produkt

Konkurencyjny zestaw immunoenzymatyczny do analizy ilościowej metabolitu furazolidonu (AOZ)

Krótki opis:

Ten zestaw ELISA jest przeznaczony do wykrywania AOZ w oparciu o zasadę pośrednio-kompetycyjnego testu immunologicznego.Studzienki do mikromiareczkowania powleka się antygenem wychwytującym związanym z BSA.AOZ w próbce konkuruje z antygenem opłaszczonym na płytce mikrotitracyjnej o dodane przeciwciało.Po dodaniu koniugatu enzymu stosuje się chromogenny substrat i mierzy sygnał za pomocą spektrofotometru.Absorpcja jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia AOZ w próbce.


Szczegóły produktu

Tagi produktów

Konkurencyjny zestaw immunoenzymatyczny do

Analiza ilościowaMetabolit furazolidonu(AOZ)

 

  1. 1.Tło

Nitrofurany to syntetyczne antybiotyki o szerokim spektrum działania, często stosowane w produkcji zwierzęcej ze względu na doskonałe właściwości przeciwbakteryjne i farmakokinetyczne.Stosowano je również jako stymulatory wzrostu w produkcji trzody chlewnej, drobiu i w hodowli wodnej.W długoterminowych badaniach na zwierzętach laboratoryjnych wykazano, że leki macierzyste i ich metabolity wykazują właściwości rakotwórcze i mutagenne.Doprowadziło to do wprowadzenia zakazu stosowania nitrofuranów w leczeniu zwierząt wykorzystywanych do produkcji żywności.Narkotyki nitrofuranowe, furaltadon, nitrofurantoina i nitrofurazon, zostały zakazane w produkcji zwierzęcej w UE w 1993 r., a stosowanie furazolidonu zostało zakazane w 1995 r.

Analiza pozostałości leków nitrofuranowych musi opierać się na wykrywaniu związanych z tkankami metabolitów nitrofuranowych leków macierzystych.Ponieważ leki macierzyste są bardzo szybko metabolizowane, a związane z tkankami metabolity nitrofuranu utrzymują się przez długi czas, metabolity te są wykorzystywane jako cel w wykrywaniu nadużywania nitrofuranów, do których należą metabolit furazolidonu (AOZ), metabolit furaltadonu (AMOZ ), metabolit nitrofurantoiny (AHD) i metabolit nitrofurazonu (SEM).

Reszty AOZ oznacza się najczęściej metodą LC-MS lub LC-MS/MS.Testy immunologiczne enzymatyczne, w porównaniu z metodami chromatograficznymi, wykazują znaczne zalety pod względem czułości, granicy wykrywalności, wyposażenia technicznego i wymagań czasowych.(Koszt czasu: 45 min)

  1. 2.Zasada testu

Ten zestaw ELISA jest przeznaczony do wykrywania AOZ w oparciu o zasadę pośrednio-kompetycyjnego testu immunologicznego.Studzienki do mikromiareczkowania powleka się antygenem wychwytującym związanym z BSA.AOZ w próbce konkuruje z antygenem opłaszczonym na płytce mikrotitracyjnej o dodane przeciwciało.Po dodaniu koniugatu enzymu stosuje się chromogenny substrat i mierzy sygnał za pomocą spektrofotometru.Absorpcja jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia AOZ w próbce.

  1. 3.Aplikacje

Zestaw ten może być wykorzystany do ilościowej i jakościowej analizy pozostałości AOZ wtkanki zwierzęce(mięśnie, wątroba itp.), miód.

  1. 4.Reakcje krzyżowe

Metabolit furazolidonu (AOZ)……………………..100%

Metabolit furaltadonu (AMOZ)……………………<0,1%

Metabolit nitrofurantoiny (AHD)……………………<0,1%

Metabolit nitrofurazonu (SEM)…………………...…<0,1%

Furazolidon…………………………………….…..…16,3%

Furaltadon…………………………………………….…<1%

Nitrofurantoina…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon………………..…<1%

  1. 5.Wymagane materiały

5.1Urządzenia

---- Spektrofotometr do płytek mikrotitracyjnych (450nm/630nm)

---- Parownik obrotowy lub instrumenty do suszenia azotem

---- Homogenizator / stomacher

----Wibrator

----Mieszalnik wirowy

----Odwirować

---- waga analityczna (indukcyjność: 0.01g)

