produs

1. 1.fundal

Nitrofuranii sunt antibiotice sintetice cu spectru larg, care sunt frecvent utilizate în producția animală pentru proprietățile sale antibacteriene și farmacocinetice excelente.Au fost, de asemenea, folosiți ca promotori de creștere în producția de porci, păsări și acvatice.În studiile pe termen lung cu animale de laborator au indicat că medicamentele părinte și metaboliții lor au prezentat caracteristici cancerigene și mutagene.Acest lucru a condus la interzicerea nitrofuranilor pentru tratamentul animalelor utilizate pentru producția de alimente.Medicamentele cu nitrofuran furaltadonă, nitrofurantoină și nitrofurazonă au fost interzise în producția alimentară a animalelor în UE în 1993, iar utilizarea furazolidonei a fost interzisă în 1995.

Analiza reziduurilor de medicamente cu nitrofuran trebuie să se bazeze pe detectarea metaboliților legați de țesut ai medicamentelor de bază cu nitrofuran.Deoarece medicamentele părinte sunt metabolizate foarte rapid, iar metaboliții nitrofuran legați de țesut se vor păstra pentru o lungă perioadă de timp, acești metaboliți sunt utilizați ca țintă în detectarea abuzului de nitrofurani, care includ metabolitul furazolidonă (AOZ), metabolitul furaltadonă (AMOZ). ), metabolitul de nitrofurantoină (AHD) și metabolitul de nitrofurazonă (SEM).

Reziduurile AOZ sunt determinate cel mai frecvent prin LC-MS sau LC-MS/MS.Imunotestele enzimatice, comparativ cu metodele cromatografice, prezintă avantaje considerabile în ceea ce privește sensibilitatea, limita de detecție, echipamentul tehnic și necesarul de timp.(Cost timp: 45 min)

1. 2.Principiul testului

Acest kit ELISA este conceput pentru a detecta AOZ pe baza principiului imunotestului enzimatic competitiv indirect.Godeurile de microtitrare sunt acoperite cu antigen de captare legat de BSA.AOZ din probă concurează cu antigenul acoperit pe placa de microtitrare pentru anticorpul adăugat.După adăugarea conjugatului enzimatic, se folosește substratul cromogen și semnalul este măsurat cu un spectrofotometru.Absorbția este invers proporțională cu concentrația AOZ din probă.

1. 3.Aplicații

Acest kit poate fi utilizat în analiza cantitativă și calitativă a reziduurilor de AOZ înțesuturi de anima(mușchi, ficat etc), miere.

1. 4.Reacții încrucișate

Metabolit de furazolidonă (AOZ)……………………..100%

Metabolit de furaltadonă (AMOZ)…………………………<0,1%

Metabolit de nitrofurantoină (AHD)…………………………<0,1%

Metabolit de nitrofurazonă (SEM)………...…<0,1%

Furazolidonă…………………………………………….…..…16,3%

Furaltadonă…………………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon……………………………………………………..…<1%

1. 5.Materiale necesare

5.1Echipamente

---- Spectrofotometru cu placă de microtitrare (450nm/630nm)

----Evaporator rotativ sau instrumente de uscare cu azot

----Omogenizator/stomac

----Agitator

---- Mixer Vortex

----Centrifuga

----Balanta analitica (inductanta: 0,01 g)

----Pipeta gradata: 10ml

----Bec pipetă din cauciuc

----Balon cotat: 100ml

----Balon de sticlă: 10ml

----Tub centrifuga din polistiren: 2ml, 50ml

----Micropipete: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multippette

5.2Reactivi

----Acetat de etil (AR)

----n-hexan (sau n-heptan) (AR)

----Dipotasiu hidrogenofosfat trihidrat

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Acid clorhidric concentrat (HCI, AR)

-----Metanol

---- Hidroxid de sodiu (NaOH, AR)

----Apă deionizată

1. 6.Componente kit

l Placă de microtitrare acoperită cu antigen, 96 godeuri

l Soluții standard (6 sticle, 1 ml/sticlă)

0 ppb, 0,025 ppb, 0,075 ppb, 0,225 ppb, 0,675 ppb, 2,025 ppb

l Control standard de împingere: (1 ml/sticlă)....….100 ppb

l Conjugat enzimatic concentrat 1ml……..cap roșu

l Diluanți conjugați enzimatici 10 ml………..capac verde

l Substrat A 7ml………..............…....…..…..capac alb

l Substrat B 7ml………..............…........….…..capac roșu

l Soluție stop 7ml…………………………… capac galben

l 20×soluție de spălare concentrată 40ml

……………………………………………….……capac transparent

l 2×soluție de extracție concentrată 60ml….capac albastru

l 2-Nitrobenzaldehidă 15,1 mg……cap alb

1. 7.Prepararea Reactivilor

Soluţie 1: reactiv derivat:

Se adaugă 10 ml de metanol în sticla cu 2-Nitrobenzaldehidă și se dizolvă.(la concentrația de 10mM).

Soluţie 2: 0,1 MK₂HPO₄soluţie:

Cântărește 22,8 g K₂HPO₄.3H₂O la 1L de apă deionizată pentru a se dizolva.

