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1. 1.Fundo

Nitrofuranos são antibióticos sintéticos de amplo espectro, frequentemente empregados na produção animal por suas excelentes propriedades antibacterianas e farmacocinéticas.Eles também foram usados ​​como promotores de crescimento em suínos, aves e produção aquática.Em estudos de longo prazo com animais de laboratório indicaram que as drogas originais e seus metabólitos apresentavam características cancerígenas e mutagênicas.Isso levou à proibição de nitrofuranos para o tratamento de animais utilizados na produção de alimentos.As drogas nitrofurânicas furaltadona, nitrofurantoína e nitrofurazona foram banidas do uso na produção de alimentos para animais na UE em 1993, e o uso de furazolidona foi proibido em 1995.

A análise de resíduos de medicamentos nitrofuranos precisa ser baseada na detecção dos metabólitos ligados ao tecido dos medicamentos originais nitrofuranos.Uma vez que os medicamentos originais são metabolizados muito rapidamente e os metabólitos de nitrofurano ligados ao tecido serão retidos por muito tempo, esses metabólitos são usados ​​como alvo na detecção do abuso de nitrofuranos, que incluem o metabólito Furazolidona (AOZ), o metabólito Furaltadona (AMOZ ), metabolito de nitrofurantoína (AHD) e metabolito de nitrofurazona (SEM).

Os resíduos AOZ são determinados mais comumente por LC-MS ou LC-MS/MS.Os imunoensaios enzimáticos, comparados aos métodos cromatográficos, apresentam vantagens consideráveis ​​quanto à sensibilidade, limite de detecção, equipamento técnico e tempo requerido.(Custo de tempo: 45min)

1. 2.Princípio de teste

Este kit ELISA é projetado para detectar AOZ com base no princípio de imunoensaio de enzima competitiva indireta.Os poços de microtitulação são revestidos com antígeno ligado a BSA de captura.AOZ na amostra compete com o antígeno revestido na placa de microtitulação pelo anticorpo adicionado.Após a adição do conjugado enzimático, o substrato cromogênico é usado e o sinal é medido por um espectrofotômetro.A absorção é inversamente proporcional à concentração de AOZ na amostra.

1. 3.Formulários

Este kit pode ser usado em análises quantitativas e qualitativas de resíduos AOZ emtecidos de anima(músculo, fígado etc), mel.

1. 4.reações cruzadas

Metabolito de furazolidona (AOZ)……………………..100%

Metabolito de furaltadona (AMOZ)……………………<0,1%

Metabolito de nitrofurantoína (AHD)……………………<0,1%

Metabólito de nitrofurazona (SEM)……………………<0,1%

Furazolidona…………………………………….…..…16,3%

Furaltadona………………………………………….…<1%

Nitrofurantoína…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazona………………………………………..…<1%

1. 5.Materiais requisitados

5.1Equipamentos

----Espectrofotômetro de placa de microtitulação (450nm/630nm)

----Evaporador rotativo ou instrumentos de secagem de nitrogênio

---- Homogeneizador/estomagador

----Shaker

----Misturador de vórtice

---- Centrifuga

----Balanço analítico (indutância: 0,01g)

---- Pipeta graduada: 10ml

---- Bulbo de pipeta de borracha

----Frasco volumétrico: 100ml

---- Frasco de vidro: 10ml

----Tubo de centrífuga de poliestireno: 2ml, 50ml

----Micropipetas: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

multipipeta 250ul

5.2Reagentes

---- Acetato de etila (AR)

----n-hexano (ou n-heptano) (AR)

---- Hidrogenofosfato dipotássico tri-hidratado

(K₂HPO₄.3H₂REMO)

---- Ácido clorídrico concentrado (HCl, AR)

-----Metanol

---- Hidróxido de sódio (NaOH, AR)

----Água desionizada

1. 6.Componentes do kit

l Placa de microtitulação revestida com antígeno, 96 poços

l Soluções padrão (6 frascos, 1ml/frasco)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Controle padrão de adição: (1ml/frasco)....….100ppb

l Conjugado enzimático concentrado 1ml...…..tampa vermelha

l Diluentes de conjugado enzimático 10ml………..tampa verde

l Substrato A 7ml………..............…....…..…..tampa branca

l Substrato B 7ml………..............…........….…..tampa vermelha

l Solução Stop 7ml……………………………tampa amarela

l 20×solução de lavagem concentrada 40ml

…………………………………….……tampa transparente

l 2×solução de extração concentrada 60ml….tampa azul

l 2-Nitrobenzaldeído 15,1mg………………tampa branca

1. 7.Preparação de Reagentes

Solução 1: reagente derivado:

Adicione 10ml de metanol ao frasco com 2-Nitrobenzaldeído e dissolva.(na concentração de 10mM).

