उत्पादन

1. १.पृष्ठभूमि

नाइट्रोफुरान्स सिंथेटिक ब्रॉड-स्पेक्ट्रम एन्टिबायोटिक्स हुन्, जुन यसको उत्कृष्ट एन्टिब्याक्टेरियल र फार्माकोकाइनेटिक गुणहरूको लागि प्रायः पशु उत्पादनमा प्रयोग गरिन्छ।तिनीहरू सुँगुर, कुखुरा र जलीय उत्पादनमा वृद्धि प्रवर्द्धकको रूपमा पनि प्रयोग गरिन्थ्यो।प्रयोगशाला जनावरहरूसँगको लामो अवधिको अध्ययनले संकेत गर्‍यो कि अभिभावक औषधिहरू र तिनीहरूको मेटाबोलाइटहरूले कार्सिनोजेनिक र म्युटेजेनिक विशेषताहरू देखाए।यसले खाद्य उत्पादनको लागि प्रयोग हुने जनावरहरूको उपचारको लागि नाइट्रोफुरान्सको निषेध गरेको छ।नाइट्रोफुरान ड्रग्स फुराल्टाडोन, नाइट्रोफुरान्टोइन र नाइट्रोफुराजोनलाई 1993 मा EU मा खाद्य पशु उत्पादनमा प्रयोग गर्न प्रतिबन्ध लगाइएको थियो, र 1995 मा फुराजोलिडोनको प्रयोग निषेध गरिएको थियो।

नाइट्रोफुरान ड्रग्सको अवशेषको विश्लेषण नाइट्रोफुरान अभिभावक ड्रग्सको टिश्यु बाउन्ड मेटाबोलाइट्स पत्ता लगाउने आधारमा हुनुपर्छ।किनकी अभिभावक औषधिहरू धेरै छिटो मेटाबोलाइज्ड हुन्छन्, र टिश्यु बाउन्ड नाइट्रोफुरान मेटाबोलाइटहरू लामो समयसम्म कायम रहनेछन्, यी मेटाबोलाइटहरू नाइट्रोफुरान्सको दुरुपयोग पत्ता लगाउन लक्ष्यको रूपमा प्रयोग गरिन्छ, जसमा फुराजोलिडोन मेटाबोलाइट (AOZ), फुराल्टाडोन मेटाबोलाइट (AMOZ) समावेश छ। ), नाइट्रोफुरान्टोइन मेटाबोलाइट (AHD) र नाइट्रोफुराजोन मेटाबोलाइट (SEM)।

AOZ-अवशेषहरू सामान्यतया LC-MS वा LC-MS/MS द्वारा निर्धारण गरिन्छ।क्रोमेटोग्राफिक विधिहरूको तुलनामा इन्जाइम इम्युनोएस्सीहरूले संवेदनशीलता, पत्ता लगाउने सीमा, प्राविधिक उपकरण र समय आवश्यकताको सन्दर्भमा पर्याप्त फाइदाहरू देखाउँछन्।(समय लागत: 45 मिनेट)

1. २.परीक्षण सिद्धान्त

यो ELISA किट अप्रत्यक्ष-प्रतिस्पर्धी इन्जाइम immunoassay को सिद्धान्तमा आधारित AOZ पत्ता लगाउन डिजाइन गरिएको हो।माइक्रोटाइटर कुवाहरू क्याप्चर BSA-लिंक गरिएको एन्टिजेनसँग लेपित छन्।नमूनामा AOZ एन्टिबडी थप्नको लागि माइक्रोटाइटर प्लेटमा लेपित एन्टिजेनसँग प्रतिस्पर्धा गर्दछ।इन्जाइम कन्जुगेटको थप पछि, क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट प्रयोग गरिन्छ र संकेत स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा मापन गरिन्छ।अवशोषण नमूना मा AOZ एकाग्रता को विपरीत समानुपातिक छ।

1. ३.अनुप्रयोगहरू

यो किट AOZ अवशेषको मात्रात्मक र गुणात्मक विश्लेषणमा प्रयोग गर्न सकिन्छ।एनिमा ऊतक(मांसपेशी, कलेजो आदि), मह।

1. ४।क्रस-प्रतिक्रियाहरू

फुराजोलिडोन मेटाबोलाइट (AOZ)………………………..१००%

Furaltadone मेटाबोलाइट (AMOZ)………………………<०.१%

नाइट्रोफुरेन्टोइन मेटाबोलाइट (एएचडी)………………………<०.१%

नाइट्रोफुराजोन मेटाबोलाइट (SEM)………………………………<०.१%

Furazolidone ……………………………………………………… 16.3%

Furaltadone ……………………………………………………… 1%

नाइट्रोफुरान्टोइन ……………………………………………………… 1%

नाइट्रोफुराजोन ……………………………………………………… १%

1. ५.आवश्यक सामग्री

५.१उपकरणहरू

----माइक्रोटाइटर प्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमिटर (450nm/630nm)