Soluţie 3: soluție de HCI 1M

Se dizolvă 8,3 ml acid clorhidric concentrat cu apă deionizată până la 100 ml.

Soluția 4:soluție de NaOH 1M

Se dizolvă 4 g NaOH cu 100 ml apă deionizată.

Soluția 5: soluție de extracție:

Se diluează 2 x soluție de extracție concentrată cu apă deionizată în raport de volum de 1:1.Această soluție poate fi conservată timp de 1 lună la 4℃, care va fi folosită pentru extragerea probelor.

Soluţie 6: solutie de spalare:

Se diluează soluția de spălare concentrată de 20 x cu apă deionizată în raportul de volum de 1:19, care va fi folosit pentru spălarea plăcilor.Această soluție diluată poate fi conservată timp de 1 lună la 4℃.

1. 8.Prepararea probelor

8.1Notă și precauții înainte de operare:

a) Vă rugăm să utilizați vârfuri unice în experiment și să schimbați vârfurile atunci când absorbiți reactiv diferit.

b) Asigurați-vă că toate instrumentele experimentale sunt curate.

c) reactivul derivat poate fi conservat la 2-8℃ timp de trei luni;

d) Soluția de HCl poate fi conservată la temperatura camerei timp de 3 luni;

e) Soluția de NaOH poate fi conservată timp de 3 luni la temperatura camerei;

f) Păstrați probele netratate în congelare (-20℃);

g) Probele tratate pot fi conservate timp de 24 de ore la 2-8℃ în întuneric.

8.2 Probele de țesut animal și ficat:

----Omogenizarea probelor cu omogenizator;

---- Greutate 1,0 ± 0,05 g din proba de țesut omogenizat într-un tub de centrifugă din polistiren de 50 ml.Se adaugă 4 ml apă deionizată, 0,5 ml soluție de HCI 1 M și 100 ul de reactiv derivat (vezi soluția 1).Agitați-l timp de 2 minute.

---- Incubați la 37℃ peste noapte (aproximativ 16 ore);

---- Adăugați 5 ml 0,1 MK₂HPO₄ (soluţie2), 0,4 ml NaOH 1M (soluţie4) și 5 ml acetat de etil.Agitați puternic timp de 30 de secunde;

---- Centrifugați la temperatura camerei (20-25℃) timp de 10min, cel puțin 3000g;

---- Luați 2,5 ml din faza organică supernatantă într-un tub de sticlă curat de 10 ml, uscați cu azot gazos la 50-60℃ sau evaporator rotativ;

---- Dizolvați resturile uscate cu 1 ml de n-hexan (sau n-heptan), agitați timp de 30 de secunde, adăugați 1 ml de soluție de extracție (soluţie5), agitați 1 minut, amestecați complet.

---- Se centrifuga la temperatura camerei (20-25^oC) timp de 5min, minim 3000g;

---- Se îndepărtează faza organică supernatantă;luați 50μl din faza de apă a substratului pentru analiză.

8.4 Miere

---- se cântăresc 1,0±0,05 g din proba omogenizată de miere într-un tub de centrifugă de polistiren de 50 ml;

----Adăugați 4 ml apă deionizată, 0,5 ml 1M HCI (soluţie3) și 100μl reactiv derivat (soluţie1);se agită complet timp de 2 minute;

----Incubați la 37℃ peste noapte (aproximativ 16 ore);

----Adăugați 5ml 0.1MK₂HPO₄ (soluţie2), 0,4 ml NaOH 1M (soluţie4) și 5 ml acetat de etil, se agită puternic timp de 30 de secunde;

----Centrifugați la temperatura camerei (20-25℃) timp de 10min, cel puțin 3000g;

---- Luați 2,5 ml din faza organică supernatantă într-un tub de sticlă curat de 10 ml, uscat cu azot gazos la 50-60℃ sau evaporator rotativ;

---- Dizolvați resturile uscate cu 1 ml n-hexan (sau n-heptan), agitați timp de 30 de secunde, adăugați 1 ml soluție de extracție (soluţie5), agitați 1 minut, amestecați complet.

----Centrifugați la temperatura camerei (20-25^oC) timp de 10min, minim 3000g;

----Se îndepărtează faza organică supernatantă;luați 50μl din faza de apă a substratului pentru analiză.

1. 9.Procesul de testare

9.1Observați înainte de analiză

9.1.1 Asigurați-vă că toți reactivii și microgodeurile sunt toate la temperatura camerei (20-25℃).

9.1.2 Readuceți toți restul reactivilor la 2-8℃ imediat după utilizare.

9.1.3 Spălarea corectă a microgodeurilor este un pas important în procesul de analiză;este factorul vital pentru reproductibilitatea analizei ELISA.

9.1.4 Evitați lumina și acoperiți microgodeurile în timpul incubației.

9.2 Etape de testare

9.2.1 Scoateți toți reactivii la temperatura camerei (20-25℃) pentru mai mult de 30 de minute, omogenizați înainte de utilizare.

