پيداوار

1. 1.پس منظر

Nitrofurans مصنوعي وسيع اسپيڪٽرم اينٽي بايوٽيڪٽس آهن، جيڪي گهڻو ڪري جانورن جي پيداوار ۾ ان جي بهترين اينٽي بيڪٽيريل ۽ دواسازي جي ملڪيت لاء استعمال ڪيا ويا آهن.انهن کي سور، پولٽري ۽ آبي پيداوار ۾ ترقي جي فروغ جي طور تي پڻ استعمال ڪيو ويو آهي.ليبارٽري جانورن سان گڏ ڊگھي مدت جي مطالعي ۾ اشارو ڪيو ويو آهي ته والدين منشيات ۽ انهن جي ميٽابولائٽس ڪارڪينجينڪ ۽ ميوٽيجنڪ خاصيتون ڏيکاريا آهن.انهي جي نتيجي ۾ کاڌي جي پيداوار لاء استعمال ٿيندڙ جانورن جي علاج لاء نائٽروفورنس جي منع ڪئي وئي آهي.نائٽروفوران دوائون furaltadone، nitrofurantoin ۽ nitrofurazone 1993 ۾ EU ۾ کاڌي جي جانورن جي پيداوار ۾ استعمال ڪرڻ کان منع ڪئي وئي، ۽ 1995 ۾ furazolidone جو استعمال منع ڪيو ويو.

nitrofuran منشيات جي باقيات جو تجزيو نائيٽروفورن جي والدين جي دوائن جي ٽشو پابند ميٽابولائٽس جي ڳولا تي ٻڌل هجڻ جي ضرورت آهي.جيئن ته والدين جون دوائون تمام تيزيءَ سان ميٽابولائيز ٿي وينديون آهن، ۽ ٽشو پابند نائيٽروفورن ميٽابولائٽس گهڻي وقت تائين برقرار رهنديون آهن، اهي ميٽابولائٽس نائيٽروفرن جي غلط استعمال جي نشاندهي ۾ ٽارگيٽ طور استعمال ٿينديون آهن، جن ۾ Furazolidone metabolite (AOZ)، Furaltadone metabolite (AMOZ) شامل آهن. )، Nitrofurantoin metabolite (AHD) ۽ Nitrofurazone metabolite (SEM).

AOZ-residues سڀ کان عام طور تي LC-MS يا LC-MS/MS پاران طئي ڪيا ويا آھن.ڪروميٽوگرافڪ طريقن جي مقابلي ۾ Enzyme immunoassays، حساسيت، پتو لڳائڻ جي حد، ٽيڪنيڪل سامان ۽ وقت جي ضرورت جي حوالي سان ڪافي فائدا ڏيکاريندا آھن.(وقت جي قيمت: 45 منٽ)

1. 2.ٽيسٽ اصول

هي ELISA کٽ اڻ سڌي مقابلي واري اينزيم اموناسائي جي اصول جي بنياد تي AOZ کي ڳولڻ لاء ٺهيل آهي.مائڪروٽيٽر ويلز ڪيپچر BSA سان ڳنڍيل اينٽيجن سان گڏ ٿيل آهن.AOZ نموني ۾ شامل ڪيل اينٽي باڊي لاءِ مائڪروٽيٽر پليٽ تي ٺهيل اينٽيجن سان مقابلو ڪري ٿو.enzyme conjugate جي اضافي کان پوء، chromogenic substrate استعمال ڪيو ويندو آهي ۽ سگنل هڪ spectrophotometer سان ماپي ويندي آهي.جذب نموني ۾ AOZ ڪنسنٽريشن جي الٽي تناسب آهي.

1. 3.درخواستون

هي ڪٽ استعمال ڪري سگهجي ٿو مقداري ۽ ڪيفيت جي تجزيي ۾ AOZ جي باقيات جيanima tissues(عضل، جگر وغيره)، ماکي.

