produkt

1. 1.Sfondi

Nitrofuranet janë antibiotikë sintetikë me spektër të gjerë, të cilët përdoren shpesh në prodhimin e kafshëve për vetitë e shkëlqyera antibakteriale dhe farmakokinetike.Ata ishin përdorur gjithashtu si nxitës të rritjes në prodhimin e derrave, shpendëve dhe ujore.Në studimet afatgjata me kafshë laboratorike treguan se barnat mëmë dhe metabolitët e tyre shfaqnin karakteristika kancerogjene dhe mutagjene.Kjo ka çuar në një ndalim të nitrofuraneve për trajtimin e kafshëve që përdoren për prodhimin e ushqimit.Barnat nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin dhe nitrofurazone u ndaluan të përdoren në prodhimin ushqimor të kafshëve në BE në 1993 dhe përdorimi i furazolidonit u ndalua në 1995.

Analiza e mbetjeve të barnave nitrofuran duhet të bazohet në zbulimin e metabolitëve të lidhur me indet e barnave mëmë të nitrofuranit.Meqenëse barnat mëmë metabolizohen shumë shpejt dhe metabolitët e nitrofuranit të lidhur me indet do të ruhen për një kohë të gjatë, këta metabolitë përdoren si objektiv në zbulimin e abuzimit të nitrofuraneve, të cilat përfshijnë metabolitin e Furazolidone (AOZ), metabolitin Furaltadone (AMOZ). ), metaboliti i nitrofurantoinës (AHD) dhe metaboliti i nitrofurazonit (SEM).

Mbetjet AOZ përcaktohen më së shpeshti nga LC-MS ose LC-MS/MS.Analizat imunologjike enzimatike, krahasuar me metodat kromatografike, tregojnë avantazhe të konsiderueshme përsa i përket ndjeshmërisë, kufirit të zbulimit, pajisjeve teknike dhe kërkesës për kohë.(Koha e kostos: 45 min)

1. 2.Parimi i Testit

Ky komplet ELISA është krijuar për të zbuluar AOZ bazuar në parimin e imuno-analizimit të enzimës konkurruese indirekte.Puset e mikrotitrit janë të veshura me antigjen kapës të lidhur me BSA.AOZ në mostër konkurron me antigjenin e veshur në pllakën e mikrotitrit për antitrupin e shtuar.Pas shtimit të konjugatit të enzimës, përdoret substrati kromogjen dhe sinjali matet me një spektrofotometër.Thithja është në përpjesëtim të zhdrejtë me përqendrimin e AOZ në kampion.

1. 3.Aplikacionet

Ky komplet mund të përdoret në analizën sasiore dhe cilësore të mbetjeve AOZ nëindet anima(muskuj, mëlçi etj), mjaltë.

1. 4.Reaksionet e kryqëzuara

Metaboliti i furazolidonit (AOZ)………………………..100%

Metaboliti i furaltadonit (AMOZ)……………………<0,1%

Metaboliti i nitrofurantoinës (AHD)……………………<0,1%

Metaboliti nitrofurazone (SEM)………………………<0,1%

Furazolidoni………………………………………..… 16,3%

Furaltadone……………………………………………<1%

Nitrofurantoin……………………………………………<1%

Nitrofurazoni……………………………………………<1%

1. 5.Materialet e nevojshme

5.1Pajisjet

----Sspektrofotometri i pllakës së mikrotitorit (450nm/630nm)

----Avullues rrotullues ose instrumente për tharjen e azotit

----Homogenizues /stomaker

----Tundësi

----Përzierës Vortex

----Centrifuge

----Bilanci analitik (induktiviteti: 0.01g)

----Pipetë e diplomuar: 10ml

---- Llambë me pipetë gome

---- Balonë vëllimore: 100ml

---- Balonë qelqi: 10 ml

----Tuba centrifuguese e polistirenit: 2ml, 50ml

----Mikropipetat: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250 ul-multipipete

5.2Reagentët

----Acetat etilik (AR)

----n-heksan (ose n-heptan) (AR)

----Trihidrat hidrogjen fosfat i kaliumit

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Acidi klorhidrik i koncentruar (HCl, AR)

-----Metanol

----Hidroksid natriumi (NaOH, AR)

