिसून आले की मूळ औषधे आणि त्यांच्या चयापचयांमध्ये कार्सिनोजेनिक आणि म्युटेजेनिक वैशिष्ट्ये दिसून आली.यामुळे अन्न उत्पादनासाठी वापरल्या जाणार्‍या प्राण्यांवर उपचार करण्यासाठी नायट्रोफुरन्सवर बंदी घालण्यात आली आहे.1993 मध्ये EU मध्ये फुराल्टाडोन, नायट्रोफुरंटोइन आणि नायट्रोफुराझोन या नायट्रोफुरान औषधांवर अन्न प्राणी उत्पादनात वापरण्यास बंदी घालण्यात आली होती आणि 1995 मध्ये फुराझोलिडोनचा वापर प्रतिबंधित होता.

नायट्रोफुरन औषधांच्या अवशेषांचे विश्लेषण नायट्रोफुरनच्या मूळ औषधांच्या ऊती-बाउंड मेटाबोलाइट्सच्या शोधावर आधारित असणे आवश्यक आहे.मूळ औषधे अतिशय वेगाने चयापचय होत असल्याने, आणि ऊतकाने बांधलेले नायट्रोफुरन चयापचय दीर्घकाळ टिकून राहतील, या चयापचयांचा वापर नायट्रोफुरन्सचा गैरवापर शोधण्यासाठी लक्ष्य म्हणून केला जातो, ज्यात फुराझोलिडोन मेटाबोलाइट (एओझेड), फ्युराल्टॅडोन मेटाबोलाइट (एएमओझेड) यांचा समावेश होतो. ), नायट्रोफुराँटोइन मेटाबोलाइट (एएचडी) आणि नायट्रोफुराझोन मेटाबोलाइट (एसईएम).

AOZ-अवशेष सामान्यतः LC-MS किंवा LC-MS/MS द्वारे निर्धारित केले जातात.क्रोमॅटोग्राफिक पद्धतींच्या तुलनेत एन्झाइम इम्युनोअसे, संवेदनशीलता, शोध मर्यादा, तांत्रिक उपकरणे आणि वेळेची आवश्यकता यासंबंधी लक्षणीय फायदे दर्शवतात.(वेळ खर्च: 45 मिनिटे)

1. 2.चाचणी तत्त्व

हे एलिसा किट अप्रत्यक्ष-स्पर्धात्मक एंझाइम इम्युनोसेच्या तत्त्वावर आधारित AOZ शोधण्यासाठी डिझाइन केले आहे.मायक्रोटायटर विहिरी कॅप्चर BSA-लिंक्ड प्रतिजनसह लेपित आहेत.नमुन्यातील AOZ ऍन्टीबॉडी जोडण्यासाठी मायक्रोटायटर प्लेटवर लेपित प्रतिजनाशी स्पर्धा करते.एंजाइम संयुग्मित जोडल्यानंतर, क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट वापरला जातो आणि सिग्नल स्पेक्ट्रोफोटोमीटरने मोजला जातो.नमुन्यातील AOZ एकाग्रतेच्या प्रमाणात शोषण हे व्यस्त प्रमाणात आहे.

1. 3.अर्ज

हे किट AOZ अवशेषांच्या परिमाणात्मक आणि गुणात्मक विश्लेषणासाठी वापरले जाऊ शकतेअॅनिमा ऊतक(स्नायू, यकृत इ.), मध.

1. 4.क्रॉस-प्रतिक्रिया

फुराझोलिडोन मेटाबोलाइट (AOZ)………………………..100%

फुराल्टाडोन मेटाबोलाइट (AMOZ)………………………<0.1%

नायट्रोफुरंटोइन मेटाबोलाइट (एएचडी)………………………<0.1%

नायट्रोफुराझोन मेटाबोलाइट (SEM)………………………………<0.1%

फुराझोलिडोन ………………………………………………….. १६.३%

फुराल्टाडोन …………………………………………….…<1%

नायट्रोफुरंटोइन ……………………………………………………………… 1%

नायट्रोफुराझोन ………………………………………………………<1%

1. ५.आवश्यक साहित्य

५.१उपकरणे

----मायक्रोटायटर प्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (450nm/630nm)