1. 4.ڪراس رد عمل

Furazolidone metabolite (AOZ)………………………..100%

Furaltadone metabolite (AMOZ)………………………<0.1%

Nitrofurantoin ميٽابولائٽ (AHD)………………………<0.1%

نائٽروفورازون ميٽابولائٽ (SEM)………………………………<0.1%

Furazolidone ……………………………………………… 16.3%

Furaltadone ……………………………………………………… 1٪

نائٽروفورنٽائن ……………………………………………………… 1٪

نائٽروفورازون ……………………………………………………… 1٪

1. 5.مواد گهربل

5.1سامان

----Microtiter پليٽ spectrophotometer (450nm/630nm)

---- روٽري evaporator يا nitrogen drying اوزار

---- هم جنس پرست

---- شاڪر

---- وورتڪس ميڪر

---- سينٽرفيوج

---- تجزياتي توازن (انڊڪٽنس: 0.01g)

---- گريجوئيٽ پائپٽ: 10ml

----ربر پائيپٽ بلب

---- Volumetric flask: 100ml

---- گلاس فلاسڪ: 10ml

----Polystyrene centrifuge ٽيوب: 2ml، 50ml

---- مائڪروپيپيٽس: 20ul-200ul، 100ul-1000ul،

250ul-multippette

5.2ريجنٽس

---- ايٿيل ايڪٽيٽ (AR)

----n-hexane (يا n-heptane) (AR)

---- ڊيپوٽاشيم هائيڊروجن فاسفٽ ٽرائي هائيڊريٽ

(K₂ايڇ پي او₄.3 ايڇ₂او) (آر)

---- مرڪوز هائڊروڪلورڪ اسيد (HCl، AR)

----- ميٿانول

---- سوڊيم هائيڊروڪسائيڊ (NaOH، AR)

---- ديونائيزڊ پاڻي

1. 6.ڪٽ اجزاء

l Microtiter پليٽ antigen سان coated، 96 ويلز

l معياري حل (6 بوتلون، 1ml / بوتل)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l اسپائڪنگ معياري ڪنٽرول: (1ml / بوتل) .......100 پي بي

l مرڪوز اينزيم ڪنجوگيٽ 1ml ....... لال ڪيپ

l Enzyme conjugate diluents 10ml………..گرين ڪيپ

l سبسٽريٽ A 7ml……………………………………….. اڇي ٽوپي

l سبسٽريٽ B 7ml ……………………………………………..ريڊ ڪيپ

l اسٽاپ حل 7ml……………………… پيلي ڪيپ

ايل 20 × مرڪوز ڌوئڻ جو حل 40ml

……………………………………… شفاف ٽوپي

l 2 × مرڪوز ڪڍڻ جو حل 60ml .... نيري ڪيپ

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………سفيد ڪيپ

1. 7.Reagents جي تياري

حل 1: derivative reagent:

بوتل ۾ 10 ملي ميٽر ميٿانول شامل ڪريو جنهن ۾ 2-Nitrobenzaldehyde ۽ حل ڪريو.(10 ايم ايم جي ڪنسنٽريشن تي).

حل 2: 0.1MK₂ايڇ پي او₄حل:

وزن 22.8g K₂ايڇ پي او₄.3 ايڇ₂O to 1L deionized پاڻي کي ٽوڙڻ لاء.

حل 3: 1M HCl حل

8.3ml مرڪوز هائڊروڪلورڪ اسيد کي ٽوڙيو deionized پاڻي سان 100ml.

حل 4:1M NaOH حل

4g NaOH کي 100ml ديونائيزڊ پاڻي سان ٽوڙيو.

حل 5: ڪڍڻ جو حل:

1:1 جي مقدار جي تناسب ۾ ڊيونائيز ٿيل پاڻي سان 2 × مرڪوز ڪڍڻ وارو حل.اهو حل 1 مهيني لاء 4 ℃ تي محفوظ ڪري سگهجي ٿو، جيڪو نموني ڪڍڻ لاء استعمال ڪيو ويندو.

حل 6: ڌوئڻ جو حل

1:19 جي مقدار جي راشن ۾ 20 × مرڪوز ڌوئڻ واري حل کي ڊيونائيزڊ پاڻي سان ملايو، جيڪو پليٽن کي ڌوئڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو.اهو حل ٿيل حل 1 مهيني لاء 4 ℃ تي محفوظ ڪري سگهجي ٿو.

1. 8.نموني تياريون

8.1آپريشن کان اڳ نوٽيس ۽ احتياط:

a) مھرباني ڪري تجربن ۾ ھڪڙي بند ٽوٽڪا استعمال ڪريو، ۽ مختلف ريجينٽ جذب ڪرڻ وقت ٽوٽڪا تبديل ڪريو.

ب) پڪ ڪريو ته سڀئي تجرباتي اوزار صاف آهن.

