маҳсулот

1. 1.Замина

Нитрофуранҳо антибиотикҳои синтетикии спектри васеъ мебошанд, ки барои хосиятҳои аълои антибактериалӣ ва фармакокинетикии худ дар истеҳсоли ҳайвонот истифода мешаванд.Онҳо инчунин ҳамчун мусоидаткунандаи афзоиш дар хук, парранда ва парвариши обӣ истифода мешуданд.Дар таҳқиқоти дарозмуддат бо ҳайвоноти лабораторӣ нишон доданд, ки доруҳои волидайн ва метаболитҳои онҳо хусусиятҳои канцерогенӣ ва мутагенӣ доранд.Ин ба манъи нитрофуранҳо барои табобати ҳайвоноте, ки барои истеҳсоли ғизо истифода мешаванд, оварда расонид.Доруҳои нитрофурани фуралтадон, нитрофурантоин ва нитрофуразон дар ИА дар соли 1993 дар истеҳсоли ҳайвоноти ғизоӣ ва истифодаи фуразолидон дар соли 1995 манъ карда шуд.

Таҳлили боқимондаи доруҳои нитрофуран бояд ба ошкор кардани метаболитҳои бо бофтаи доруҳои асосии нитрофуран алоқаманд асос ёбад.Азбаски доруҳои волидайн хеле зуд метаболизм мешаванд ва метаболитҳои бо бофтаи нитрофуран ба муддати тӯлонӣ нигоҳ дошта мешаванд, ин метаболитҳо ҳамчун ҳадаф дар ошкор кардани сӯиистифодаи нитрофуранҳо истифода мешаванд, ки ба онҳо метаболити Фуразолидон (АОЗ), Метаболити Фуралтадон (АМОЗ) дохил мешаванд. ), метаболити нитрофурантоин (AHD) ва метаболити нитрофуразон (SEM).

AOZ-боқимондаҳо бештар аз ҷониби LC-MS ё LC-MS/MS муайян карда мешаванд.Таҳлилҳои иммунии ферментӣ дар муқоиса бо усулҳои хроматографӣ дар ҳассосият, маҳдудияти ошкоркунӣ, таҷҳизоти техникӣ ва талабот бартариҳои зиёд нишон медиҳанд.(Нархи вақт: 45 дақиқа)

1. 2.Принсипи санҷиш

Ин маҷмӯаи ELISA барои муайян кардани AOZ дар асоси принсипи иммунологияи ферментҳои ғайримустақим-рақобат пешбинӣ шудааст.Чоҳҳои микротитрҳо бо антигени ба BSA алоқаманд пӯшонида шудаанд.AOZ дар намуна бо антигене, ки дар лавҳаи микротитрӣ барои антитело илова карда шудааст, рақобат мекунад.Пас аз илова кардани конъюгат фермент, субстрати хромогенӣ истифода мешавад ва сигнал тавассути спектрофотометр чен карда мешавад.Азхудкунӣ ба консентратсияи AOZ дар намуна мутаносиби баръакс аст.

1. 3.Барномаҳо

Ин маҷмӯа метавонад дар таҳлили миқдорӣ ва сифатии пасмондаҳои AOZ дарбофтаҳои анима(мушак, ҷигар ва ғ.), асал.

1. 4.Реаксияҳои байниҳамдигарӣ

Метаболити Фуразолидон (AOZ)……………………..100%

Метаболити фуралтадон (АМОЗ)……………………<0,1%

Метаболити нитрофурантоин (AHD)……………………<0,1%

Метаболити нитрофуразон (SEM)………………………<0,1%

Фуразолидон…………………………………….…..…16,3%

Фуралтадон………………………………………….…<1%

Нитрофурантоин…………………………………….…….…<1%

Нитрофуразон…………………………………………..…<1%

1. 5.Маводҳои зарурӣ

5.1Таҷҳизот

---- Спектрофотометри пластинкаи микротитр (450нм/630нм)

