производ

1. 1.Позадина

Нитрофурани су синтетички антибиотици широког спектра, који се често користе у сточарској производњи због својих одличних антибактеријских и фармакокинетичких својстава.Такође су коришћени као промотери раста у производњи свиња, живине и воде.Дуготрајне студије на лабораторијским животињама показале су да су изворни лекови и њихови метаболити показали канцерогене и мутагене карактеристике.Ово је довело до забране нитрофурана за лечење животиња које се користе за производњу хране.Нитрофурански лекови фуралтадон, нитрофурантоин и нитрофуразон забрањени су за употребу у производњи хране за животиње у ЕУ 1993. године, а употреба фуразолидона је забрањена 1995. године.

Анализа остатака лекова нитрофурана треба да се заснива на детекцији метаболита матичних лекова нитрофурана везаних за ткиво.Пошто се основни лекови веома брзо метаболишу, а метаболити нитрофурана везани за ткиво ће се задржати дуго времена, ови метаболити се користе као мета у откривању злоупотребе нитрофурана, што укључује метаболит фуразолидона (АОЗ), метаболит фуралтадона (АМОЗ). ), метаболит нитрофурантоина (АХД) и метаболит нитрофурантоина (СЕМ).

АОЗ-остаци се најчешће одређују помоћу ЛЦ-МС или ЛЦ-МС/МС.Ензимски имунотестови, у поређењу са хроматографским методама, показују значајне предности у погледу осетљивости, границе детекције, техничке опреме и временског захтева.(Временска цена: 45 мин)

1. 2.Принцип теста

Овај ЕЛИСА комплет је дизајниран да детектује АОЗ на основу принципа индиректно-компетитивног ензимског имуноесеја.Јамице за микротитар су обложене антигеном повезаним са БСА.АОЗ у узорку се такмичи са антигеном обложеним на микротитарској плочи за додато антитело.Након додавања коњугата ензима, користи се хромогени супстрат и сигнал се мери спектрофотометром.Апсорпција је обрнуто пропорционална концентрацији АОЗ у узорку.

1. 3.Апликације

Овај комплет се може користити у квантитативној и квалитативној анализи остатка АОЗ уанима ткива(мишићи, јетра итд.), мед.

1. 4.Унакрсне реакције

Метаболит фуразолидона (АОЗ)……………………..100%

Метаболит фуралтадона (АМОЗ)……………………<0,1%

Метаболит нитрофурантоина (АХД)……………………<0,1%

Метаболит нитрофуразона (СЕМ)………………………<0,1%

Фуразолидон…………………………………………………..…16,3%

Фуралтадон…………………………………………………………<1%

Нитрофурантоин……………………………………………….…….…<1%

Нитрофуразон……………………………………………………..…<1%

1. 5.Потребни материјали

5.1Опрема

---- Спектрофотометар микротитарске плоче (450нм/630нм)

----Ротациони испаривач или инструменти за сушење азота

----Хомогенизатор / стомацхер

----Схакер

----Вортек миксер

----Центрифуга

----Аналитичка вага (индуктивност: 0,01г)

----Градована пипета: 10мл

---- Гумена сијалица за пипету

---- Запремина боца: 100 мл

----Стаклена боца: 10 мл

---- Полистиренска центрифуга епрувета: 2мл, 50мл

----Микропипете: 20ул-200ул, 100ул-1000ул,

250ул-мултиппетте

5.2Реагенси

---- етил ацетат (АР)

----н-хексан (или н-хептан) (АР)

----Дикалијум хидрогенфосфат трихидрат

(K₂ХПО₄.3Х₂О) (АР)

----Концентрована хлороводонична киселина (ХЦл, АР)

-----Метанол

----Натријум хидроксид (НаОХ, АР)

----Дејонизована вода

1. 6.Компоненте комплета

л Микротитарска плоча обложена антигеном, 96 базенчића

л Стандардни раствори (6 боца, 1мл/боца)

0ппб,0,025ппб,0,075ппб,0,225ппб,0,675ппб,2,025ппб

л Стандардна контрола сипања: (1мл/боца).......100ппб

л Концентровани ензимски коњугат 1мл.......црвени поклопац

л Ензимски коњугати разблаживачи 10мл………..зелена капица

л Супстрат А 7мл………..............…..…..…..бели поклопац

л Супстрат Б 7мл…………..…........….…..црвени поклопац

л Стоп раствор 7мл……………………………жути поклопац

л 20×концентровани раствор за прање 40мл

……………………………………………………….……провидна капа

л 2×концентровани раствор за екстракцију 60мл….плави поклопац

л 2-нитробензалдехид 15,1мг………………бела капа

1. 7.Припрема реагенса

Решење 1: дериватни реагенс:

Додати 10 мл метанола у боцу са 2-нитробензалдехидом и растворити.(у концентрацији од 10 мМ).