---- Pipeta z podziałką: 10 ml

---- Gumowa gruszka do pipety

---- Kolba miarowa: 100 ml

---- Szklana kolba: 10 ml

---- Polistyrenowa probówka do wirowania: 2 ml, 50 ml

----Mikropipety: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

Multipipeta 250ul

5.2Odczynniki

---- Octan etylu (AR)

----n-heksan (lub n-heptan) (AR)

----Trójwodzian wodorofosforanu dipotasu

(K2HPO4.3H2O) (AR)

---- Stężony kwas solny (HCl, AR)

-----Metanol

---- Wodorotlenek sodu (NaOH, AR)

----Dejonizowana woda

  1. 6.Elementy zestawu

l Płytka do mikromiareczkowania pokryta antygenem, 96 studzienek

l standardowe roztwory (6 butelek, 1 ml/butelka)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Wzbogacanie standardowej kontroli: (1 ml/butelkę).…….100 ppb

l Skoncentrowany koniugat enzymu 1ml ……..czerwona nakrętka

l Rozcieńczalniki koniugatów enzymów 10ml ………..zielona zakrętka

l Substrat A 7ml……………….……..…..biała zakrętka

l Substrat B 7ml…………………………….…..czerwona zakrętka

l Roztwór zatrzymujący 7ml………………………………żółta nakrętka

l 20×stężony roztwór do płukania 40ml

…………………………………….……przezroczysta nasadka

l 2×stężony roztwór do ekstrakcji 60ml….niebieska zakrętka

l 2-Nitrobenzaldehyd 15,1mg………………biała zakrętka

  1. 7.Przygotowanie odczynników

Rozwiązanie 1: odczynnik pochodny:

Dodać 10 ml metanolu do butelki zawierającej 2-nitrobenzaldehyd i rozpuścić.(w stężeniu 10 mM).

Rozwiązanie 2: 0,1 MK2HPO4rozwiązanie:

Ważą 22,8 g K2HPO4.3H20 do 1 l wody dejonizowanej do rozpuszczenia.

Rozwiązanie 3: 1M roztwór HCl

Rozpuścić 8,3 ml stężonego kwasu solnego wodą dejonizowaną do 100 ml.

Rozwiązanie 4:1M roztwór NaOH

Rozpuść 4 g NaOH w 100 ml wody dejonizowanej.

Rozwiązanie 5: roztwór do ekstrakcji:

Rozcieńczyć 2×stężony roztwór ekstrakcyjny wodą dejonizowaną w stosunku objętościowym 1:1.Ten roztwór można przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 ℃, która zostanie wykorzystana do ekstrakcji próbek.

Rozwiązanie 6: roztwór do przemywania:

Rozcieńczyć 20×stężony roztwór do płukania wodą dejonizowaną w stosunku objętościowym 1:19, który będzie używany do mycia płytek.Ten rozcieńczony roztwór można przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 ℃.

  1. 8.Przykładowe preparaty

8.1Uwaga i środki ostrożności przed rozpoczęciem pracy:

a) Proszę używać jednorazowych końcówek w eksperymencie i zmieniać końcówki podczas wchłaniania innego odczynnika.

b) Upewnij się, że wszystkie instrumenty doświadczalne są czyste.

c) odczynnik pochodny można przechowywać w temperaturze 2-8°C przez trzy miesiące;

d) Roztwór HCl można przechowywać w temperaturze pokojowej przez 3 miesiące;

e) Roztwór NaOH można przechowywać przez 3 miesiące w temperaturze pokojowej;

f) Przechowywać nietraktowane próbki w zamrażarce (-20 ℃);

g) Poddane obróbce próbki można przechowywać przez 24 godziny w temperaturze 2-8 ℃ w ciemności.

8.2 Próbki tkanek zwierzęcych i wątroby:

---- Homogenizuj próbki za pomocą homogenizatora;

---- Odważ 1,0 ± 0,05 g homogenizowanej próbki tkanki do 50 ml polistyrenowej probówki do wirowania.Dodać 4 ml dejonizowanej wody, 0,5 ml 1M roztworu HCl i 100 ul pochodnej odczynnika (patrz roztwór 1).Wstrząsaj przez 2 minuty.