----Асбобҳои бухоркунандаи гардишкунанда ё азот хушккунанда

---- Гомогенизатор / меъда

----Шакер

---- Миксери гирдоби

---- Центрифуга

---- Тавозуни таҳлилӣ (индуктивӣ: 0,01 г)

---- Пипеткаи хатмкарда: 10 мл

---- Лампочкаи пипеткаи резинӣ

---- Колбаи ҳаҷмӣ: 100 мл

---- Колбаи шишагӣ: 10 мл

----Туби центрифугаи полистирол: 2мл, 50мл

----Микропипеткаҳо: 20ул-200ул, 100ул-1000ул,

250ул-мултипитет

5.2Реактивхо

---- этилацетат (AR)

----н-гексан (ё н-гептан) (AR)

---- Трихидрати гидрогенфосфати дикалий

(K₂HPO₄.3H₂О) (AR)

---- Кислотаи консентратсияи гидрохлорид (HCl, AR)

-----Метанол

---- гидроксиди натрий (NaOH, AR)

---- Оби деионизатсияшуда

1. 6.Компонентҳои маҷмӯа

л Пластинкаи микротитр, ки бо антиген печонида шудааст, 96 чох

л Маҳлулҳои стандартӣ (6 шиша, 1 мл / шиша)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Назорати стандартӣ: (1 мл/шиша).......100ppb

л Конъюгати ферментҳои консентратӣ 1мл ...... cap сурх

л Маҳлулҳои конъюгатии фермент 10мл………..кабки сабз

л Субстрат А 7мл…………………………………

л Субстрати В 7мл………………………………..сарпӯши сурх

l ҳалли ҳалли 7ml ...................................................................................................

л 20 × маҳлули шустани консентратӣ 40 мл

……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

л 2 × маҳлули истихроҷи консентратсияи 60ml….кабуд

л 2-Нитробензалдегид 15,1 мг………………

1. 7.Тайёр кардани реактивҳо

Ҳалли 1: реактиви ҳосилшуда:

Ба шишаи дорои 2-нитробензалдегид 10 мл метанол илова кунед ва об кунед.(дар консентратсияи 10mM).

Ҳалли 2: 0.1МК₂HPO₄ҳалли:

Вазни 22,8 г К₂HPO₄.3H₂О ба 1л оби деионизатсияшуда барои об кардан.

Ҳалли 3: Маҳлули 1М HCl

8,3 мл кислотаи консентратсияи гидрохлоридро маҳлул кунед бо оби деионизатсияшуда то 100 мл.

Ҳалли 4:Маҳлули 1М NaOH

4 г NaOH-ро бо оби 100 мл деионизатсияшуда маҳлул кунед.

Ҳалли 5: ҳалли истихроҷ:

Маҳлули 2 × консентратсияи экстраксияро бо оби деионизатсияшуда дар таносуби ҳаҷми 1:1 маҳлул кунед.Ин маҳлулро барои 1 моҳ дар ҳарорати 4℃ нигоҳ доштан мумкин аст, ки он барои намунаҳои истихроҷшуда истифода мешавад.

Ҳалли 6: маҳлули шустан:

Маҳлули шустани 20 × консентратсиониро бо оби деионизатсияшуда дар ҳаҷми 1:19, ки барои шустани плитаҳо истифода мешавад, ҳал кунед.Ин маҳлули маҳлулшударо дар ҳарорати 4℃ барои 1 моҳ нигоҳ доштан мумкин аст.

1. 8.Омодасозии намуна

8.1Огоҳӣ ва чораҳои эҳтиётӣ пеш аз амалиёт:

a) Лутфан, дар таҷриба маслиҳатҳои якдафъаинаро истифода баред ва ҳангоми азхудкунии реагентҳои гуногун маслиҳатҳоро иваз кунед.

б) Боварӣ ҳосил кунед, ки ҳама асбобҳои таҷрибавӣ тоза мебошанд.