----Ujë i dejonizuar

1. 6.Komponentët e kompletit

l Pllakë mikrotitërore e veshur me antigjen, 96 puse

l Solucione standarde (6 shishe, 1 ml/shishe)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Kontroll standard spiking: (1ml/shishe).......100 ppb

l Konjugat enzimë e koncentruar 1ml.......kapak i kuq

l Diluent të konjuguar enzimë 10ml………..kapak jeshil

l Substrat A 7ml……………………………..kapak i bardhë

l Substrat B 7ml……………………………..kapak i kuq

l Tretësirë ​​ndaluese 7 ml………………………………kapak i verdhë

l 20×solucion larës i koncentruar 40ml

……………………………………………kapak transparent

l 2×tretësirë ​​ekstraktuese e koncentruar 60ml….kapak blu

l 2-Nitrobenzaldehid 15.1 mg…………………kapak i bardhë

1. 7.Përgatitja e reagentëve

Zgjidhje 1: reagent derivat:

Shtoni 10 ml metanol në shishe me 2-Nitrobenzaldehid dhe shpërndajeni.(në përqendrimin prej 10 mM).

Zgjidhje 2: 0.1 MK₂HPO₄zgjidhje:

Pesha 22.8 g K₂HPO₄.3H₂O deri në 1L ujë të dejonizuar për t'u tretur.

Zgjidhje 3: 1M tretësirë ​​HCl

Tretni 8.3 ml acid klorhidrik të koncentruar me ujë të dejonizuar në 100 ml.

Zgjidhja 4:1 M tretësirë ​​NaOH

Shpërndani 4 g NaOH me 100 ml ujë të dejonizuar.

Zgjidhja 5: zgjidhje ekstraktuese:

Hollohet 2×tretësira e koncentruar ekstraktuese me ujë të dejonizuar në raport vëllimi 1:1.Kjo zgjidhje mund të ruhet për 1 muaj në 4℃, e cila do të përdoret për të nxjerrë mostrat.

Zgjidhje 6: solucion larës:

Hollojeni tretësirën e larjes 20× të koncentruar me ujë të dejonizuar në raportin e vëllimit 1:19, i cili do të përdoret për të larë pllakat.Kjo tretësirë ​​e holluar mund të konservohet për 1 muaj në 4℃.

1. 8.Përgatitjet e mostrave

8.1Njoftimi dhe masat paraprake para operacionit:

a) Ju lutemi përdorni këshilla një herë në eksperiment dhe ndryshoni majat kur thithni reagjentë të ndryshëm.

b) Sigurohuni që të gjitha instrumentet eksperimentale të jenë të pastra.

c) reagenti derivat mund të ruhet në 2-8℃ për tre muaj;

d) Tretësira e HCl mund të konservohet në temperaturën e dhomës për 3 muaj;

e) Tretësira e NaOH mund të ruhet për 3 muaj në temperaturën e dhomës;

f) Mbani mostrat e patrajtuara në ngrirje (-20℃);

g) Mostrat e trajtuara mund të ruhen për 24 orë në 2-8℃ në errësirë.

8.2 Mostrat e indeve të kafshëve dhe të mëlçisë:

----Homogjenizimi i mostrave me homogjenizues;

----Pesha 1,0±0,05g e kampionit të indit të homogjenizuar në tubin centrifugues të polistirenit 50ml.Shtoni 4 ml ujë të dejonizuar, 0,5 ml tretësirë ​​1 M HCl dhe 100 ul reagent derivat (shih tretësirën 1).E tundni për 2 minuta.

---- Inkuboni në 37℃ gjatë natës (rreth 16 orë);

---- Shtoni 5ml 0.1MK₂HPO₄ (zgjidhje2), 0,4 ml 1 M NaOH (zgjidhje4) dhe 5 ml acetat etilik.Shkundni fort për 30s;

---- Centrifugoni në temperaturën e dhomës (20-25℃) për 10 minuta, të paktën 3000 g;

---- Merrni 2,5 ml të fazës organike supernatante në një tub qelqi të pastër 10 ml, thajeni me gaz azot 50-60℃ ose avullues rrotullues;

---- Shpërndani mbetjet e thata me 1 ml n-heksan (ose n-heptan), vorbull për 30 sekonda, shtoni 1 ml tretësirë ​​ekstraktimi (zgjidhje5), vorbull 1min, përzieni plotësisht.