Solução 2: 0,1MK₂HPO₄solução:

Pesar 22,8g K₂HPO₄.3H₂O a 1L de água deionizada para dissolver.

Solução 3: solução de HCl 1M

Dissolva 8,3 ml de ácido clorídrico concentrado com água deionizada para 100ml.

Solução 4:Solução de NaOH 1M

Dissolva 4g de NaOH com 100ml de água deionizada.

Solução 5: solução de extração:

Dilua a solução de extração concentrada 2× com água deionizada na proporção de volume de 1:1.Esta solução pode ser conservada por 1 mês a 4℃, que será usada para extrair as amostras.

Solução 6: solução de lavagem:

Diluir a solução de lavagem concentrada 20× com água deionizada na proporção de volume de 1:19, que será utilizada para lavar as placas.Esta solução diluída pode ser conservada por 1 mês a 4℃.

1. 8.Preparações de amostras

8.1Aviso e precauções antes da operação:

a) Use pontas únicas no experimento e troque as pontas ao absorver reagente diferente.

b) Certifique-se de que todos os instrumentos experimentais estejam limpos.

c) o reagente derivado pode ser conservado a 2-8 ℃ por três meses;

d) A solução de HCl pode ser conservada em temperatura ambiente por 3 meses;

e) A solução de NaOH pode ser conservada por 3 meses em temperatura ambiente;

f) Mantenha amostras não tratadas em congelamento (-20℃);

g) As amostras tratadas podem ser conservadas por 24 horas a 2-8 ℃ no escuro.

8.2 Tecido animal e amostras de fígado:

----Homogeneize as amostras com homogeneizador;

----Pesar 1,0±0,05g da amostra de tecido homogeneizado em tubo de centrífuga de poliestireno de 50ml.Adicione 4ml de água desionizada, 0,5ml de solução de HCl 1M e 100ul de reagente derivado (ver solução 1).Agite por 2min.

---- Incubar a 37 ℃ durante a noite (cerca de 16h);

---- Adicione 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solução2), 0,4 ml de NaOH 1M (solução4) e 5 ml de acetato de etilo.Agite vigorosamente por 30s;

---- Centrifugue em temperatura ambiente (20-25℃) por 10min, pelo menos 3000g;

---- Pegue 2,5ml da fase orgânica sobrenadante em um tubo de vidro limpo de 10ml, seque com gás nitrogênio a 50-60℃ ou evaporador rotativo;

---- Dissolva a sobra seca com 1ml de n-hexano (ou n-heptano), vórtex por 30s, adicione 1ml de solução de extração (solução5), vortex 1min, misture completamente.

---- Centrifugar à temperatura ambiente (20-25^oC) por 5min, no mínimo 3000g;

---- Remover a fase orgânica sobrenadante;tomar 50μl da fase aquosa do substrato para ensaio.

8.4 Mel

----pesar 1,0±0,05g da amostra de mel homogeneizada em um tubo de centrífuga de poliestireno de 50ml;

----Adicionar 4ml de água deionizada, 0,5ml 1M HCl (solução3) e 100μl de reagente derivado (solução1);agitar completamente por 2min;

----Incubar a 37℃ durante a noite (cerca de 16h);

----Adicione 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solução2), 0,4 ml de NaOH 1M (solução4) e 5ml de acetato de etila, agitar vigorosamente por 30s;

----Centrifugue em temperatura ambiente (20-25℃) por 10min, pelo menos 3000g;

----Coloque 2,5ml da fase orgânica sobrenadante em um tubo de vidro limpo de 10ml, seque com gás nitrogênio a 50-60℃ ou evaporador rotativo;

---- Dissolver a sobra seca com 1ml de n-hexano (ou n-heptano), vórtex por 30s, adicionar 1ml de solução de extração (solução5), vortex 1min, misture completamente.

----Centrifugar à temperatura ambiente (20-25^oC) por 10min, no mínimo 3000g;

----Remover a fase orgânica sobrenadante;tomar 50μl da fase aquosa do substrato para ensaio.

1. 9.processo de ensaio

9.1Aviso antes do ensaio

9.1.1 Certifique-se de que todos os reagentes e micropoços estejam à temperatura ambiente (20-25℃).

9.1.2 Devolva todos os demais reagentes a 2-8℃ imediatamente após o uso.

9.1.3 A lavagem correta dos micropoços é uma etapa importante no processo de ensaio;é o fator vital para a reprodutibilidade da análise ELISA.

9.1.4 Evite a luz e cubra os micropoços durante a incubação.

9.2 Etapas do ensaio

9.2.1 Retire todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25 ℃) por mais de 30 minutos, homogeneize antes de usar.