----रोटरी बाष्पीकरण वा नाइट्रोजन सुकाउने उपकरण

----होमोजेनाइजर/पेटकर

---- शेकर

---- भोर्टेक्स मिक्सर

---- सेन्ट्रीफ्यूज

---- विश्लेषणात्मक सन्तुलन (प्रेरण: ०.०१ ग्राम)

----स्नातक पिपेट: 10ml

----रबर पिपेट बल्ब

---- भोल्युमेट्रिक फ्लास्क: 100ml

---- ग्लास फ्लास्क: 10ml

----Polystyrene सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब: 2ml, 50ml

----माइक्रोपिपेट्स: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-मल्टीपिपेट

५.२अभिकर्मकहरू

----इथाइल एसीटेट (एआर)

----एन-हेक्सेन (वा एन-हेप्टेन) (एआर)

---- डिपोटासियम हाइड्रोजन फास्फेट ट्राइहाइड्रेट

(K₂HPO₄3H₂ओ) (एआर)

----केन्द्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl, AR)

-----मिथानोल

----सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH, AR)

---- विआयनीकृत पानी

1. ६।किट अवयवहरू

l माइक्रोटाइटर प्लेट एन्टिजनको साथ लेपित, 96 कुवाहरू

l मानक समाधान (6 बोतल, 1 एमएल / बोतल)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l स्पिकिङ मानक नियन्त्रण: (1ml/बोतल) .......100ppb

l केन्द्रित इन्जाइम कन्जुगेट 1 एमएल ....... रातो टोपी

l इन्जाइम कन्जुगेट 10 मिलीलीटर ……….. हरियो टोपी

l सब्सट्रेट A 7ml……………………………………………….. सेतो टोपी

l सब्सट्रेट B 7ml……………………………………………………… रातो टोपी

l स्टप समाधान 7ml ……………………………… पहेंलो टोपी

l 20×केन्द्रित धुने समाधान 40ml

…………………………………………… पारदर्शी टोपी

l 2×केन्द्रित निकासी समाधान 60ml...निलो टोपी

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg……………… सेतो टोपी

1. ७।अभिकर्मक तयारी

समाधान 1: व्युत्पन्न अभिकर्मक:

2-नाइट्रोबेन्जाल्डिहाइड भएको बोतलमा 10ml मिथानोल थप्नुहोस् र भंग गर्नुहोस्।(10mm को एकाग्रता मा)।

समाधान 2: 0.1MK₂HPO₄समाधान:

तौल २२.८ ग्राम K₂HPO₄3H₂O to 1L विआयनीकृत पानी भंग गर्न।

समाधान 3: 1M HCl समाधान

8.3ml केन्द्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड भंग गर्नुहोस् 100ml को deionized पानी संग।

समाधान ४:1M NaOH समाधान

100ml deionized पानी संग 4g NaOH घुल्नुहोस्।

समाधान ५: निकासी समाधान:

1:1 को भोल्युम अनुपातमा विआयनीकृत पानीको साथ 2×केन्द्रित निकासी समाधान पातलो गर्नुहोस्।यो समाधान 1 महिनाको लागि 4℃ मा संरक्षित गर्न सकिन्छ, जुन नमूनाहरू निकाल्न प्रयोग गरिनेछ।

समाधान 6: धुने समाधान:

1:19 को भोल्युम राशनमा डियोनाइज्ड पानीको साथ 20×केन्द्रित धुने समाधान पातलो गर्नुहोस्, जुन प्लेटहरू धुन प्रयोग गरिनेछ।यो पातलो घोल 1 महिनाको लागि 4 ℃ मा सुरक्षित गर्न सकिन्छ।

1. ८।नमूना तयारीहरू

८.१सञ्चालन गर्नु अघि सूचना र सावधानीहरू:

a) कृपया प्रयोगमा एक-अफ सुझावहरू प्रयोग गर्नुहोस्, र विभिन्न अभिकर्मकहरू अवशोषित गर्दा सुझावहरू परिवर्तन गर्नुहोस्।

ख) सबै प्रयोगात्मक उपकरणहरू सफा छन् भनी सुनिश्चित गर्नुहोस्।

ग) व्युत्पन्न अभिकर्मक 2-8 ℃ मा तीन महिनाको लागि सुरक्षित गर्न सकिन्छ;