в) реактиви ҳосилшударо дар ҳарорати 2-8℃ барои се моҳ нигоҳ доштан мумкин аст;

г) Маҳлули HCl-ро дар ҳарорати хонагӣ 3 моҳ нигоҳ доштан мумкин аст;

д) Маҳлули NaOH-ро дар ҳарорати хонагӣ 3 моҳ нигоҳ доштан мумкин аст;

е) Намунаҳои коркарднашударо дар яхдон нигоҳ доред (-20 ℃);

g) Намунаҳои коркардшударо барои 24 соат дар ҳарорати 2-8 ℃ дар торикӣ нигоҳ доштан мумкин аст.

8.2 Намунаҳои бофтаи ҳайвонот ва ҷигар:

---- Намунаҳоро бо гомогенизатор яксон кунед;

---- Вазни 1,0 ± 0,05 г намунаи бофтаи якхела ба найчаи сентрифугаи полистироли 50 мл.4мл оби деионизатсияшуда, 0,5мл маҳлули 1М HCl ва реагенти ҳосилшудаи 100ул илова кунед (ниг. маҳлули 1).Онро барои 2 дақиқа ҷунбонед.

---- Дар ҳарорати 37 ℃ як шабонарӯз инкубатсия кунед (тақрибан 16 соат);

---- 5мл 0,1МК илова кунед₂HPO₄ (ҳалли2), 0,4мл 1М NaOH (ҳалли4) ва 5 мл этилацетат.Дар давоми 30 сония сахт такон диҳед;

---- Центрифуга дар ҳарорати хонагӣ (20-25 ℃) барои 10 дақиқа, ҳадди аққал 3000 г;

---- 2,5 мл фазаи органикии супернатантро ба найчаи шишагии 10 мл тоза кунед, бо гази нитрогени 50-60 ℃ ё бухоркунандаи гардишкунанда хушк кунед;

---- Боқимондаи хушкро бо 1 мл н-гексан (ё н- гептан) маҳлул кунед, 30 сония гирдоб кунед, 1 мл маҳлули экстракциониро илова кунед (ҳалли5), гирдоби 1 дақиқа, пурра омехта кунед.

---- Центрифуга дар ҳарорати хонагӣ (20-25^o$C) барои 5 даќиќа, на камтар аз 3000г;

---- Фазаи органикии супернатантро хориҷ кунед;50 мкл аз марҳилаи оби субстрат барои ташхис гиред.

8.4 Асал

---- 1,0±0,05 г намунаи якхелашудаи асалро дар найчаи центрифугаи полистироли 50 мл баркашед;

---- Иловаи 4 мл оби деионизатсияшуда, 0,5 мл 1 М HCl (ҳалли3) ва реагенти ҳосилшудаи 100мкл (ҳалли1);барои 2 дақиқа комилан ҷунбиш кунед;

---- Дар ҳарорати 37 ℃ шабона (тақрибан 16 соат) инкубатсия кунед;

---- 5мл 0,1МК илова кунед₂HPO₄ (ҳалли2), 0,4мл 1М NaOH (ҳалли4) ва 5 мл этил ацетат, 30 сония сахт такон диҳед;

---- Центрифуга дар ҳарорати хонагӣ (20-25 ℃) барои 10 дақиқа, ҳадди аққал 3000 г;

---- 2,5 мл фазаи органикии супернатантро ба найчаи шишагии 10 мл тоза кунед, бо гази нитрогени 50-60 ℃ ё бухоркунандаи гардишкунанда хушк кунед;

----Боқимондаи хушкро бо 1 мл н-гексан (ё н- гептан) маҳлул кунед, 30 сония гирдоб кунед, 1 мл маҳлули экстракциониро илова кунед (ҳалли5), гирдоби 1 дақиқа, пурра омехта кунед.

---- Центрифуга дар ҳарорати хонагӣ (20-25^o$C) барои 10 даќиќа, на камтар аз 3000г;

---- Фазаи органикии супернатантро нест кунед;50 мкл аз марҳилаи оби субстрат барои ташхис гиред.

1. 9.Раванди таҳлил

9.1Пеш аз ташхис огоҳӣ диҳед

9.1.1 Боварӣ ҳосил кунед, ки ҳама реактивҳо ва қуттиҳои хурд дар ҳарорати хонагӣ (20-25 ℃) мебошанд.

