oloa

1. 1.Talaaga

Nitrofurans o vailaʻau faʻamaʻi faʻamaʻi lautele, lea e masani ona faʻaaogaina i le gaosiga o manu mo ana mea faʻamaʻi faʻamaʻi ma pharmacokinetic lelei.Sa fa'aaogaina fo'i e fa'atupu le tuputupu a'e i pua'a, moa ma le vai.I suʻesuʻega umi ma manu faʻataʻitaʻi na faʻaalia ai o fualaau a matua ma a latou metabolites na faʻaalia ai uiga oona ma mutagenic.O lenei mea ua mafua ai le faʻasaina o nitrofurans mo togafitiga o manu e faʻaaogaina mo le gaosiga o meaʻai.O vailaʻau nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin ma le nitrofurazone na faʻasaina mai le faʻaaogaina i le gaosiga o manu i le EU i le 1993, ma le faʻaaogaina o le furazolidone na faʻasaina i le 1995.

Ole su'esu'ega ole toega ole nitrofuran e mana'omia ona fa'avae ile su'esu'eina ole tino e fusifusia metabolites ole nitrofuran matua.Talu ai o fualaau a matua e vave tele ona faʻafefeteina, ma o le a tumau pea le nitrofuran metabolites o loʻo fusifusia mo se taimi umi, o nei metabolites e faʻaaogaina e fai ma faʻamoemoega i le suʻesuʻeina o le faʻaleagaina o nitrofurans, lea e aofia ai Furazolidone metabolite (AOZ), Furaltadone metabolite (AMOZ). ), Nitrofurantoin metabolite (AHD) ma Nitrofurazone metabolite (SEM).

AOZ-toega o loʻo faʻamoemoeina sili ona masani e LC-MS poʻo LC-MS/MS.Enzyme immunoassays, fa'atusatusa i metotia chromatographic, o lo'o fa'aalia ai le tele o mea lelei e fa'atatau i le ma'ale'ale, tapula'a e iloa ai, meafaigaluega fa'apitoa ma taimi mana'omia.(Taimi tau: 45min)

1. 2.Mataupu Faavae o le Su'ega

O lenei pusa ELISA ua mamanuina e suʻe ai le AOZ e faʻavae i luga o le faʻavae o le enzyme immunoassay e le tuusao-tauva.O vaieli microtiter o lo'o ufiufi i le pu'eina o le BSA-linked antigen.AOZ i fa'ata'ita'iga e tauva ma le antigen ua ufiufi i luga o le microtiter plate mo le antibody fa'aopoopo.A maeʻa le faʻaopoopoina o le enzyme conjugate, e faʻaaogaina le chromogenic substrate ma fua le faailo i se spectrophotometer.O le absorption e fa'afeagai ma le fa'atonuga o le AOZ i le fa'ata'ita'iga.

1. 3.Talosaga

O lenei pusa e mafai ona faʻaaogaina i le faʻatusatusaina ma le faʻamaonia o suʻesuʻega o toega AOZ i totonumea anima(muso, ate ma isi), meli.

1. 4.Fa'asagaga fa'asagatau

Furazolidone metabolite (AOZ)……………………..100%

Furaltadone metabolite (AMOZ)……………………<0.1%

Nitrofurantoin metabolite (AHD)……………………<0.1%

Nitrofurazone metabolite (SEM)…………………………...<0.1%

Furazolidone…………………………………………………..16.3%

Furaltadone……………………………………………………<1%

Nitrofurantoin……………………………………………….…<1%

Nitrofurazone……………………………………………………..<1%

1. 5.Mea e Manaomia

5.1Meafaigaluega

----Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)

---- Rotary evaporator po'o meafaifa'agogo nitrogen

---- Fa'atasi / manava

----Sulu

----Vortex palu

----Centrifuge

----Paleni su'esu'e (inductance: 0.01g)

----Papa fa'au'u: 10ml

----Papa paipa matauila

----Volumetric fagu: 100ml

----Puki tioata: 10ml

---- Polystyrene centrifuge paipa: 2ml, 50ml

----Micropipettes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Reagents

----Ethyl acetate (AR)

----n-hexane (po'o le n-heptane) (AR)

----Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Su'i sukalati (HCl, AR)

-----Methanol

----Sodium hydroxide (NaOH, AR)