ج) نڪتل ريگينٽ کي 2-8 ℃ تي ٽن مهينن تائين محفوظ ڪري سگهجي ٿو؛

d) HCl حل 3 مهينن لاء ڪمري جي حرارت تي محفوظ ڪري سگهجي ٿو؛

e) NaOH حل 3 مهينن لاء ڪمري جي حرارت تي محفوظ ڪري سگهجي ٿو.

f) غير علاج ٿيل نمونن کي منجمد ۾ رکو (-20℃)؛

g) علاج ٿيل نمونا 24 ڪلاڪ لاء محفوظ ڪري سگھجن ٿا 2-8 ℃ تي اونداهي ۾.

8.2 جانورن جي ٽشو ۽ جگر جا نمونا:

---- نموني کي homogenizer سان homogenize؛

---- وزن 1.0±0.05g homogenized ٽشو نموني جو 50ml polystyrene centrifuge tube ۾.شامل ڪريو 4ml deionized پاڻي، 0.5ml 1M HCl حل ۽ 100ul derivative reagent (ڏسو حل 1).ان کي 2 منٽ لاء ڇڪيو.

---- رات جو 37 ℃ تي incubate (اٽڪل 16h)؛

---- شامل ڪريو 5ml 0.1MK₂ايڇ پي او₄ (حل2)، 0.4ml 1M NaOH (حل4) ۽ 5ml ethyl acetate.30s لاء زور سان ڇڪيو؛

---- 10 منٽ لاء ڪمري جي حرارت (20-25 ℃) تي سينٽرفيوج، گهٽ ۾ گهٽ 3000 گرام؛

---- 10ml صاف شيشي واري ٽيوب ۾ سپرنيٽنٽ آرگنڪ فيز جي 2.5ml وٺو، 50-60 ℃ نائٽروجن گيس يا روٽري evaporator سان خشڪ ڪريو؛

---- خشڪ بچيل کي 1ml n-hexane (يا n-heptane) سان گڏ ڪريو، 30s لاء vortex، 1ml اضافي حل شامل ڪريو (حل5)، vortex 1 منٽ، مڪمل طور تي ملايو.

---- ڪمري جي حرارت تي سينٽرفيوج (20-25^oج) 5 منٽ لاء، گهٽ ۾ گهٽ 3000 گرام؛

---- supernatant نامياتي مرحلي کي هٽايو؛50μl substrate پاڻي جي مرحلي جي assay لاء وٺي.

8.4 ماکي

---- وزن 1.0±0.05 گرام هوموجنائز ٿيل ماکي جي نموني کي 50ml پولسٽريئر سينٽريفيوج ٽيوب ۾؛

---- شامل ڪريو 4ml deionized پاڻي، 0.5ml 1M HCl (حل3) ۽ 100μl نڪتل ريجنٽ (حل1)؛2 منٽ لاء مڪمل طور تي ڇڪيو؛

---- رات جو 37 ℃ تي انبيوٽ ڪريو (اٽڪل 16h)؛

---- شامل ڪريو 5ml 0.1MK₂ايڇ پي او₄ (حل2)، 0.4ml 1M NaOH (حل4) ۽ 5ml ethyl acetate، 30s لاء سختي سان ڇڪيو؛

----Centrifuge ڪمري جي گرمي پد تي (20-25℃) 10 منٽ لاء، گهٽ ۾ گهٽ 3000g؛

----سپرنيٽنٽ آرگنڪ فيز جي 2.5ml کي 10ml صاف شيشي واري ٽيوب ۾ وٺو، 50-60 ℃ نائٽروجن گيس يا روٽري evaporator سان خشڪ ڪريو؛

---- خشڪ بچيل کي 1ml n-hexane (يا n-heptane) سان ٽوڙيو، 30s لاء vortex، 1ml اضافي حل شامل ڪريو (حل5)، vortex 1 منٽ، مڪمل طور تي ملايو.

---- ڪمري جي حرارت تي سينٽرفيوج (20-25^oج) 10 منٽ لاء، گهٽ ۾ گهٽ 3000 گرام؛

---- supernatant نامياتي مرحلي کي هٽايو؛50μl substrate پاڻي جي مرحلي جي assay لاء وٺي.

1. 9.جاچ جو عمل

9.1امتحان کان اڳ نوٽيس

9.1.1 پڪ ڪريو ته سڀئي ريجينٽ ۽ مائڪرو ويلز سڀ ڪمري جي حرارت تي آهن (20-25 ℃).