9.1.2 Ҳама реактивҳои боқимондаро фавран пас аз истифода ба 2-8 ℃ баргардонед.

9.1.3 Дуруст шустани қубурҳои хурд қадами муҳим дар раванди таҳлил аст;он омили муҳими такроршавандагии таҳлили ELISA мебошад.

9.1.4 Ҳангоми инкубатсия аз рӯшноӣ худдорӣ кунед ва чоҳҳои хурдро пӯшонед.

9.2 Қадамҳои санҷиш

9.2.1 Ҳама реактивҳоро дар ҳарорати хонагӣ (20-25 ℃) барои зиёда аз 30 дақиқа берун кунед, пеш аз истифода гомогенизатсия кунед.

9.2.2 Хуруҷҳои лозимиро берун кунед ва боқимондаро дар ҳарорати 2-8 ℃ фавран ба халтаи қуфл баргардонед.

9.2.3 Маҳлули консентратсионии шустушӯй ва маҳлули консентратсионии экстраксия бояд пеш аз истифода гарм карда шавад, то дар ҳарорати хонагӣ бошад.

9.2.4Рақам:Рақамгузорӣ кардани ҳар як мавқеъи микроэлементҳо ва ҳама стандартҳо ва намунаҳо бояд дар ду нусха иҷро карда шаванд.Мавқеъҳои стандартҳо ва намунаҳоро сабт кунед.

9.2.5Маҳлули консентратсияи антитело: маҳлули консентратсионии ферментро бо ҳалкунандаҳои конъюгатии ферментҳо дар таносуби ҳаҷми 1:10 (маҳлули консентратсияи ферментҳои 1 карат: маҳлули конъюгатии ферментҳои 10 қабат) об кунед.

9.2.6Маҳлули стандартӣ/намуна ва маҳлули конъюгатии ферментро илова кунед: 50 мкл маҳлули стандартӣ ё намунаи омодашударо ба чоҳҳои мувофиқ илова кунед, 50 мкл маҳлули конъюгатии ферментро илова кунед.Табақро ба таври дастӣ ҷунбонда, мулоим омехта кунед ва дар давоми 30 дақиқа дар ҳарорати 25 ℃ бо сарпӯш инкубатсия кунед.

9.2.7Шустан: Сарпӯшро бодиққат бардоред ва моеъро аз чоҳҳо резед ва микрочайкаҳоро бо маҳлули шустани 250 мкл (ҳалли6) дар фосилаи 10 сония 4-5 маротиба.Оби боқимондаро бо коғази абсорбент ҷаббида кунед (ҳубобчаи ҳавои боқимондаро бо нӯги истифоданашуда нест кардан мумкин аст).

9.2.8Рангкунӣ: Ба ҳар як чоҳ 50мл маҳлули субстрати А ва 50ул маҳлули субстрати В илова кунед.Табақро дастӣ ларзонда, мулоим омехта кунед ва дар давоми 15 дақиқа дар ҳарорати 25 ℃ бо сарпӯш инкубатсия кунед (ниг. 12.8).

9.2.11Чен кардан: Ба ҳар як чоҳ 50мл маҳлули қатъкунанда илова кунед.Тавассути дастӣ ларзон кардани табақро бо нарм омехта кунед ва абсорбенсро дар 450 нм чен кунед (Ин тавсия дода мешавад, ки дарозии мавҷи дугонаи 450/630 нм чен карда шавад. Натиҷаро дар давоми 5 дақиқа пас аз илова кардани маҳлули таваққуф хонед.)

10 Натиҷаҳо

10.1Фоизи абсорбент

Қиматҳои миёнаи қимматҳои ҷаббида барои стандартҳо ва намунаҳо ба арзиши абсорбенти стандарти якум (стандарти сифр) тақсим карда, ба 100% зарб карда мешаванд.Ҳамин тариқ, стандарти сифр ба 100% баробар карда мешавад ва арзишҳои ҷаббида бо фоизҳо оварда шудаанд.