----Suava fa'a'ona

1. 6.Vaega Vaega

l Microtiter ipu ua ufiufi i antigen, 96 vaieli

l fofo masani(6 fagu,1ml/fagu)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l fa'atonuga masani: (1ml/fagu)........100ppb

l Concentrated enzyme conjugate 1ml...........pulou mumu

l Enzyme conjugate diluent 10ml...........pulou lanumeamata

l Fa'amea A 7ml……………………………………………………..pulou paepae

l Su'ega B 7ml…………………………………………..pulou mumu

l Taofi le vaifofo 7ml…………………………………………kafi samasama

l 20×fa'ato'a fufulu vaifofo 40ml

……………………………………………..pulou manino

l 2 × fa'ato'a fa'aputu vaifofo 60ml....pulou lanumoana

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg……………… pulou paepae

1. 7.Sauniuniga Reagents

Fofo 1: fa'afofoga fa'atupuina:

Faaopopo le 10ml o le methanol i le fagu o loʻo i ai le 2-Nitrobenzaldehyde ma faʻamavae.(i le maualuga o le 10mM).

Fofo 2: 0.1MK₂HPO₄fofo:

Mamafa 22.8g K₂HPO₄.3H₂O i le 1L o vai fa'a'ona e fa'amavae.

Fofo 3: 1M HCl fofo

Fa'amuta le 8.3ml fa'ama'i fa'ama'i fa'atasi ai ma vai fa'a'ona i le 100ml.

Fofo 4:1M NaOH fofo

Fa'amuta le 4g ​​NaOH fa'atasi ma le 100ml vai fa'a'ona.

Fofo 5: fofo o le aveeseina:

Fa'amuta 2x vaifofo fa'amuta fa'ato'a fa'atasi ma le vai fa'asao i le fua fa'atatau ole 1:1.O lenei fofo e mafai ona faʻasaoina mo le 1 masina ile 4 ℃, lea o le a faʻaaogaina e aumai ai faʻataʻitaʻiga.

Fofo 6: vaifofo fufulu:

Fa'asusu le vaifofo fufulu 20x fa'atasi ma le vai fa'a-deionized i le fua fa'atatau o le 1:19, lea o le a fa'aaogaina e fufulu ai papatusi.E mafai ona fa'asaoina lenei fofo fa'afefete mo le 1 masina ile 4℃.

1. 8.Sauniuniga Faataitai

8.1Fa'aaliga ma puipuiga a'o le'i fa'againa:

a) Fa'amolemole fa'aaoga fautuaga e tasi i le fa'ata'ita'iga, ma sui le fautuaga pe a fa'afefe ese'ese reagent.

e) Ia mautinoa e mama uma meafaigaluega faʻataʻitaʻi.

c) e mafai ona fa'asaoina le reagent i le 2-8 ℃ mo le tolu masina;

d) Ole vaifofo ole HCl e mafai ona fa'asaoina ile vevela ole potu mo le 3 masina;

e) E mafai ona fa'asaoina le vaifofo NaOH mo le 3 masina ile vevela ole potu;

f) Taofi fa'ata'ita'iga e le'i togafitia i le 'aisa (-20 ℃);

g) Fa'ata'ita'iga togafitia e mafai ona fa'asaoina mo le 24h ile 2-8℃ ile pogisa.

8.2 Fa'ata'ita'iga o a'ano o manu ma ate:

---- Faʻatasi faʻataʻitaʻiga i le homogenizer;

----O le mamafa 1.0±0.05g o le homogenized tissue sample i 50ml polystyrene centrifuge tube.Fa'aopoopo i ai le 4ml vai fa'asao, 0.5ml 1M HCl solution ma le 100ul reagent (va'ai fofo 1).Lulu mo le 2min.

---- Incubate i le 37 ℃ i le po (pe tusa o le 16h);

---- Faaopoopo 5ml 0.1MK₂HPO₄ (fofo2), 0.4ml 1M NaOH (fofo4) ma le 5ml ethyl acetate.Lulu malosi mo le 30s;

---- Centrifuge i le vevela o le potu (20-25 ℃) mo le 10min, a itiiti mai 3000g;

---- Ave le 2.5ml o le vaega faʻalenatura supernatant i totonu o le 10ml mama tioata faʻagogo, faʻamago i le 50-60℃ kasa nitrogen poʻo rotary evaporator;

---- Fa'amama le mea'ai mago ma le 1ml n-hexane (po'o le n-heptane), vortex mo le 30s, fa'aopoopo i ai le 1ml vaifofo (fofo5), vortex 1min, faʻafefiloi atoa.

---- Centrifuge ile vevela potu (20-25^oC) mo le 5min, a itiiti mai 3000g;

---- Ave'ese le vaega fa'alenatura sili;ave 50μl o le vaega vai substrate mo suʻega.