---- रोटरी बाष्पीभवक किंवा नायट्रोजन कोरडे साधने

----होमोजेनायझर/पोटयंत्र

---- शेकर

----व्हर्टेक्स मिक्सर

---- अपकेंद्रित्र

---- विश्लेषणात्मक शिल्लक (प्रेरण: 0.01 ग्रॅम)

----ग्रॅज्युएटेड विंदुक: 10ml

----रबर पिपेट बल्ब

---- व्हॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क: 100 मिली

---- ग्लास फ्लास्क: 10ml

----पॉलीस्टीरिन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब: 2ml, 50ml

----मायक्रोपिपेट्स: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-मल्टीपिपेट

५.२अभिकर्मक

----इथिल एसीटेट (एआर)

----एन-हेक्सेन (किंवा एन-हेप्टेन) (एआर)

----डिपोटॅशियम हायड्रोजन फॉस्फेट ट्रायहायड्रेट

(K₂HPO₄.3 एच₂ओ) (एआर)

----केंद्रित हायड्रोक्लोरिक आम्ल (HCl, AR)

-----मिथेनॉल

----सोडियम हायड्रॉक्साइड (NaOH, AR)

---- विआयनीकृत पाणी

1. 6.किटचे घटक

l मायक्रोटायटर प्लेट प्रतिजनसह लेपित, 96 विहिरी

l मानक उपाय (6 बाटल्या, 1ml/बाटली)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l स्पाइकिंग मानक नियंत्रण : (1ml/बाटली) .......100ppb

l एकाग्र एंझाइम संयुग्म 1 मिली....... लाल टोपी

l एन्झाईम संयुग्मित डायल्युएंट्स 10 मिली………..ग्रीन कॅप

l सब्सट्रेट A 7ml ………………………………………….. पांढरी टोपी

l सब्सट्रेट B 7ml……………………………………………………… लाल टोपी

l स्टॉप सोल्यूशन 7 मिली …………………………… पिवळी टोपी

l 20×केंद्रित वॉश सोल्यूशन 40ml

………………………………………………पारदर्शक टोपी

l 2×केंद्रित निष्कर्षण द्रावण 60ml….ब्लू कॅप

l 2-नायट्रोबेन्झाल्डिहाइड 15.1mg………………पांढरी टोपी

1. ७.अभिकर्मक तयारी

उपाय 1: व्युत्पन्न अभिकर्मक:

2-नायट्रोबेन्झाल्डिहाइड असलेल्या बाटलीमध्ये 10 मिली मिथेनॉल घाला आणि विरघळवा.(10mM च्या एकाग्रतेवर).

उपाय 2: 0.1MK₂HPO₄उपाय:

वजन 22.8g K₂HPO₄.3 एच₂विरघळण्यासाठी डीआयोनाइज्ड पाण्यात O ते 1L.

उपाय 3: 1M HCl द्रावण

8.3ml केंद्रित हायड्रोक्लोरिक ऍसिड विरघळवा डीआयोनाइज्ड पाण्यासह 100 मिली.

उपाय ४:1M NaOH उपाय

4g NaOH 100ml deionized पाण्यात विरघळवा.

उपाय 5: निष्कर्षण उपाय:

1:1 च्या व्हॉल्यूम गुणोत्तरामध्ये डीआयोनाइज्ड पाण्याने 2×केंद्रित निष्कर्षण द्रावण पातळ करा.हे द्रावण 1 महिन्यासाठी 4℃ तापमानात संरक्षित केले जाऊ शकते, जे नमुने काढण्यासाठी वापरले जाईल.

उपाय 6: धुण्याचे उपाय:

1:19 च्या व्हॉल्यूम रेशनमध्ये 20×केंद्रित वॉश सोल्यूशन डीआयोनाइज्ड पाण्याने पातळ करा, ज्याचा वापर प्लेट्स धुण्यासाठी केला जाईल.हे पातळ केलेले द्रावण 4 डिग्री तापमानात 1 महिन्यासाठी संरक्षित केले जाऊ शकते.