=

B ——стандарти азхудкунӣ (ё намуна)

В0 ——стандарти сифри азхудкунй

10.2Каҷи стандартӣ

----Барои кашидани каҷи стандартӣ: Қимати ҷаббиши стандартҳоро ҳамчун меҳвари y, нимлогарифмикии консентратсияи маҳлули стандартии AOZ (ppb) ҳамчун меҳвари x гиред.

---- Консентратсияи AOZ-и ҳар як намуна (ppb), ки онро аз каҷи калибрченкунӣ хондан мумкин аст, ба коэффициенти мувофиқи маҳлули ҳар як намунаи пайгирӣ зарб карда мешавад ва консентратсияи воқеии намуна ба даст оварда мешавад.

Лутфан таваҷҷӯҳ намоед:

Барои ҳама кам кардани маълумот нармафзори махсус таҳия шудааст, ки онро мувофиқи дархост пешниҳод кардан мумкин аст.

Омили ҳалкунанда……………………………………………………2

10.Ҳассосият, дақиқ ва дақиқ

Ҳассосият: 0,025 саҳ

Маҳдудияти ошкор:

Бофта (мушак, ҷигар)…………………………0,1ppb

Асал--------------------------------- -0.1ppb

Дақиқӣ:

Бофтаи ҳайвонот (мушакҳо ва ҷигар)…………………100±20%

Асал…………………………………………………….. 100±20%

Дақиқӣ:CV маҷмӯаи ELISA камтар аз 10% аст.

11.Огоҳӣ

12.1 Агар реагентҳо ва намунаҳо то ҳарорати хонагӣ (20-25 ℃) танзим нашуда бошанд, қиматҳои миёнаи қимматҳои ҷаббида барои стандартҳо ва намунаҳо кам карда мешаванд.

12.2 Нагузоред, ки қуттиҳои хурд дар байни қадамҳо хушк шаванд, то аз такрори бомуваффақият канорагирӣ кунед ва қадами ояндаро фавран пас аз ламс кардани дорандаи микрочойкҳо иҷро кунед.

12.3 Пеш аз истифода ҳар як реагентро бодиққат ҷунбонед.

12.4 Пӯсти худро аз маҳлули таваққуф дур нигоҳ доред, зеро он 0,5MH аст₂SO₄ҳалли.

12.5 Маҷмӯаҳои кӯҳнаро истифода набаред.Реагентҳои партияҳои гуногунро иваз накунед, вагарна он ҳассосиятро паст мекунад.

12.6 Ҳолати нигоҳдорӣ: Маҷмӯаҳои ELISA-ро дар ҳарорати 2-8 ℃ нигоҳ доред, ях накунед.Лавҳаҳои хурдро мӯҳр кунед, Дар давоми ҳама инкубатсияҳо аз нурҳои рости офтоб худдорӣ намоед.Пӯшидани лавҳаҳои микротитр тавсия дода мешавад.

12.7 Маҳлули субстрат, агар он рангҳоро гирад, бояд тарк карда шавад.Агар арзиши абсорбент (450/630нм) аз стандарти сифр камтар аз 0,5 (A450nm<0,5) бошад, реагентҳо метавонанд бад шаванд.

12.8 Реаксияи рангкунӣ пас аз илова кардани маҳлули субстрат 15 дақиқа лозим аст;Шумо метавонед вақти инкубатсияро то 20 дақиқа ё бештар аз он дароз кунед, агар ранг барои муайян кардан хеле равшан бошад., ҳеҷ гоҳ аз 25 дақиқа зиёд нашавед. Баръакс, вақти инкубатсияро дуруст кӯтоҳ кунед.

12.9 Ҳарорати оптималии реаксия 25℃ аст.Ҳарорати баланд ё паст боиси тағирёбии арзишҳои ҳассосият ва ҷаббида мегардад.

12.Ҳолати нигоҳдорӣ ва мӯҳлати нигоҳдорӣ

Ҳолати нигоҳдорӣ: 2-8 ℃.

Муҳлати нигоҳдорӣ: 12 моҳ.