---- Centrifugoni në temperaturën e dhomës (20-25^oC) për 5 minuta, të paktën 3000 g;

---- Hiqni fazën organike supernatante;merrni 50 μl të fazës së ujit të nënshtresës për analizë.

8.4 Mjaltë

----peshoni 1,0±0,05 g të mostrës së homogjenizuar të mjaltit në një tub centrifuge polistireni 50 ml;

----Shtoni 4 ml ujë të dejonizuar, 0,5 ml 1 M HCl (zgjidhje3) dhe reagent derivat 100μl (zgjidhje1);tundeni plotësisht për 2 minuta;

----Inkuboni në 37℃ gjatë natës (rreth 16 orë);

----Shto 5ml 0,1MK₂HPO₄ (zgjidhje2), 0,4 ml 1 M NaOH (zgjidhje4) dhe 5 ml acetat etilik, tundeni fort për 30 sekonda;

----Centrifugoni në temperaturën e dhomës (20-25℃) për 10 minuta, të paktën 3000g;

---- Merrni 2,5 ml të fazës organike supernatante në një tub qelqi të pastër 10 ml, thajeni me gaz azot 50-60℃ ose avullues rrotullues;

----Të mbeturinat e thata shpërndahen me 1 ml n-heksan (ose n-heptan), vorbull për 30 sekonda, shtoni 1 ml tretësirë ​​ekstraktimi (zgjidhje5), vorbull 1min, përzieni plotësisht.

----Centrifugoni në temperaturën e dhomës (20-25^oC) për 10 minuta, të paktën 3000 g;

----Hiqni fazën organike supernatante;merrni 50 μl të fazës së ujit të nënshtresës për analizë.

1. 9.Procesi i analizës

9.1Njoftim para analizës

9.1.1 Sigurohuni që të gjithë reagentët dhe mikropuset të jenë të gjithë në temperaturën e dhomës (20-25℃).

9.1.2 Kthejini të gjithë reagentët e mbetur në 2-8℃ menjëherë pas përdorimit.

9.1.3 Larja e saktë e mikropuseve është një hap i rëndësishëm në procesin e analizës;është faktori jetik për riprodhueshmërinë e analizës ELISA.

9.1.4 Shmangni dritën dhe mbuloni mikropuset gjatë inkubacionit.

9.2 Hapat e analizës

9.2.1 Hiqini të gjithë reagentët në temperaturën e dhomës (20-25℃) për më shumë se 30 minuta, homogjenizoni përpara përdorimit.

9.2.2 Hiqni mikropusetat e nevojshme dhe kthejeni pjesën tjetër në çantën me zinxhir në 2-8℃ menjëherë.

9.2.3 Tretësira e koncentruar e larjes dhe tretësira e koncentruar ekstraktuese duhet të ringrohen për të qenë në temperaturën e dhomës përpara përdorimit.

9.2.4Numri:Të numëruara çdo pozicion mikropusi dhe të gjitha standardet dhe mostrat duhet të ekzekutohen në dublikatë.Regjistroni standardet dhe pozicionet e mostrave.

9.2.5Hollimi i tretësirës së koncentruar të antitrupave: holloni tretësirën e koncentruar të enzimës me hollues të konjuguar enzimë në raport vëllimi 1:10 (tretësirë ​​enzimë e koncentruar 1 herë: holluesit e konjuguar enzimë 10 fish).

9.2.6Shtoni tretësirë ​​standarde / mostër dhe tretësirë ​​të konjuguar enzimë: shtoni 50µl tretësirë ​​standarde ose mostër të përgatitur në pusetat përkatëse, shtoni 50µl tretësirë ​​të konjuguar enzimë.Përzieni butësisht duke tundur pjatën me dorë dhe inkuboni për 30 minuta në 25℃ me kapak.

9.2.7Lani: Hiqeni kapakun butësisht dhe derdhni lëngun nga pusetat dhe shpëlajini mikropuset me 250µl tretësirë ​​larës të holluar (zgjidhje6) me një interval prej 10 sekondash për 4-5 herë.Përthithni ujin e mbetur me letër thithëse (flluska e mbetur e ajrit mund të eliminohet me majë të papërdorur).

9.2.8Ngjyrosje: Shtoni 50µl tretësirë ​​të substratit A dhe 50 ul tretësirë ​​të substratit B në çdo pus.Përziejeni butësisht duke e tundur pjatën me dorë dhe inkuboni për 15 minuta në 25℃ me mbulesë (shih 12.8).