1. 8.नमुना तयारी

८.१ऑपरेशनपूर्वी सूचना आणि खबरदारी:

अ) कृपया प्रयोगात एक-एक टिपा वापरा आणि भिन्न अभिकर्मक शोषताना टिपा बदला.

b) सर्व प्रायोगिक साधने स्वच्छ असल्याची खात्री करा.

c) व्युत्पन्न अभिकर्मक 2-8℃ वर तीन महिन्यांसाठी संरक्षित केले जाऊ शकते;

d) HCl द्रावण खोलीच्या तपमानावर 3 महिन्यांसाठी संरक्षित केले जाऊ शकते;

ई) NaOH द्रावण खोलीच्या तपमानावर 3 महिन्यांसाठी संरक्षित केले जाऊ शकते;

f) उपचार न केलेले नमुने फ्रीझमध्ये ठेवा (-20℃);

g) उपचार केलेले नमुने 24 तासांसाठी 2-8℃ अंधारात संरक्षित केले जाऊ शकतात.

8.2 प्राण्यांच्या ऊती आणि यकृताचे नमुने:

---- होमोजेनायझरसह नमुने एकसमान करा;

---- 50ml पॉलीस्टीरिन सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये एकजिनीकृत ऊतींचे नमुने 1.0±0.05g वजन.4ml deionized पाणी, 0.5ml 1M HCl द्रावण आणि 100ul व्युत्पन्न अभिकर्मक (द्रावण 1 पहा).२ मिनिटे हलवा.

---- रात्रभर 37℃ वर उष्मायन करा (सुमारे 16 तास);

---- 5ml 0.1MK जोडा₂HPO₄ (उपाय2), 0.4ml 1M NaOH (उपाय4) आणि 5ml इथाइल एसीटेट.30s साठी तीव्रपणे शेक;

---- खोलीच्या तपमानावर (20-25℃) 10 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज, किमान 3000 ग्रॅम;

---- 10ml स्वच्छ काचेच्या नळीमध्ये 2.5ml सुपरनाटंट ऑरगॅनिक फेज घ्या, 50-60℃ नायट्रोजन वायू किंवा रोटरी बाष्पीभवक सह कोरड्या करा;

---- कोरडे उरलेले 1ml n-hexane (किंवा n-heptane) सह विरघळवा, 30s साठी भोवरा, 1ml निष्कर्षण द्रावण घाला (उपाय5), भोवरा 1 मिनिट, पूर्णपणे मिसळा.

---- खोलीच्या तपमानावर सेंट्रीफ्यूज (20-25^oक) 5 मिनिटांसाठी, किमान 3000 ग्रॅम;

---- सुपरनाटंट सेंद्रिय टप्पा काढा;50μl सब्सट्रेट वॉटर फेज तपासणीसाठी घ्या.

8.4 मध

----एकजिनीकृत मधाच्या नमुन्याचे 1.0±0.05g वजन 50ml पॉलिस्टीरिन सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये करा;

---- 4 मिली डीआयोनाइज्ड पाणी, 0.5 मिली 1 एम एचसीएल (उपाय3) आणि 100μl व्युत्पन्न अभिकर्मक (उपाय1);2 मिनिटे पूर्णपणे हलवा;

---- रात्रभर 37℃ वर उष्मायन करा (सुमारे 16 तास);

---- 5ml 0.1MK जोडा₂HPO₄ (उपाय2), 0.4ml 1M NaOH (उपाय4) आणि 5ml इथाइल एसीटेट, 30s साठी जोरदारपणे हलवा;

---- खोलीच्या तपमानावर (२०-२५ डिग्री सेल्सियस) १० मिनिटांसाठी अपकेंद्रित्र, किमान ३००० ग्रॅम;

---- 10ml स्वच्छ काचेच्या नळीमध्ये 2.5ml सुपरनेटंट ऑरगॅनिक फेज घ्या, 50-60℃ नायट्रोजन वायू किंवा रोटरी बाष्पीभवन सह कोरड्या करा;

---- कोरडे उरलेले 1ml n-hexane (किंवा n-heptane) सह विरघळवा, 30s साठी भोवरा, 1ml निष्कर्षण द्रावण घाला (उपाय5), भोवरा 1 मिनिट, पूर्णपणे मिसळा.

---- खोलीच्या तपमानावर अपकेंद्रित्र (20-25^oक) 10 मिनिटांसाठी, किमान 3000 ग्रॅम;

---- सुपरनाटंट सेंद्रिय टप्पा काढा;50μl सब्सट्रेट वॉटर फेज तपासणीसाठी घ्या.