---- Inkubować w temperaturze 37 ℃ przez noc (około 16 godzin);

---- Dodaj 5ml 0.1MK2HPO4 (rozwiązanie2), 0,4 ml 1M NaOH (rozwiązanie4) i 5 ml octanu etylu.Mocno wstrząsać przez 30 sekund;

---- Wirować w temperaturze pokojowej (20-25 ℃) przez 10 minut, co najmniej 3000 g;

---- Wziąć 2,5 ml supernatantu fazy organicznej do 10 ml czystej szklanej probówki, wysuszyć za pomocą azotu o temperaturze 50-60 ℃ lub wyparki obrotowej;

---- Rozpuścić suchą pozostałość z 1 ml n-heksanu (lub n-heptanu), worteksować przez 30 sekund, dodać 1 ml roztworu ekstrakcyjnego (rozwiązanie5), worteksować 1 min, całkowicie wymieszać.

---- Wirować w temperaturze pokojowej (20-25 stoC) przez 5 minut, co najmniej 3000 g;

---- Usuń fazę organiczną supernatantu;pobrać 50 μl fazy wodnej substratu do analizy.

 

8.4 Miód

----odważyć 1,0 ± 0,05 g homogenizowanej próbki miodu do 50 ml polistyrenowej probówki wirówkowej;

---- Dodaj 4 ml wody dejonizowanej, 0,5 ml 1 M HCl (rozwiązanie3) i 100 μl odczynnika pochodnego (rozwiązanie1);wstrząsać całkowicie przez 2 minuty;

---- Inkubuj w temperaturze 37 ℃ przez noc (około 16 godzin);

---- Dodaj 5ml 0.1MK2HPO4 (rozwiązanie2), 0,4 ml 1M NaOH (rozwiązanie4) i 5 ml octanu etylu, energicznie wstrząsać przez 30 sekund;

---- Wirować w temperaturze pokojowej (20-25 ℃) przez 10 minut, co najmniej 3000 g;

---- Weź 2,5 ml supernatantu fazy organicznej do 10 ml czystej szklanej probówki, osusz azotem o temperaturze 50-60 ℃ lub wyparką rotacyjną;

----Rozpuścić suche pozostałości z 1 ml n-heksanu (lub n-heptanu), worteksować przez 30 sekund, dodać 1 ml roztworu ekstrakcyjnego (rozwiązanie5), worteksować 1 min, całkowicie wymieszać.

---- Wirować w temperaturze pokojowej (20-25oC) przez 10 min, co najmniej 3000 g;

---- Usuń fazę organiczną supernatantu;pobrać 50 μl fazy wodnej substratu do analizy.

  1. 9.Proces testowy

9.1Uwaga przed testem

9.1.1 Upewnij się, że wszystkie odczynniki i mikrostudzienki mają temperaturę pokojową (20-25℃).

9.1.2 Natychmiast po użyciu przywróć wszystkie pozostałe odczynniki do temperatury 2-8 ℃.

9.1.3 Prawidłowe płukanie mikrodołków jest ważnym krokiem w procesie oznaczania;jest to istotny czynnik powtarzalności analizy ELISA.

9.1.4 Unikać światła i przykrywać mikrostudzienki podczas inkubacji.

9.2 Etapy testu

9.2.1 Wyjmij wszystkie odczynniki w temperaturze pokojowej (20-25℃) na ponad 30 minut, homogenizuj przed użyciem.

9.2.2 Wyjmij potrzebne mikrodołki i natychmiast włóż resztę do torebki strunowej w temperaturze 2-8 ℃.

9.2.3 Stężony roztwór do przemywania i stężony roztwór do ekstrakcji należy przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej.

9.2.4Numer:Ponumerowane pozycje każdej mikrostudzienki, a wszystkie wzorce i próbki należy analizować w dwóch powtórzeniach.Zanotuj pozycje wzorców i próbek.

9.2.5Rozcieńczenie stężonego roztworu przeciwciał: rozcieńczyć stężony roztwór enzymu rozcieńczalnikami koniugatu enzymu w stosunku objętościowym 1:10 (1-krotny stężony roztwór enzymu: 10-krotny rozcieńczalnik koniugatu enzymu).

9.2.6Dodać roztwór wzorcowy/próbkę i roztwór koniugatu enzymu: dodać 50 µl roztworu wzorcowego lub przygotowanej próbki do odpowiednich dołków, dodać 50 µl roztworu koniugatu enzymu.Delikatnie wymieszać poprzez ręczne potrząsanie płytką i inkubować przez 30 min w 25℃ pod przykryciem.

9.2.7Myć się: Delikatnie zdejmij pokrywę i wylej płyn z dołków i przepłucz mikrodołki 250 µl rozcieńczonego roztworu do płukania (rozwiązanie6) w odstępie 10s przez 4-5 razy.Zaabsorbuj pozostałą wodę papierem chłonnym (pozostałe pęcherzyki powietrza można usunąć nieużywaną końcówką).

