ผลิตภัณฑ์

1. 1.พื้นหลัง

ไนโตรฟูแรนเป็นยาปฏิชีวนะในวงกว้างสังเคราะห์ ซึ่งมักใช้ในการผลิตสัตว์เนื่องจากมีคุณสมบัติต้านเชื้อแบคทีเรียและเภสัชจลนศาสตร์ที่ดีเยี่ยมพวกเขายังใช้เป็นสารเร่งการเจริญเติบโตในการผลิตสุกร สัตว์ปีก และสัตว์น้ำในการศึกษาระยะยาวกับสัตว์ทดลองบ่งชี้ว่ายาหลักและเมแทบอไลต์ของยาดังกล่าวแสดงลักษณะสารก่อมะเร็งและการกลายพันธุ์สิ่งนี้นำไปสู่การห้ามใช้ไนโตรฟูแรนสำหรับการรักษาสัตว์ที่ใช้ในการผลิตอาหารยา nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin และ nitrofurazone ถูกห้ามไม่ให้ใช้ในการผลิตอาหารสัตว์ในสหภาพยุโรปในปี 1993 และห้ามใช้ furazolidone ในปี 1995

การวิเคราะห์สารตกค้างของยาไนโตรฟูรานต้องขึ้นอยู่กับการตรวจหาเมแทบอไลต์ที่จับกับเนื้อเยื่อของยาตัวแม่ของไนโตรฟูรานเนื่องจากยาหลักถูกเผาผลาญอย่างรวดเร็วมากและสารเมแทบอไลต์ของไนโตรฟิวแรนที่จับกับเนื้อเยื่อจะคงอยู่เป็นเวลานาน สารเมตาโบไลต์เหล่านี้จึงถูกใช้เป็นเป้าหมายในการตรวจหาการใช้ไนโตรฟิวแรนในทางที่ผิด ซึ่งรวมถึงเมตาโบไลต์ฟูราโซลิโดน (AOZ), เมตาโบไลต์ของฟูราโซลิโดน (AMOZ) ), Nitrofurantoin metabolite (AHD) และ Nitrofurazone metabolite (SEM)

สารตกค้าง AOZ ถูกกำหนดโดยทั่วไปโดย LC-MS หรือ LC-MS/MSการตรวจเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการทางโครมาโตกราฟี แสดงให้เห็นข้อดีอย่างมากเกี่ยวกับความไว ขีดจำกัดการตรวจจับ อุปกรณ์ทางเทคนิค และความต้องการด้านเวลา(ค่าเวลา: 45 นาที)

1. 2.หลักการทดสอบ

ชุด ELISA นี้ออกแบบมาเพื่อตรวจหา AOZ ตามหลักการของอิมมูโนแอสเซย์ของเอนไซม์ที่แข่งขันทางอ้อมหลุมไมโครไทเทอร์ถูกเคลือบด้วยแอนติเจนที่จับกับ BSAAOZ ในตัวอย่างแข่งขันกับแอนติเจนที่เคลือบบนแผ่นไมโครไทเทอร์สำหรับแอนติบอดีที่เติมเข้าไปหลังจากเติมคอนจูเกตของเอนไซม์แล้ว สารตั้งต้นของโครโมนิกจะถูกใช้และวัดสัญญาณด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์การดูดซับจะแปรผกผันกับความเข้มข้นของ AOZ ในตัวอย่าง

1. 3.แอพพลิเคชั่น

ชุดนี้สามารถใช้ในการวิเคราะห์เชิงปริมาณและคุณภาพของสารตกค้าง AOZ ในเนื้อเยื่ออนิมา(กล้ามเนื้อ ตับ ฯลฯ) ที่รัก

1. 4.ปฏิกิริยาข้าม

เมตาโบไลต์ของฟูราโซลิโดน (AOZ)……………………..100%

เมตาโบไลท์ของ Furaltadone (AMOZ) …………………… <0.1%

สาร Nitrofurantoin (AHD) …………………… <0.1%

สารไนโตรฟูราโซน (SEM)…………………...…<0.1%

ฟูราโซลิโดน…………………………………….…..…16.3%

Furaltadone…………………………………………….…<1%

ไนโตรฟูรานโทอิน…………………………………….…….…<1%

ไนโตรฟูราโซน…………………………………………..…<1%

1. 5.วัสดุที่จำเป็น

5.1อุปกรณ์

----เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบแผ่นไมโครไทเทอร์ (450nm/630nm)