1. ९.परख प्रक्रिया

९.१परख करण्यापूर्वी सूचना

9.1.1 सर्व अभिकर्मक आणि मायक्रोवेल्स खोलीच्या तपमानावर (20-25℃) असल्याची खात्री करा.

9.1.2 वापरानंतर लगेच सर्व उर्वरित अभिकर्मक 2-8℃ वर परत करा.

9.1.3 मायक्रोवेल्स योग्यरित्या धुणे ही तपासणी प्रक्रियेतील एक महत्त्वाची पायरी आहे;एलिसा विश्लेषणाच्या पुनरुत्पादनक्षमतेसाठी हा महत्त्वाचा घटक आहे.

9.1.4 उष्मायन दरम्यान प्रकाश टाळा आणि मायक्रोवेल्स झाकून ठेवा.

9.2 परख चरण

9.2.1 खोलीच्या तपमानावर (20-25℃) 30 मिनिटांपेक्षा जास्त काळ सर्व अभिकर्मक बाहेर काढा, वापरण्यापूर्वी एकसमान करा.

9.2.2 आवश्यक असलेल्या मायक्रोवेल्स बाहेर काढा आणि उरलेल्या झिप-लॉक बॅगमध्ये 2-8℃ तत्काळ परत करा.

9.2.3 एकाग्र वॉश सोल्यूशन आणि कॉन्सट्रेटेड एक्सट्रॅक्शन सोल्यूशन वापरण्यापूर्वी खोलीच्या तापमानाला पुन्हा गरम केले पाहिजे.

९.२.४क्रमांक:प्रत्येक मायक्रोवेल पोझिशन्स क्रमांकित आणि सर्व मानके आणि नमुने डुप्लिकेटमध्ये चालवले जावेत.मानके आणि नमुने पोझिशन्स रेकॉर्ड करा.

९.२.५एकाग्र प्रतिपिंड द्रावणाचे सौम्य करणे: एकाग्र एंझाइमचे द्रावण 1:10 (1 फोल्ड कॉन्सन्ट्रेटेड एन्झाईम सोल्यूशन: 10 फोल्ड एन्झाइम कंजुगेट डायल्युएंट्स) च्या व्हॉल्यूम रेशोमध्ये एन्झाइम कॉन्जुगेट डायल्युएंट्ससह पातळ करा.

९.२.६मानक द्रावण / नमुना आणि एन्झाइम संयुग्मित द्रावण जोडा: 50µl प्रमाणित द्रावण किंवा तयार केलेला नमुना संबंधित विहिरींमध्ये घाला, 50µl एन्झाइम संयुग्म द्रावण घाला.प्लेटला हाताने हलवून हलक्या हाताने मिक्स करा आणि कव्हरसह 25°C वर 30 मिनिटे उबवा.

९.२.७धुवा: झाकण हळुवारपणे काढून टाका आणि विहिरीतील द्रव बाहेर टाका आणि 250µl पातळ केलेल्या वॉश सोल्यूशनने मायक्रोवेल्स स्वच्छ धुवा (उपाय6) 4-5 वेळा 10 च्या अंतराने.अवशिष्ट पाणी शोषक कागदासह शोषून घ्या (उर्वरित हवेचा फुगा न वापरलेल्या टीपने काढून टाकला जाऊ शकतो).

९.२.८रंगरंगोटी: प्रत्येक विहिरीला 50µl सब्सट्रेट सोल्यूशन A आणि 50ul सब्सट्रेट सोल्यूशन B घाला.प्लेटला हाताने हलवून हलक्या हाताने मिक्स करा आणि कव्हरसह 25℃ तापमानावर 15 मिनिटे उबवा (12.8 पहा).

९.२.११मोजणे: प्रत्येक विहिरीला 50µl स्टॉप सोल्यूशन घाला.प्लेटला हाताने हलवून हलक्या हाताने मिक्स करा आणि शोषकता 450nm वर मोजा (त्याने 450/630nm च्या दुहेरी-तरंगलांबीसह मोजमाप सुचवले आहे. स्टॉप सोल्यूशन जोडल्यानंतर 5 मिनिटांच्या आत निकाल वाचा.)