9.2.8Ubarwienie: Dodać 50 µl roztworu substratu A i 50 µl roztworu substratu B do każdego dołka.Delikatnie wymieszać, ręcznie kołysząc płytką i inkubować przez 15 minut w temperaturze 25℃ pod przykryciem (patrz 12.8).

9.2.11Mierzyć: Dodać 50 µl roztworu zatrzymującego reakcję do każdego dołka.Delikatnie wymieszaj, kołysząc płytką ręcznie i zmierz absorbancję przy 450 nm (Zasugerowano pomiar przy podwójnej długości fali 450/630 nm. Odczytaj wynik w ciągu 5 minut po dodaniu roztworu zatrzymującego).

10 Wyniki

10.1Absorpcja procentowa

Średnie wartości absorbancji otrzymane dla wzorców i próbek dzieli się przez wartość absorbancji pierwszego wzorca (standard zerowy) i mnoży przez 100%.Standard zerowy jest zatem równy 100%, a wartości absorbancji są podawane w procentach.

=

B — — wzorzec absorbancji (lub próbka)

B0 ——wzorzec zerowej absorpcji

10.2Krzywa standardowa

----Aby narysować krzywą wzorcową: Przyjmij wartość absorbancji wzorców jako oś y, półlogarytmiczną ze stężenia roztworu wzorcowego AOZ (ppb) jako oś x.

---- Stężenie AOZ każdej próbki (ppb), które można odczytać z krzywej kalibracji, mnoży się przez odpowiedni współczynnik rozcieńczenia każdej próbki i uzyskuje się rzeczywiste stężenie próbki.

Proszę zauważyć:

Do wszystkich redukcji danych opracowano specjalne oprogramowanie, które może być dostarczone na żądanie.

Współczynnik rozcieńczenia………………………………………..……2

10.Czułość, dokładność i precyzja

Wrażliwość: 0,025 ppb

Granica wykrywalności:

Tkanka (mięśnie, wątroba)…………………………0,1 ppb

Miód------------------------------------------------- -0,1ppb

Precyzja:

Tkanka zwierzęca (mięśnie i wątroba)…………………100±20%

Miód…………………….. 100±20%

Precyzja:CV zestawu ELISA jest mniejsze niż 10%.

11.Zauważyć

12.1 Średnie wartości absorbancji otrzymane dla wzorców i próbek zostaną zmniejszone, jeśli odczynniki i próbki nie zostaną doprowadzone do temperatury pokojowej (20-25℃).

12.2 Nie dopuścić do wyschnięcia mikrostudzienek między kolejnymi etapami, aby uniknąć nieudanej odtwarzalności, i przejść do następnego etapu natychmiast po dotknięciu uchwytu mikrostudzienek.

12.3 Delikatnie wstrząsnąć każdym odczynnikiem przed użyciem.

12.4 Trzymaj skórę z dala od roztworu zatrzymującego, ponieważ jest to 0,5 MHz2SO4rozwiązanie.

12.5 Nie używaj przeterminowanych zestawów.Nie wymieniaj odczynników z różnych partii, bo spowoduje to spadek czułości.

12.6 Warunki przechowywania: Przechowywać zestawy ELISA w temperaturze 2-8 ℃, nie zamrażać.Uszczelnij pozostałe płytki z mikrostudzienkami. Unikaj bezpośredniego światła słonecznego podczas wszystkich inkubacji.Zaleca się przykrywanie płytek do mikromiareczkowania.

12.7 Roztwór podłoża należy porzucić, jeśli zmieni kolor.Odczynniki mogą ulec zepsuciu, jeśli wartość absorbancji (450/630nm) wzorca zerowego jest mniejsza niż 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Reakcja barwienia trwa 15 minut po dodaniu roztworu substratu;Możesz wydłużyć czas inkubacji do 20 minut lub więcej, jeśli kolor jest zbyt jasny, aby można go było określić. Nigdy nie przekraczaj 25 minut. Wręcz przeciwnie, odpowiednio skróć czas inkubacji.

12.9 Optymalna temperatura reakcji wynosi 25℃.Wyższa lub niższa temperatura spowoduje zmianę wartości czułości i absorbancji.

12.Warunki przechowywania i okres przechowywania

Warunki przechowywania: 2-8 ℃.

Okres przechowywania: 12 miesięcy.

 

 


  • Poprzedni:
  • Następny:

  • Wpisz tutaj swoją wiadomość i wyślij ją do nas

    Produkty powiązane