9.1.2 استعمال ڪرڻ کان پوءِ فوري طور تي 2-8℃ تائين باقي سڀئي ريجنٽس واپس ڪريو.

9.1.3 مائڪرو ويلز کي صحيح طريقي سان ڌوئڻ امتحان جي عمل ۾ هڪ اهم قدم آهي.اهو ELISA تجزيي جي ٻيهر پيداوار لاء اهم عنصر آهي.

9.1.4 روشني کان پاسو ڪريو ۽ انڪيوبيشن دوران مائڪرو ويلز کي ڍڪيو.

9.2 امتحان جا مرحلا

9.2.1 30 منٽ کان وڌيڪ ڪمري جي گرمي پد (20-25 ℃) تي سڀئي ريجنٽ ڪڍيو، استعمال ڪرڻ کان اڳ هڪجهڙائي ڪريو.

9.2.2 گھربل مائيڪرو ويلز حاصل ڪريو ۽ باقي کي فوري طور تي 2-8℃ تي زپ لاڪ ٿيلھي ۾ واپس ڪريو.

9.2.3 استعمال ڪرڻ کان اڳ ڪنسنٽريڊ واش سولوشن ۽ ڪنسنٽريٽڊ ايڪسٽريشن سلوشن کي ڪمري جي گرمي پد تي ٻيهر گرم ڪيو وڃي.

9.2.4نمبر:هر مائڪرو ويل پوزيشن کي نمبر ڏنو وڃي ۽ سڀني معيارن ۽ نمونن کي نقل ۾ هلائڻ گهرجي.معيار ۽ نمونن جي پوزيشن کي رڪارڊ ڪريو.

9.2.5مرڪوز اينٽي باڊي جو حل: 1:10 جي مقدار جي تناسب ۾ اينزائم ڪنجوگيٽ ڊيليوئنٽس سان مرڪوز اينزائم حل کي گھٽايو (1 فولڊ ڪنسنٽريڊ انزائم حل: 10 فولڊ اينزائم ڪنجوگيٽ ڊيلوئنٽس).

9.2.6معياري حل / نموني ۽ اينزيم ڪنجوگٽ حل شامل ڪريو50µl معياري حل يا تيار ڪيل نمونو ملندڙ کوهن ۾ شامل ڪريو، 50µl انزائم ڪنجوگيٽ حل شامل ڪريو.دستي طور پليٽ کي ھلائيندي ھلڪو ڪريو ۽ 30 منٽ لاءِ 25 ℃ تي ڍڪ سان گڏ ڪريو.

9.2.7ڌوئڻ: ڍڪ کي نرميءَ سان هٽايو ۽ پاڻي کوهه مان ٻاهر ڪڍو ۽ مائيڪرو ويلز کي 250µl ملائي ٿيل واش محلول سان ڌوئو (حل6) 10s جي وقفي تي 4-5 ڀيرا.رهجي ويل پاڻي کي جاذب پيپر سان جذب ڪريو (باقي ايئر بلبل کي غير استعمال ٿيل ٽپ سان ختم ڪري سگهجي ٿو).

9.2.8رنگ سازيشامل ڪريو 50µl سبسٽريٽ حل A ۽ 50µl سبسٽريٽ حل B هر کوهه ۾.پليٽ کي دستي طور تي هلڪو ڪندي نرميءَ سان ملايو ۽ 15 منٽ لاءِ 25 سينٽيگريڊ تي ڍڪيو (ڏسو 12.8).

9.2.11ماپشامل ڪريو 50µl اسٽاپ حل هر کوهه ۾.پليٽ کي دستي طور تي ھٿ سان ھلايو ۽ 450nm تي جذب کي ماپيو (ان کي 450/630nm جي ڊبل ويولٿ سان ماپ ڪرڻ جي صلاح ڏني وئي آھي. اسٽاپ حل جي اضافي کان پوء 5 منٽ اندر نتيجو پڙھو.)

10 نتيجا

10.1سيڪڙو جذب

معيار ۽ نمونن لاءِ حاصل ڪيل جاذب قدرن جا اوسط قدر پهرين معيار (صفر معيار) جي جذبي قدر سان ورهايل آهن ۽ 100٪ سان ضرب ڪيا ويا آهن.صفر معيار اهڙيءَ طرح 100٪ جي برابر ڪيو ويو آهي ۽ جذبي جا قدر فيصد ۾ بيان ڪيا ويا آهن.