---- เครื่องระเหยแบบหมุนหรือเครื่องอบแห้งด้วยไนโตรเจน

----โฮโมจีไนเซอร์/สเตมเมอร์

----เชคเกอร์

---- เครื่องผสมน้ำวน

----เครื่องหมุนเหวี่ยง

----เครื่องชั่งเชิงวิเคราะห์ (ค่าความเหนี่ยวนำ: 0.01g)

----ปิเปตแบบแท่ง: 10ml

----หลอดปิเปตยาง

----กระติกน้ำปริมาตร : 100ml

----กระติกน้ำแก้ว : 10ml

----หลอดหมุนเหวี่ยงโพลีสไตรีน: 2ml, 50ml

----ไมโครปิเปต: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-มัลติปิเปต

5.2รีเอเจนต์

----เอทิลอะซิเตท (AR)

----n-hexane (หรือ n-heptane) (AR)

----ไดโพแทสเซียม ไฮโดรเจน ฟอสเฟต ไตรไฮเดรต

(K₂ฮป₄.3H₂ต) (เออาร์)

----กรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น (HCl, AR)

-----เมทานอล

----โซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH, AR)

---- น้ำปราศจากไอออน

1. 6.ส่วนประกอบชุด

l แผ่น Microtiter เคลือบด้วยแอนติเจน 96 หลุม

l สารละลายมาตรฐาน (6 ขวด 1ml/ขวด)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l การควบคุมมาตรฐาน Spiking : (1ml/ขวด)....….100ppb

l คอนจูเกตเอนไซม์เข้มข้น 1ml……..ฝาแดง

l Enzyme conjugate diluents 10ml………..ฝาเขียว

l สารตั้งต้น A 7ml………................…....…..…..ฝาขาว

l Substrate B 7ml………................…........….…..ฝาสีแดง

l Stop solution 7ml…………………………….ฝาเหลือง

l 20×น้ำยาล้างจานเข้มข้น 40ml

…………………………………….……ฝาใส

l 2×น้ำยาสกัดเข้มข้น 60ml….ฝาสีฟ้า

l 2-ไนโตรเบนซาลดีไฮด์ 15.1 มก.………………ฝาสีขาว

1. 7.การเตรียมรีเอเจนต์

สารละลาย 1: อนุพันธ์รีเอเจนต์:

เติมเมทานอล 10 มล. ลงในขวดที่มี 2-Nitrobenzaldehyde แล้วละลาย(ที่ความเข้มข้น 10mM)

สารละลาย 2: 0.1MK₂ฮป₄สารละลาย:

น้ำหนัก 22.8g K₂ฮป₄.3H₂O ถึง 1L ของน้ำปราศจากไอออนเพื่อละลาย

สารละลาย 3: สารละลาย 1M HCl

ละลายกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น 8.3 มล ด้วยน้ำปราศจากไอออนถึง 100 มล.

แนวทางที่ 4:สารละลาย 1M NaOH

ละลาย NaOH 4 กรัมกับน้ำปราศจากไอออน 100 มล.

วิธีแก้ปัญหา 5: น้ำยาสกัด :

เจือจางสารละลายสกัดเข้มข้น 2× กับน้ำปราศจากไอออนในอัตราส่วนปริมาตร 1:1สารละลายนี้สามารถเก็บรักษาไว้เป็นเวลา 1 เดือนที่อุณหภูมิ 4 ℃ ซึ่งจะใช้ในการสกัดตัวอย่าง

สารละลาย 6: น้ำยาล้าง :

เจือจางน้ำยาล้างจานเข้มข้น 20× กับน้ำปราศจากไอออนในอัตราส่วน 1:19 ซึ่งจะใช้ในการล้างจานสารละลายที่เจือจางนี้สามารถเก็บไว้ได้นาน 1 เดือนที่อุณหภูมิ 4 ℃