9.2.2 Retire os micropoços necessários e retorne o restante para o saco zip-lock a 2-8℃ imediatamente.

9.2.3 A solução de lavagem concentrada e a solução de extração concentrada devem ser reaquecidas à temperatura ambiente antes do uso.

9.2.4Número:Cada posição do micropoço numerada e todos os padrões e amostras devem ser executados em duplicado.Registre as posições dos padrões e amostras.

9.2.5Diluição da solução concentrada de anticorpo: diluir a solução enzimática concentrada com diluentes conjugados enzimáticos na proporção de volume de 1:10 (1 vez solução enzimática concentrada: 10 vezes diluentes conjugados enzimáticos).

9.2.6Adicionar solução padrão/amostra e solução de conjugado enzimático: adicionar 50µl de solução padrão ou amostra preparada aos poços correspondentes, adicionar 50µl de solução de conjugado enzimático.Misture suavemente agitando a placa manualmente e incube por 30 minutos a 25 ℃ com tampa.

9.2.7Lavagem: Remova a tampa com cuidado e despeje o líquido dos poços e enxágue os micropoços com 250 µl de solução de lavagem diluída (solução6) em intervalos de 10s por 4-5 vezes.Absorver a água residual com papel absorvente (o resto da bolha de ar pode ser eliminado com ponta não utilizada).

9.2.8Coloração: Adicione 50µl de solução de substrato A e 50ul de solução de substrato B a cada poço.Misture suavemente balançando a placa manualmente e incube por 15 minutos a 25 ℃ com tampa (consulte 12.8).

9.2.11Medir: Adicionar 50 µl da solução de paragem a cada poço.Misture suavemente balançando a placa manualmente e meça a absorbância a 450 nm (sugeriu-se medir com o comprimento de onda duplo de 450/630 nm. Leia o resultado em 5 minutos após a adição da solução de parada.)

10 Resultados

10.1Absorvância percentual

Os valores médios dos valores de absorbância obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorbância do primeiro padrão (padrão zero) e multiplicados por 100%.O padrão zero é assim igualado a 100% e os valores de absorbância são expressos em porcentagens.

=

B ——padrão de absorbância (ou amostra)

B0 ——absorvância padrão zero

10.2Curva Padrão

----Para desenhar uma curva padrão: Tome o valor de absorbância dos padrões como eixo y, semi logarítmico da concentração da solução padrão AOZ (ppb) como eixo x.

----A concentração AOZ de cada amostra (ppb), que pode ser lida na curva de calibração, é multiplicada pelo fator de diluição correspondente de cada amostra seguida, e a concentração real da amostra é obtida.

Observe:

Foi desenvolvido um software especial para toda a redução de dados, que pode ser fornecido mediante solicitação.

Fator de diluição………………………………………..……2

10.Sensibilidade, exatidão e precisão

Sensibilidade: 0,025ppb

Limite de detecção:

Tecido (músculo, fígado)…………………………0,1ppb

Mel------------------------------------------------- -0,1 ppb

Precisão:

Tecido animal (músculo e fígado)…………………100±20%

Querida………………………………..………….... 100±20%

Precisão:O CV do kit ELISA é inferior a 10%.

11.Perceber

12.1 Os valores médios dos valores de absorbância obtidos para os padrões e as amostras serão reduzidos se os reagentes e amostras não forem regulados para temperatura ambiente ( 20-25 ℃).

12.2 Não permita que os micropoços sequem entre as etapas para evitar reprodutibilidade malsucedida e opere a próxima etapa imediatamente após bater no suporte de micropoços.

12.3 Agite cada reagente cuidadosamente antes de usar.

12.4 Mantenha sua pele longe da solução de parada, pois é a 0,5MH₂SO₄solução.

12.5 Não utilize os kits desatualizados.Não troque os reagentes de lotes diferentes, senão perderá a sensibilidade.

12.6 Condição de armazenamento: Mantenha os kits ELISA em 2-8℃, não congele.Sele as placas de micropoços de descanso. Evite a luz direta do sol durante todas as incubações.Recomenda-se cobrir as placas de microtitulação.

12.7 A solução de substrato deve ser abandonada se mudar de cor.Os reagentes podem se deteriorar se o valor de absorbância (450/630nm) do padrão zero for inferior a 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 A reação de coloração precisa de 15min após a adição da solução de substrato;Você pode prolongar o tempo de incubação para 20 minutos ou mais se a cor for muito clara para ser determinada. Nunca exceda 25 minutos. Pelo contrário, reduza o tempo de incubação adequadamente.

12.9 A temperatura de reação ideal é 25℃.Temperaturas mais altas ou mais baixas levarão a mudanças nos valores de sensibilidade e absorbância.

12.Condições de armazenamento e período de armazenamento

Condição de armazenamento: 2-8 ℃.

Período de armazenamento: 12 meses.