10 परिणाम

१०.१शोषणाची टक्केवारी

मानके आणि नमुन्यांसाठी मिळवलेल्या शोषक मूल्यांची सरासरी मूल्ये प्रथम मानक (शून्य मानक) च्या शोषक मूल्याने विभागली जातात आणि 100% ने गुणाकार केली जातात.अशा प्रकारे शून्य मानक 100% च्या बरोबरीचे केले जाते आणि शोषक मूल्ये टक्केवारीत उद्धृत केली जातात.

=

बी ——शोषक मानक (किंवा नमुना)

B0 ——शोषक शून्य मानक

१०.२मानक वक्र

---- एक मानक वक्र काढण्यासाठी: मानकांचे शोषक मूल्य y-अक्ष म्हणून घ्या, AOZ मानक द्रावण (ppb) च्या एकाग्रतेचे अर्ध लॉगरिदमिक x-अक्ष म्हणून घ्या.

----प्रत्येक नमुन्याची AOZ एकाग्रता (ppb), जी कॅलिब्रेशन वक्रातून वाचली जाऊ शकते, त्यानंतर प्रत्येक नमुन्याच्या संबंधित विघटन घटकाने गुणाकार केला जातो आणि नमुन्याची वास्तविक एकाग्रता प्राप्त होते.

कृपया लक्ष द्या:

सर्व डेटा कमी करण्यासाठी विशेष सॉफ्टवेअर विकसित केले गेले आहे, जे विनंतीनुसार प्रदान केले जाऊ शकते.

सौम्यता घटक………………………………………….……२

10.संवेदनशीलता, अचूकता आणि अचूकता

संवेदनशीलता: 0.025ppb

शोध मर्यादा:

ऊतक (स्नायू, यकृत) ……………………… ०.१ पीपीबी

मध --------------------------------- -0.1ppb

अचूकता:

प्राणी ऊती (स्नायू आणि यकृत) ………………………100±20%

मध ……………………………………………………… 100±20%

अचूकता:ELISA किटचा CV 10% पेक्षा कमी आहे.

11.लक्ष द्या

12.1 अभिकर्मक आणि नमुने खोलीच्या तपमानावर (20-25℃) नियंत्रित केले नसल्यास मानके आणि नमुन्यांसाठी प्राप्त शोषक मूल्यांची सरासरी मूल्ये कमी केली जातील.

12.2 अयशस्वी पुनरुत्पादकता टाळण्यासाठी आणि मायक्रोवेल्स होल्डरला टॅप केल्यानंतर लगेचच पुढील पायरी चालवण्यासाठी पायऱ्यांदरम्यान मायक्रोवेल्स कोरडे होऊ देऊ नका.

12.3 वापरण्यापूर्वी प्रत्येक अभिकर्मक हलक्या हाताने हलवा.

12.4 तुमची त्वचा स्टॉप सोल्यूशनपासून दूर ठेवा कारण ते 0.5MH आहे₂SO₄उपाय.

12.5 कालबाह्य किट वापरू नका.वेगवेगळ्या बॅचच्या अभिकर्मकांची देवाणघेवाण करू नका, अन्यथा ते संवेदनशीलता कमी करेल.

12.6 स्टोरेज स्थिती: ELISA किट 2-8℃ वर ठेवा, गोठवू नका.विश्रांतीच्या मायक्रोवेल प्लेट्स सील करा, सर्व उष्मायन दरम्यान सरळ सूर्यप्रकाश टाळा.मायक्रोटायटर प्लेट्स झाकण्याची शिफारस केली जाते.

12.7 सब्सट्रेट सोल्यूशनने रंग बदलल्यास ते सोडले पाहिजे.शून्य मानकांचे शोषक मूल्य (450/630nm) 0.5 (A450nm<0.5) पेक्षा कमी असल्यास अभिकर्मक खराब होऊ शकतात.

12.8 सब्सट्रेट सोल्यूशन जोडल्यानंतर रंगाची प्रतिक्रिया 15 मिनिटे लागते;जर रंग खूप हलका असेल तर तुम्ही उष्मायनाची वेळ 20 मिनिटांपर्यंत वाढवू शकता.

12.9 इष्टतम प्रतिक्रिया तापमान 25℃ आहे.उच्च किंवा कमी तापमानामुळे संवेदनशीलता आणि शोषक मूल्यांमध्ये बदल होईल.

12.स्टोरेज स्थिती आणि स्टोरेज कालावधी

स्टोरेज स्थिती: 2-8℃.

स्टोरेज कालावधी: 12 महिने.