8.4 Meli

---- mamafa le 1.0±0.05g o le faʻataʻitaʻiga meli homogenized i totonu o le 50ml polystyrene centrifuge tube;

----Faaopoopo i ai le 4ml vai fa'aonaona, 0.5ml 1M HCl (fofo3) ma le 100μl reagent fa'atupu (fofo1);lulu atoa mo le 2 minute;

---- Incubate i le 37 ℃ i le po (pe a ma le 16h);

----Faaopoopo 5ml 0.1MK₂HPO₄ (fofo2), 0.4ml 1M NaOH (fofo4) ma le 5ml ethyl acetate, lulu malosi mo le 30s;

---- Centrifuge i le vevela o le potu (20-25 ℃) mo le 10min, a itiiti mai 3000g;

---- Ave le 2.5ml o le supernatant organic phase i totonu o le 10ml mama tioata, faʻamago i le 50-60℃ kasa nitrogen poʻo le evaporator rotary;

---- Fa'amavae le mea'ai mago ma le 1ml n-hexane (po'o le n-heptane), vortex mo le 30s, fa'aopoopo le 1ml fa'aputu vaifofo (fofo5), vortex 1min, faʻafefiloi atoa.

----Centrifuge i le vevela o le potu (20-25^oC) mo le 10min, a itiiti mai 3000g;

---- Ave'ese le vaega fa'alenatura supernatant;ave 50μl o le vaega vai substrate mo suʻega.

1. 9.Fa'agasologa o su'ega

9.1Fa'aaliga a'o le'i faia le su'ega

9.1.1 Ia mautinoa o lo'o tu'u uma i le vevela o le potu (20-25℃).

9.1.2 Toe fa'afo'i uma mea toe fa'afo'i i le 2-8 ℃ vave pe a uma ona fa'aoga.

9.1.3 O le fufuluina sa'o o microwells ose laasaga taua ile fa'agasologa ole su'ega;o le mea taua tele i le toe gaosia o le suʻesuʻega ELISA.

9.1.4 Aloese mai le malamalama ma ufiufi le microwells i le taimi e fa'ago ai.

9.2 Laasaga Su'esu'e

9.2.1 Ave uma mea fa'afoliga i fafo i le vevela o le potu (20-25 ℃) mo le sili atu i le 30min, fa'atasi a'o le'i fa'aoga.

9.2.2 Aumai i fafo microwells o lo'o mana'omia ma toe fa'afo'i le vaega o totoe i totonu o le taga sipi-loka ile 2-8℃ vave.

9.2.3 E tatau ona toe fa'amafanafana le vaifofo fufulu fa'ato'ato'a ma le vaifofo fa'ato'a fa'ato'a fa'ao'o i le vevela o le potu a'o le'i fa'aoga.

9.2.4Numera:Faanumera uma tulaga microwell ma tulaga uma ma faataitaiga e tatau ona fa'alua.Faamaumau tulaga ma tulaga faataitai.

9.2.5Fa'aluina o le vaifofo fa'aantibody fa'atotonu: fa'asusu le vaifofo fa'ato'ato'a fa'ama'i fa'atasi ai ma fa'afefiloi fa'afefiloi enzyme i le fua fa'atatau o le voluma o le 1:10(1 fa'ato'a fa'amamafa vaifofo: 10 gaugau fa'afefiloi fa'afefiloi o enzyme).

9.2.6Fa'aopoopo le vaifofo masani / fa'ata'ita'iga ma le enzyme conjugate solution: fa'aopoopo le 50µl o le vaifofo masani po'o le fa'ata'ita'iga saunia i vaieli talafeagai, fa'aopoopo le 50μl enzyme conjugate solution.Faafefiloi malie e ala i le luluina o le ipu ma le lima ma faʻagogo mo le 30 minute i le 25 ℃ ma le ufiufi.

9.2.7Fufulu: Aveese lemu le ufiufi ma sasaa le vai mai vaieli ma fufulu microwells ile 250µl vaifofo fufulu (fofo6) i le va o le 10s mo le 4-5 taimi.Fa'asusu le vai o lo'o totoe i se pepa fa'afefe (o le vaega o totoe o le ea e mafai ona fa'aumatia i le pito e le'o fa'aaogaina).

9.2.8Valivali: Fa'aopoopo le 50µl vaifofo A ma le vaifofo B 50ul i vaieli ta'itasi.Faafefiloi lemu e ala i le luluina o le ipu ma le lima ma faʻagogo mo le 15 minute i le 25 ℃ ma le ufiufi (silasila i le 12.8).