9.2.11Masa: Shtoni 50µl tretësirë ​​ndaluese në çdo pus.Përziejeni butësisht duke e tundur pllakën me dorë dhe matni absorbimin në 450 nm (Ajo sugjeroi matjen me gjatësinë e valës së dyfishtë prej 450/630 nm. Lexoni rezultatin brenda 5 minutash pas shtimit të tretësirës ndaluese. )

10 Rezultatet

10.1Përthithja e përqindjes

Vlerat mesatare të vlerave të absorbimit të marra për standardet dhe mostrat pjesëtohen me vlerën e absorbimit të standardit të parë (standardi zero) dhe shumëzohen me 100%.Kështu, standardi zero bëhet i barabartë me 100% dhe vlerat e absorbimit kuotohen në përqindje.

=

B ——standard (ose mostër) absorbimi

B0 —— standardi i përthithjes zero

10.2Kurba standarde

----Për të vizatuar një kurbë standarde: Merrni vlerën e absorbimit të standardeve si bosht y, gjysmë logaritmike të përqendrimit të tretësirës standarde AOZ (ppb) si bosht x.

----Përqendrimi AOZ i çdo kampioni (ppb), i cili mund të lexohet nga kurba e kalibrimit, shumëzohet me faktorin përkatës të hollimit të çdo kampioni të ndjekur dhe fitohet përqendrimi aktual i kampionit.

Ju lutemi vini re:

Është zhvilluar softuer special për të gjitha reduktimet e të dhënave, i cili mund të sigurohet sipas kërkesës.

Faktori i hollimit…………………………………………………2

10.Ndjeshmëri, saktësi dhe saktësi

Ndjeshmëria: 0,025ppb

Kufiri i zbulimit:

Indi (muskuli, mëlçia)…………………………0.1 ppb

Mjaltë ------------------------------------------------- -0.1ppb

Saktësia:

Indet shtazore (muskujt dhe mëlçia)…………………100±20%

E dashur………………………………………………. 100±20%

Saktësia:CV e kompletit ELISA është më pak se 10%.

11.Njoftim

12.1 Vlerat mesatare të vlerave të absorbimit të marra për standardet dhe mostrat do të reduktohen nëse reagentët dhe mostrat nuk janë rregulluar në temperaturën e dhomës (20-25℃).

12.2 Mos lejoni që mikropuset të thahen ndërmjet hapave për të shmangur riprodhueshmërinë e pasuksesshme dhe përdorni hapin tjetër menjëherë pasi trokitni lehtë mbi mbajtësin e mikropuseve.

12.3 Shkundni butësisht çdo reagent përpara përdorimit.

12.4 Mbajeni lëkurën tuaj larg solucionit ndalues ​​sepse është 0.5 MH₂SO₄zgjidhje.

12.5 Mos i përdorni kompletet e vjetruara.Mos i ndërroni reagentët e grupeve të ndryshme, përndryshe do të ulë ndjeshmërinë.

12.6 Kushtet e ruajtjes: Mbani kompletet ELISA në 2-8℃, mos ngrini.Mbyllni pllakat e mikrogropave të pushimit, Shmangni rrezet e diellit direkte gjatë të gjitha inkubacioneve.Rekomandohet mbulimi i pllakave të mikrotitrit.

12.7 Tretësira e nënshtresës duhet të braktiset nëse merr ngjyrë.Reagentët mund të përkeqësohen nëse vlera e absorbimit (450/630nm) e standardit zero është më e vogël se 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Reaksioni i ngjyrosjes ka nevojë për 15 minuta pas shtimit të tretësirës së substratit;Ju mund ta zgjasni kohën e inkubacionit në 20 minuta ose më shumë nëse ngjyra është shumë e lehtë për t'u përcaktuar. Asnjëherë mos i kaloni 25 minuta. Përkundrazi, shkurtoni kohën e inkubacionit siç duhet.

12,9 Temperatura optimale e reagimit është 25℃.Temperatura më e lartë ose më e ulët do të çojë në ndryshime të vlerave të ndjeshmërisë dhe absorbimit.

12.Gjendja e ruajtjes dhe periudha e ruajtjes

Gjendja e ruajtjes: 2-8℃.

Periudha e ruajtjes: 12 muaj.