घ) HCl घोल ३ महिनाको लागि कोठाको तापक्रममा सुरक्षित गर्न सकिन्छ;

ई) NaOH समाधान कोठाको तापक्रममा ३ महिनासम्म सुरक्षित गर्न सकिन्छ;

f) उपचार नगरिएका नमूनाहरूलाई फ्रिजमा राख्नुहोस् (-20 ℃);

g) उपचार गरिएका नमूनाहरू अन्धकारमा 2-8 ℃ मा 24 घण्टाको लागि सुरक्षित गर्न सकिन्छ।

८.२ जनावरको तन्तु र कलेजोको नमूनाहरू:

---- होमोजेनाइजरको साथ नमूनाहरू एकरूप बनाउनुहोस्;

---- वजन १.०±०.०५ ग्राम होमोजेनाइज्ड टिस्यु नमूनाको ५० एमएल पोलिस्टीरिन सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा।4ml deionized पानी, 0.5ml 1M HCl समाधान र 100ul व्युत्पन्न अभिकर्मक थप्नुहोस् (समाधान 1 हेर्नुहोस्)।यसलाई 2 मिनेटको लागि हल्लाउनुहोस्।

---- रातभर 37 ℃ मा इन्क्युबेट (लगभग 16 घण्टा);

---- 5ml 0.1MK थप्नुहोस्₂HPO₄ (समाधान2), 0.4ml 1M NaOH (समाधान4) र 5ml एथिल एसीटेट।30 को लागि कडा हल्लाउनुहोस्;

---- कोठाको तापक्रममा (२०-२५ डिग्री सेल्सियस) १० मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज, कम्तिमा ३००० ग्राम;

---- 10ml सफा गिलासको ट्यूबमा 2.5ml supernatant अर्गानिक चरण लिनुहोस्, 50-60℃ नाइट्रोजन ग्यास वा रोटरी बाष्पीकरण संग सुकाउनुहोस्;

---- 1ml n-hexane (वा n-heptane), 30s को लागि भर्टेक्स, 1ml निकासी समाधान थप्नुहोस् (समाधान5), भोर्टेक्स 1 मिनेट, पूर्ण रूपमा मिश्रण गर्नुहोस्।

---- कोठाको तापक्रममा अपकेंद्रित्र (२०-२५^oसी) 5 मिनेटको लागि, कम्तिमा 3000 ग्राम;

---- सतही जैविक चरण हटाउनुहोस्;परखको लागि सब्सट्रेट पानी चरणको 50μl लिनुहोस्।

८.४ मह

---- १.०±०.०५ ग्राम होमोजेनाइज्ड मह नमूनाको तौल ५० एमएल पोलिस्टाइरिन सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमा;

---- 4ml विआयनीकृत पानी थप्नुहोस्, 0.5ml 1M HCl (समाधान3) र 100μl व्युत्पन्न अभिकर्मक (समाधान१);2 मिनेटको लागि पूर्ण रूपमा हल्लाउनुहोस्;

---- रातभर ३७ ℃ मा इन्क्यूबेट गर्नुहोस् (लगभग 16 घण्टा);

---- 5ml 0.1MK थप्नुहोस्₂HPO₄ (समाधान2), 0.4ml 1M NaOH (समाधान4) र 5ml एथिल एसीटेट, 30 को लागि कडा हल्लाउनुहोस्;

---- कोठाको तापक्रममा (२०-२५ डिग्री सेल्सियस) १० मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज, कम्तिमा ३००० ग्राम;

---- 10ml सफा गिलासको ट्यूबमा 2.5ml सुपरनेटेन्ट अर्गानिक चरण लिनुहोस्, 50-60 ℃ नाइट्रोजन ग्यास वा रोटरी बाष्पीकरणले सुकाउनुहोस्;

---- 1ml n-hexane (वा n-heptane), 30s को लागि भर्टेक्स, 1ml निकासी समाधान थप्नुहोस् (समाधान5), भोर्टेक्स 1 मिनेट, पूर्ण रूपमा मिश्रण गर्नुहोस्।

---- कोठाको तापक्रममा सेन्ट्रीफ्यूज (२०-२५^oC) 10 मिनेटको लागि, कम्तिमा 3000 ग्राम;

---- supernatant जैविक चरण हटाउनुहोस्;परखको लागि सब्सट्रेट पानी चरणको 50μl लिनुहोस्।