=

بي --- جاذب معيار (يا نمونو)

B0 - جذب صفر معيار

10.2معياري وکر

---- معياري وکر ٺاھڻ لاءِ: معيار جي جاذب قدر کي y-axis جي طور تي وٺو، AOZ معياري حل (ppb) جي ڪنسنٽريشن جي نيم لاگارٿمڪ کي x-axis طور.

----هر نموني جي AOZ ڪنسنٽريشن (ppb)، جنهن کي پڙهي سگهجي ٿو calibration وکر مان، هر نموني جي ملندڙ جلندڙ عنصر سان ضرب ڪيو ويندو آهي، ۽ نموني جو اصل ڪنسنٽريشن حاصل ڪيو ويندو آهي.

مهرباني ڪري نوٽ ڪريو:

خاص سافٽ ويئر سڀني ڊيٽا جي گھٽتائي لاء ترقي ڪئي وئي آهي، جيڪا درخواست تي مهيا ڪري سگهجي ٿي.

گھٽائڻ وارو عنصر……………………………………………… 2

10.حساسيت، درستگي ۽ درستگي

حساسيت: 0.025 پي بي

معلوم ڪرڻ جي حد:

ٽشو (عضلات، جگر) ……………………… 0.1ppb

ماکي------------------------------------------------- -0.1 پي بي بي

درستگي:

جانورن جو بافتو (عضل ۽ جگر)……………………… 100±20%

ماکي ……………………………………………………… 100±20%

درستي:ELISA کٽ جي CV 10٪ کان گهٽ آهي.

11.نوٽيس

12.1 معيارن ۽ نمونن لاءِ حاصل ڪيل جاذب قدرن جا اوسط قدر گھٽجي ويندا جيڪڏھن ريگينٽس ۽ نمونن کي ڪمري جي حرارت (20-25 ℃) تي ضابطو نه ڪيو ويو آھي.

12.2 مائيڪرو ويلز کي مرحلن جي وچ ۾ سڪي وڃڻ جي اجازت نه ڏيو ته جيئن ٻيهر پيداوار جي ناڪامي کان بچڻ لاءِ ۽ مائڪرو ويلز هولڊر کي ٽيپ ڪرڻ کان پوءِ فوري طور تي ايندڙ قدم کي هلائڻ.

12.3 استعمال ڪرڻ کان اڳ ھر ھڪ ريگينٽ کي ھلڪو ڪريو.

12.4 پنهنجي چمڙي کي اسٽاپ حل کان پري رکو ان لاءِ 0.5MH آهي₂SO₄حل.

12.5 پراڻا ڪٽ استعمال نه ڪريو.مختلف بيچ جي ريجنٽ کي تبديل نه ڪريو، ٻي صورت ۾ اهو حساسيت کي ڇڏي ڏيندو.

12.6 اسٽوريج حالت: ELISA ڪٽس کي 2-8 ℃ تي رکو، منجمد نه ڪريو.باقي مائڪرو ويل پليٽس کي سيل ڪريو، سڀني انڪيوبيشن دوران سڌي سج جي روشني کان پاسو ڪريو.مائڪروٽيٽر پليٽ کي ڍڪڻ جي سفارش ڪئي وئي آهي.

12.7 Substrate حل کي ڇڏي ڏنو وڃي جيڪڏھن اھو رنگ بدلجي وڃي.ريجينٽ خراب ٿي سگھي ٿو جيڪڏھن جذبي قدر (450/630nm) صفر معيار جي 0.5 (A450nm<0.5) کان گھٽ آھي.

12.8 رنگ جي رد عمل جي ضرورت آهي 15 منٽ کان پوء substrate حل شامل ڪرڻ کان پوء؛توھان انڪيوبيشن جي وقت کي 20 منٽ يا ان کان وڌيڪ ڊگھو ڪري سگھو ٿا جيڪڏھن رنگ ايترو ھلڪو آھي جو اندازو لڳايو وڃي، ڪڏھن به 25 منٽ کان وڌيڪ نه ٿيو. ان جي برعڪس، انڪيوبيشن جو وقت صحيح طرح گھٽايو.

12.9 بهترين ردعمل جي درجه حرارت 25 ℃ آهي.اعلي يا گهٽ درجه حرارت حساسيت ۽ جذباتي قدرن جي تبديلين کي ڏسندي.

12.اسٽوريج جي حالت ۽ اسٽوريج جي مدت

اسٽوريج حالت: 2-8 ℃.

اسٽوريج جي مدت: 12 مهينا.