Решење 2: 0.1МК₂ХПО₄решење:

Тежина 22,8 г К₂ХПО₄.3Х₂О до 1Л дејонизоване воде да се раствори.

Решење 3: 1М раствор ХЦл

Растворити 8,3 мл концентроване хлороводоничне киселине са дејонизованом водом до 100 мл.

Решење 4:1М раствор НаОХ

Растворити 4 г НаОХ са 100 мл дејонизоване воде.

Решење 5: решење за екстракцију:

Разблажити 2×концентровани раствор за екстракцију дејонизованом водом у запреминском односу 1:1.Овај раствор се може чувати 1 месец на 4℃, који ће се користити за екстраховање узорака.

Решење 6: раствор за прање:

Разблажите 20×концентровани раствор за прање дејонизованом водом у запреминском односу 1:19, која ће се користити за прање плоча.Овај разблажени раствор се може чувати 1 месец на 4℃.

1. 8.Припреме узорака

8.1Обавештење и мере предострожности пре операције:

а) Користите једнократне врхове у експерименту и мењајте врхове када апсорбујете другачији реагенс.

б) Уверите се да су сви експериментални инструменти чисти.

ц) дериватни реагенс се може чувати на 2-8℃ три месеца;

д) Раствор ХЦл може да се чува на собној температури 3 месеца;

е) Раствор НаОХ може да се чува 3 месеца на собној температури;

ф) Нетретиране узорке држати у замрзавању (-20℃);

г) Третирани узорци се могу чувати 24х на 2-8℃ у мраку.

8.2 Узорци животињског ткива и јетре:

----Хомогенизирати узорке помоћу хомогенизатора;

----Убаците 1,0±0,05 г хомогенизованог узорка ткива у епрувету за центрифугу од полистирена од 50 мл.Додати 4мл дејонизоване воде, 0,5мл 1М раствора ХЦл и 100ул дериватног реагенса (видети раствор 1).Протресите 2 мин.

---- Инкубирати на 37℃ преко ноћи (око 16х);

---- Додати 5мл 0,1МК₂ХПО₄ (решење2), 0,4 мл 1М НаОХ (решење4) и 5 ​​мл етил ацетата.Снажно тресите 30с;

---- Центрифугирати на собној температури (20-25 ℃) 10 мин, најмање 3000 г;

---- Узмите 2,5 мл органске фазе супернатанта у чисту стаклену епрувету од 10 мл, осушите гасом азота на 50-60℃ или ротационим испаривачем;

---- Растворите суви остатак са 1мл н-хексана (или н-хептана), мешајте 30с, додајте 1мл раствора за екстракцију (решење5), вртите 1 мин, потпуно промешајте.

---- Центрифугирајте на собној температури (20-25^oЦ) 5 мин, најмање 3000 г;

---- Уклонити органску фазу супернатанта;узети 50 μл водене фазе супстрата за анализу.

8.4 Мед

----измерити 1,0±0,05 г хомогенизованог узорка меда у епрувету за центрифугу од полистирена од 50 мл;

----Додајте 4 мл дејонизоване воде, 0,5 мл 1М ХЦл (решење3) и 100 μл дериватног реагенса (решење1);потпуно протрести 2 минута;

----Инкубирајте на 37℃ преко ноћи (око 16х);

----Додајте 5мл 0,1МК₂ХПО₄ (решење2), 0,4 мл 1М НаОХ (решење4) и 5мл етил ацетата, жестоко мућкати 30с;

----Центрифугирајте на собној температури (20-25℃) 10 мин, најмање 3000г;

----Узмите 2,5мл органске фазе супернатанта у чисту стаклену епрувету од 10мл, осушите гасом азота на 50-60℃ или ротационим испаривачем;

----Растворите суви остатак са 1мл н-хексана (или н-хептана), мешајте 30с, додајте 1мл раствора за екстракцију (решење5), вртите 1 мин, потпуно промешајте.

----Центрифугирајте на собној температури (20-25^oЦ) 10 мин, најмање 3000 г;

----Уклонити органску фазу супернатанта;узети 50 μл водене фазе супстрата за анализу.

1. 9.Процес анализе

9.1Напомена пре анализе

9.1.1 Уверите се да су сви реагенси и микројажице на собној температури (20-25℃).

9.1.2 Вратите све остале реагенсе на 2-8 ℃ одмах након употребе.

9.1.3 Правилно прање микро-јажица је важан корак у процесу анализе;то је витални фактор за поновљивост ЕЛИСА анализе.

9.1.4 Избегавајте светлост и покријте микро јажице током инкубације.

9.2 Кораци теста

9.2.1 Извадите све реагенсе на собној температури (20-25℃) дуже од 30 минута, хомогенизујте пре употребе.

9.2.2 Извадите потребне микро-јажице, а остатак одмах вратите у врећу са затварачем на 2-8 ℃.