1. ९।परख प्रक्रिया

९.१परीक्षा अघि सूचना

9.1.1 सुनिश्चित गर्नुहोस् कि सबै अभिकर्मकहरू र माइक्रोवेलहरू सबै कोठाको तापक्रम (20-25 ℃) मा छन्।

9.1.2 सबै बाँकी अभिकर्मकहरू प्रयोग पछि तुरुन्तै 2-8℃ मा फर्काउनुहोस्।

9.1.3 सही तरिकाले माइक्रोवेल धुनु परख को प्रक्रिया मा एक महत्वपूर्ण कदम हो;यो ELISA विश्लेषणको प्रजनन क्षमताको लागि महत्त्वपूर्ण कारक हो।

9.1.4 इन्क्युबेशनको समयमा प्रकाशबाट बच्नुहोस् र माइक्रोवेलहरू छोप्नुहोस्।

9.2 परख चरणहरू

9.2.1 सबै अभिकर्मकहरू कोठाको तापक्रम (20-25 ℃) मा 30 मिनेट भन्दा बढीको लागि बाहिर निकाल्नुहोस्, प्रयोग गर्नु अघि एकरूपता बनाउनुहोस्।

9.2.2 आवश्यक माइक्रोवेलहरू बाहिर निकाल्नुहोस् र बाँकीलाई 2-8℃ मा तुरुन्तै जिप-लक झोलामा फर्काउनुहोस्।

9.2.3 केन्द्रित धुने समाधान र केन्द्रित निकासी समाधान प्रयोग गर्नु अघि कोठाको तापक्रममा पुन: वार्म गर्नुपर्छ।

९.२.४नम्बर:प्रत्येक माइक्रोवेल स्थितिहरू नम्बर गरिएको र सबै मापदण्डहरू र नमूनाहरू डुप्लिकेटमा चलाइनुपर्छ।मापदण्ड र नमूना स्थितिहरू रेकर्ड गर्नुहोस्।

९.२.५केन्द्रित एन्टिबडी समाधान को पतला: केन्द्रित इन्जाइम समाधानलाई १:१० को भोल्युम अनुपातमा इन्जाइम कन्जुगेट डिलुएन्ट्ससँग पातलो गर्नुहोस् (१ गुणा केन्द्रित इन्जाइम समाधान: १० फोल्ड इन्जाइम कन्जुगेट पातलो)।

९.२.६मानक समाधान / नमूना र इन्जाइम कन्जुगेट समाधान थप्नुहोस्: 50µl मानक समाधान वा तयार नमूना सम्बन्धित कुवाहरूमा थप्नुहोस्, 50µl इन्जाइम कन्जुगेट समाधान थप्नुहोस्।प्लेटलाई हातले हल्लाएर बिस्तारै मिलाउनुहोस् र कभरको साथ 25 डिग्री सेल्सियसमा 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्।

९.२.७धुनुहोस्: कभरलाई बिस्तारै हटाउनुहोस् र इनारहरूबाट तरल पदार्थ खन्याउनुहोस् र माइक्रोवेलहरूलाई 250µl पातलो धुने घोलले कुल्ला गर्नुहोस् (समाधान6) 4-5 पटकको लागि 10s को अन्तरालमा।अवशोषक कागजको साथ अवशिष्ट पानी अवशोषित गर्नुहोस् (बाँकी हावाको बबल प्रयोग नगरिएको टिपको साथ हटाउन सकिन्छ)।

९.२.८रंग: प्रत्येक इनारमा ५०µl सब्सट्रेट समाधान A र 50ul सब्सट्रेट समाधान B थप्नुहोस्।प्लेटलाई म्यानुअल रूपमा रक गरेर बिस्तारै मिलाउनुहोस् र कभरको साथ 25 डिग्री सेल्सियसमा 15 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस् (१२.८ हेर्नुहोस्)।

९.२.११मापन: प्रत्येक इनारमा ५०µl स्टप समाधान थप्नुहोस्।प्लेटलाई म्यानुअल रूपमा रक गरेर बिस्तारै मिलाउनुहोस् र 450nm मा अवशोषण मापन गर्नुहोस् (यसले 450/630nm को दोहोरो-तरंग लम्बाइको साथ मापन गर्न सुझाव दिएको छ। स्टप समाधान थपेपछि 5 मिनेट भित्र नतिजा पढ्नुहोस्।)

10 परिणामहरू

१०.१प्रतिशत अवशोषण

मानकहरू र नमूनाहरूका लागि प्राप्त गरिएको अवशोषण मानहरूको औसत मानहरूलाई पहिलो मानक (शून्य मानक) को अवशोषण मानले विभाजित गरी 100% ले गुणन गरिन्छ।यसरी शून्य मानकलाई १००% बराबर बनाइन्छ र अवशोषण मानहरू प्रतिशतमा उद्धृत गरिन्छ।