9.2.11Fua: Faaopopo le 50µl le vaifofo taofi i vaieli taitasi.Faafefiloi lemu e ala i le luluina o le ipu ma le lima ma fua le mitiia i le 450nm (Na fautuaina le fuaina ma le lua-wavelength o le 450/630nm. Faitau le taunuuga i totonu o le 5min pe a uma le faʻaopoopoina o le fofo taofi.)

10 I'uga

10.1Pasene mitiia

O tau faʻatatau o le faʻaogaina o mea e maua mo tulaga faʻataʻitaʻiga ma faʻataʻitaʻiga e vaevaeina i le tau o le absorbance o le tulaga muamua (zero standard) ma faʻateleina i le 100%.Ole tulaga ole zero ua fa'apea ua tutusa ile 100% ma o tau o le absorbance o lo'o ta'ua i pasene.

=

B ——absorbance standard (poʻo faʻataʻitaʻiga)

B0 ——absorbance zero standard

10.2Pi'o Fa'ata'atia

----Ia tusi se pi'o masani: Ave le tau o le absorbance o tulaga faatonuina e pei o le y-axis, semi logarithmic o le faʻatonuga o le fofo masani AOZ (ppb) e pei o le x-axis.

----O le fa'atonuga o le AOZ o fa'ata'ita'iga ta'itasi (ppb), e mafai ona faitau mai le fa'asologa o le fa'avasegaina, e fa'ateleina i le mea fa'afefete tutusa o fa'ata'ita'iga ta'itasi e mulimulita'i, ma maua ai le fa'atonuga moni o fa'ata'ita'iga.

Faamolemole matau:

Ua atia'e polokalame fa'apitoa mo fa'aitiitiga fa'amaumauga uma, lea e mafai ona tu'uina atu i luga ole talosaga.

Fa'aliga vai………………………………………………………2

10.Ma'ale'ale, sa'o ma sa'o

Ma'ale'ale: 0.025ppb

Fa'atapula'a su'esu'ega:

Tisu (muso, ate)………………………………0.1ppb

Meli------------------------------------------------ -0.1ppb

Sa'o:

Aano o manu (muso ma le ate)……………………100±20%

Meli…………………………………………………… 100±20%

Sa'o:CV o le pusa ELISA e itiiti ifo i le 10%.

11.Fa'aaliga

12.1 Ole a fa'aitiitia le aofa'i ole aofa'i ole su'esu'e e maua mo tulaga fa'ata'ita'iga ma fa'ata'ita'iga pe a le fa'atulafonoina le fa'anofoina ma fa'ata'ita'iga ile vevela potu (20-25℃).

12.2 Aua le faatagaina microwells e mago i le va o laasaga e aloese ai mai le le manuia o le toe gaosia ma faagaoioia le isi laasaga i le taimi lava e uma ai le tataina o le microwells holders.

12.3 Lulu lemu ia mea fa'afefiloi a'o le'i fa'aogaina.

12.4 Taofi lou pa'u mai le vaifofo taofi aua o le 0.5MH₂SO₄fofo.

12.5 Aua le fa'aogaina pusa ua tuai.Aua nei fesuia'i le reagents o vaega eseese, a leai o le a pa'u ai le maaleale.

12.6 Tulaga e teu ai: Taofi pusa ELISA ile 2-8℃, aua le fa'aisa.Faamaufa'ailoga ipu microwell malolo, 'Alo'ese sa'o le susulu o le la i le taimi o fa'afuga uma.E fautuaina le ufiufi o ipu microtiter.

12.7 E tatau ona lafoa'i le vaifofo o le eleele pe a liu lanu.E mafai ona faʻaleagaina mea faʻapipiʻi pe afai o le aofaʻi o le absorbance (450 / 630nm) o le zero standard e itiiti ifo i le 0.5 (A450nm<0.5).

12.8 O le tali lanu e manaʻomia le 15min pe a maeʻa le faʻaopoopoga o le vaifofo substrate;E mafai ona e faʻaumiumi le taimi faʻafefe i le 20min pe sili atu pe a fai e malamalama tele le lanu e faʻamoemoeina., aua le sili atu i le 25min. I se isi itu, faʻapuupuu le taimi faʻamaʻi lelei.

12.9 O le vevela tali sili ona lelei e 25 ℃.O le maualuga pe maualalo le vevela o le a taʻitaʻia ai suiga o le maaleale ma le faʻaogaina o tau.

12.Tulaga teuina ma le taimi e teu ai

Tulaga teuina: 2-8℃.

Taimi e teu ai: 12 masina.