9.2.3 Концентровани раствор за прање и концентровани раствор за екстракцију треба поново загрејати да буду на собној температури пре употребе.

9.2.4Број:Нумерисана свака позиција микробуна и сви стандарди и узорци треба да се раде у дупликату.Забележите положаје стандарда и узорака.

9.2.5Разблаживање концентрованог раствора антитела: разблажити концентровани раствор ензима са разблаживачима коњугата ензима у запреминском односу 1:10 (1 пута концентровани раствор ензима: 10 пута разблаживачи коњугата ензима).

9.2.6Додати стандардни раствор/узорак и раствор коњугата ензима: додати 50 µл стандардног раствора или припремљеног узорка у одговарајуће јажице, додати 50 µл раствора коњугата ензима.Лагано промешајте ручним протресањем плоче и инкубирајте 30 минута на 25 ℃ са поклопцем.

9.2.7Оперите: Пажљиво уклоните поклопац и излијте течност из удубљења и исперите микро-јажице са 250 µл разблаженог раствора за прање (решење6) у интервалу од 10 секунди 4-5 пута.Преосталу воду апсорбујте упијајућим папиром (остатак мехурића ваздуха се може елиминисати неискоришћеним врхом).

9.2.8Цолоратион: Додајте 50 µл раствора супстрата А и 50 µл раствора супстрата Б у сваки бунар.Лагано промешајте ручним љуљањем плоче и инкубирајте 15 минута на 25℃ са поклопцем (видети 12.8).

9.2.11Мера: Додајте 50 µл раствора за заустављање у сваки бунар.Лагано промешајте тако што ћете ручно љуљати плочу и измерите апсорбанцију на 450 нм (предлаже се мерење са двоструком таласном дужином од 450/630 нм. Очитајте резултат у року од 5 минута након додавања стоп раствора.)

10 Резултати

10.1Проценат апсорпције

Средње вредности вредности апсорпције добијене за стандарде и узорке подељене су са вредношћу апсорпције првог стандарда (нулти стандард) и помножене са 100%.Нулти стандард је на тај начин једнак 100%, а вредности апсорпције су наведене у процентима.

=

Б ——стандард апсорпције (или узорак)

Б0 —— стандард нулте апсорпције

10.2Стандард Цурве

----Да нацртате стандардну криву: Узмите вредност апсорпције стандарда као и-осу, полулогаритамску од концентрације АОЗ стандардног раствора (ппб) као к-оса.

----Концентрација АОЗ сваког узорка (ппб), која се може очитати из калибрационе криве, множи се одговарајућим фактором разблажења сваког узорка који се прати и добија се стварна концентрација узорка.

Обратите пажњу:

За све редукције података развијен је посебан софтвер који се може обезбедити на захтев.

Фактор разблажења………………………………………..……2

10.Осетљивост, тачност и прецизност

Осетљивост: 0.025ппб

Граница детекције:

Ткиво (мишић, јетра)…………………………0,1ппб

Душо------------------------------------------------- -0.1ппб

тачност:

Животињско ткиво (мишићи и јетра)…………………100±20%

Мед…………………………………………………….. 100±20%

Прецизност:ЦВ ЕЛИСА комплета је мањи од 10%.

11.Објава

12.1 Средње вредности вредности апсорбанције добијене за стандарде и узорке биће смањене ако реагенси и узорци нису подешени на собну температуру (20-25℃).

12.2 Не дозволите да се микро-јажице осуше између корака да бисте избегли неуспешну поновљивост и извршите следећи корак одмах након додиривања држача микро-јажица.

12.3 Нежно протресите сваки реагенс пре употребе.

12.4 Држите кожу даље од решења за заустављање јер је 0,5МХ₂SO₄решење.

12.5 Не користите комплете који су застарели.Не мењајте реагенсе различитих серија, иначе ће пасти осетљивост.

12.6 Услови складиштења: Држите ЕЛИСА комплете на 2-8℃, не замрзавајте.Запечатите микро јажице за одмор, избегавајте директну сунчеву светлост током свих инкубација.Препоручује се покривање микротитарских плоча.

12.7 Раствор супстрата треба напустити ако поприми боју.Реагенси се могу погоршати ако је вредност апсорбанције (450/630нм) нултог стандарда мања од 0,5 (А450нм<0,5).

12.8 За реакцију бојења потребно је 15 минута након додавања раствора супстрата;Можете продужити време инкубације на 20 минута или више ако је боја превише светла да би се одредила. Никада не прелазите 25 минута. Напротив, правилно скратите време инкубације.

12.9 Оптимална температура реакције је 25 ℃.Виша или нижа температура ће довести до промене вредности осетљивости и апсорпције.

12.Услови складиштења и период складиштења

Услови складиштења: 2-8 ℃.

Период складиштења: 12 месеци.