=

B ——अवशोषण मानक (वा नमूना)

B0 — शोषण शून्य मानक

१०.२मानक वक्र

---- एक मानक वक्र कोर्न को लागी: y-अक्ष को रूप मा मानक को शोषक मान लिनुहोस्, x-अक्ष को रूप मा AOZ मानक समाधान (ppb) को एकाग्रता को अर्ध लॉगरिदमिक।

---- प्रत्येक नमूना (ppb) को AOZ एकाग्रता, जुन क्यालिब्रेसन कर्भबाट पढ्न सकिन्छ, प्रत्येक नमूनाको सम्बन्धित कमजोरी कारकद्वारा गुणा गरिन्छ, र नमूनाको वास्तविक एकाग्रता प्राप्त हुन्छ।

कृपया ध्यान दिनुहोस्:

सबै डाटा घटाउनको लागि विशेष सफ्टवेयर विकास गरिएको छ, जुन अनुरोधमा प्रदान गर्न सकिन्छ।

कमजोरी कारक………………………………………………

१०।संवेदनशीलता, शुद्धता र परिशुद्धता

संवेदनशीलता: 0.025ppb

पत्ता लगाउने सीमा:

तन्तु (मांसपेशी, कलेजो)……………………… ०.१ पीपीबी

मह ------------------------------------------------- -0.1ppb

शुद्धता:

जनावरको तन्तु (मांसपेशी र कलेजो) ………………………100±20%

मह ……………………………………………………… 100±20%

परिशुद्धता:ELISA किटको CV 10% भन्दा कम छ।

११।सूचना

12.1 मापदण्डहरू र नमूनाहरूका लागि प्राप्त गरिएको अवशोषण मानहरूको औसत मानहरू घटाइनेछ यदि अभिकर्मक र नमूनाहरू कोठाको तापक्रम (20-25 ℃) मा नियमन गरिएको छैन भने।

12.2 असफल प्रजननताबाट बच्न र माइक्रोवेल होल्डरमा ट्याप गरेपछि तुरुन्तै अर्को चरण सञ्चालन गर्न चरणहरू बीचमा माइक्रोवेलहरू सुक्न नदिनुहोस्।

१२.३ प्रयोग गर्नु अघि प्रत्येक अभिकर्मकलाई बिस्तारै हल्लाउनुहोस्।

12.4 तपाईंको छालालाई स्टप समाधानबाट टाढा राख्नुहोस् किनभने यो 0.5MH हो₂SO₄समाधान।

12.5 पुराना किटहरू प्रयोग नगर्नुहोस्।विभिन्न ब्याचका अभिकर्मकहरू साटासाट नगर्नुहोस्, अन्यथा यसले संवेदनशीलता छोड्नेछ।

12.6 भण्डारण अवस्था: ELISA किटहरू 2-8 ℃ मा राख्नुहोस्, फ्रिज नगर्नुहोस्।आराम माइक्रोवेल प्लेटहरू सील गर्नुहोस्, सबै इन्क्युबेशनको समयमा सीधा घामबाट बच्नुहोस्।माइक्रोटाइटर प्लेटहरू ढाक्न सिफारिस गरिन्छ।

12.7 सब्सट्रेट घोलले रङ बदल्यो भने त्यसलाई त्याग्नु पर्छ।यदि शून्य मानकको अवशोषण मान (450/630nm) 0.5 (A450nm<0.5) भन्दा कम छ भने अभिकर्मकहरू बिग्रन सक्छन्।

12.8 सब्सट्रेट समाधान थपे पछि रंगीन प्रतिक्रिया 15 मिनेट चाहिन्छ;यदि रंग निर्धारण गर्न धेरै हल्का छ भने तपाईले इन्क्युबेशन समयलाई 20 मिनेट वा सोभन्दा बढी लम्ब्याउन सक्नुहुन्छ।, 25 मिनेट भन्दा बढि कहिल्यै नगर्नुहोस्। यसको विपरित, इन्क्युबेशन समयलाई ठीकसँग छोटो पार्नुहोस्।

12.9 इष्टतम प्रतिक्रिया तापमान 25 ℃ हो।उच्च वा कम तापमानले संवेदनशीलता र अवशोषण मानहरूमा परिवर्तन ल्याउनेछ।

१२।भण्डारण अवस्था र भण्डारण अवधि

भण्डारण अवस्था: 2-8 ℃।

भण्डारण अवधि: 12 महिना.