9.2.2 Scoateți microgodeurile necesare și returnați restul în punga cu fermoar la 2-8℃ imediat.

9.2.3 Soluția de spălare concentrată și soluția de extracție concentrată trebuie reîncălzite pentru a fi la temperatura camerei înainte de utilizare.

9.2.4Număr:Numerotate fiecare poziție de microgodeuri și toate standardele și probele trebuie să fie executate în dublu exemplar.Înregistrați standardele și pozițiile mostrelor.

9.2.5Diluarea soluției concentrate de anticorpi: diluați soluția de enzimă concentrată cu diluanți de conjugați enzimatici în raport de volum de 1:10 (soluție de enzimă concentrată de 1 ori: diluanți de conjugați de enzime de 10 ori).

9.2.6Adăugați soluție standard/probă și soluție de conjugat enzimatic: adăugați 50 µl de soluție standard sau de probă preparată în godeurile corespunzătoare, adăugați 50 µl de soluție de conjugat enzimatic.Se amestecă ușor agitând placa manual și se incubează timp de 30 de minute la 25℃ cu capac.

9.2.7Spalare: Scoateți capacul ușor și turnați lichidul din godeuri și clătiți microgodeurile cu 250 µl soluție de spălare diluată (soluţie6) la interval de 10s de 4-5 ori.Se absoarbe apa reziduală cu hârtie absorbantă (bulla de aer rămasă poate fi eliminată cu vârful nefolosit).

9.2.8Colorare: Adăugați 50 µl soluție de substrat A și 50 µl soluție de substrat B în fiecare godeu.Se amestecă ușor, balansând manual placa și se incubează timp de 15 minute la 25℃ cu capac (vezi 12.8).

9.2.11Măsura: Adăugați 50 µl de soluție stop în fiecare godeu.Amestecați ușor, balansând manual placa și măsurați absorbanța la 450 nm (a sugerat măsurarea cu lungimea de undă dublă de 450/630 nm. Citiți rezultatul în 5 minute după adăugarea soluției de oprire. )

10 Rezultate

10.1Absorbanță procentuală

Valorile medii ale valorilor absorbanței obținute pentru standarde și probe se împart la valoarea absorbanței primului standard (standard zero) și se înmulțesc cu 100%.Standardul zero se face astfel egal cu 100% iar valorile absorbanței sunt exprimate în procente.

=

B ——standard de absorbție (sau eșantion)

B0 ——absorbanță zero standard

10.2Curba standard

----Pentru a desena o curbă standard: Luați valoarea absorbanței standardelor ca axa y, semi-logaritmică a concentrației soluției standard AOZ (ppb) ca axa x.

----Concentrația AOZ a fiecărei probe (ppb), care poate fi citită din curba de calibrare, este înmulțită cu factorul de diluție corespunzător al fiecărei probe urmărite și se obține concentrația reală a probei.

Vă rugăm să observați:

A fost dezvoltat un software special pentru toate reducerea datelor, care poate fi furnizat la cerere.

Factorul de diluție………………………………………..……2

10.Sensibilitate, acuratețe și precizie

Sensibilitate: 0,025 ppb

Limita detectiei:

Țesut (mușchi, ficat)………………………… 0,1 ppb

Miere------------------------------------------------- -0,1 ppb

Precizie:

Țesut animal (mușchi și ficat)…………………100±20%

Miere………………………………………..………….... 100±20%

Precizie:CV-ul trusei ELISA este mai mic de 10%.

11.Înștiințare

12.1 Valorile medii ale valorilor absorbantei obtinute pentru standarde si probe vor fi reduse daca reactivii si probele nu au fost reglate la temperatura camerei (20-25℃).

12.2 Nu lăsați microgodeurile să se usuce între pași pentru a evita reproductibilitatea nereușită și operați pasul următor imediat după atingerea suportului pentru microgodeuri.

12.3 Agitați ușor fiecare reactiv înainte de utilizare.

12.4 Țineți-vă pielea departe de soluția stop, deoarece este 0,5MH₂SO₄soluţie.

12.5 Nu utilizați kiturile învechite.Nu schimbați reactivii din diferite loturi, altfel va scădea sensibilitatea.

12.6 Condiții de depozitare: Păstrați kiturile ELISA la 2-8℃, nu le înghețați.Sigilați plăcile de microgodeuri în repaus, evitați lumina directă a soarelui în timpul tuturor incubațiilor.Se recomandă acoperirea plăcilor de microtitrare.

12.7 Soluția de substrat trebuie abandonată dacă își schimbă culoarea.Reactivii pot fi deteriorați dacă valoarea absorbanței (450/630nm) a standardului zero este mai mică de 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Reacția de colorare necesită 15 min după adăugarea soluției de substrat;Puteți prelungi timpul de incubare la 20 min sau mai mult dacă culoarea este prea deschisă pentru a fi determinată., nu depășiți niciodată 25 min. Dimpotrivă, scurtați timpul de incubare în mod corespunzător.

12.9 Temperatura optimă de reacție este de 25℃.Temperatura mai mare sau mai scăzută va duce la modificări ale valorilor de sensibilitate și absorbanță.

12.Starea de depozitare și perioada de depozitare

Condiții de depozitare: 2-8℃.

Perioada de depozitare: 12 luni.