1. 8.การเตรียมตัวอย่าง

8.1ประกาศและข้อควรระวังก่อนดำเนินการ:

ก) โปรดใช้ทิปแบบใช้ครั้งเดียวในการทดลอง และเปลี่ยนทิปเมื่อดูดซับรีเอเจนต์ต่างๆ

b) ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเครื่องมือทดลองทั้งหมดสะอาด

c) รีเอเจนต์ที่เป็นอนุพันธ์สามารถอนุรักษ์ได้ที่ 2-8 ℃เป็นเวลาสามเดือน

ง) สารละลาย HCl สามารถเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 เดือน

จ) สารละลาย NaOH สามารถเก็บไว้ได้นาน 3 เดือนที่อุณหภูมิห้อง

f) เก็บตัวอย่างที่ไม่ผ่านการบำบัดไว้ในช่องแช่แข็ง (-20 ℃);

g) ตัวอย่างที่ผ่านการบำบัดสามารถเก็บรักษาไว้เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 2-8 ℃ในความมืด

8.2 ตัวอย่างเนื้อเยื่อและตับของสัตว์:

---- ทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียวกันด้วยโฮโมจิไนเซอร์

----น้ำหนัก 1.0±0.05g ของตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันลงในหลอดปั่นแยกโพลิสไตรีน 50 มล.เติมน้ำปราศจากไอออน 4 มล. สารละลาย 1M HCl 0.5 มล. และรีเอเจนต์อนุพันธ์ 100ul (ดูวิธีแก้ปัญหา 1)เขย่าเป็นเวลา 2 นาที

---- บ่มที่อุณหภูมิ 37 ℃ข้ามคืน (ประมาณ 16 ชม.);

---- เพิ่ม 5ml 0.1MK₂ฮป₄ (สารละลาย2), 0.4ml 1M NaOH (สารละลาย4) และเอทิลอะซีเตต 5 มล.เขย่าอย่างรุนแรงเป็นเวลา 30 วินาที;

---- หมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิห้อง (20-25 ℃) เป็นเวลา 10 นาที อย่างน้อย 3000g;

---- นำเฟสอินทรีย์ส่วนเกิน 2.5 มล. ลงในหลอดแก้วสะอาดขนาด 10 มล. แห้งด้วยก๊าซไนโตรเจน 50-60 ℃หรือเครื่องระเหยแบบหมุน

---- ละลายของแห้งที่เหลือด้วย 1 มล. n-hexane (หรือ n- heptane) กระแสน้ำวนเป็นเวลา 30 วินาที เติมสารละลายสกัด 1 มล. (สารละลาย5), น้ำวน 1 นาที ผสมให้เข้ากัน

---- ปั่นเหวี่ยงที่อุณหภูมิห้อง (20-25^oC) เป็นเวลา 5 นาที อย่างน้อย 3000g;

---- ลบเฟสอินทรีย์ส่วนเกิน;ใช้ 50μl ของเฟสน้ำซับสเตรตสำหรับการทดสอบ

8.4 น้ำผึ้ง

---- ชั่งน้ำหนัก 1.0±0.05g ของตัวอย่างน้ำผึ้งที่ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันลงในหลอดหมุนเหวี่ยงโพลีสไตรีนขนาด 50 มล.

----เติมน้ำปราศจากไอออน 4 มล., 0.5 มล. 1M HCl (สารละลาย3) และรีเอเจนต์อนุพันธ์100μl (สารละลาย1);เขย่าจนสุดเป็นเวลา 2 นาที

---- บ่มที่อุณหภูมิ 37 ℃ข้ามคืน (ประมาณ 16 ชม.);

----เพิ่ม 5ml 0.1MK₂ฮป₄ (สารละลาย2), 0.4ml 1M NaOH (สารละลาย4) และเอทิลอะซิเตต 5 มล. เขย่าแรงๆ เป็นเวลา 30 วินาที

----ปั่นแยกที่อุณหภูมิห้อง (20-25℃) เป็นเวลา 10 นาที อย่างน้อย 3000g;

---- นำเฟสอินทรีย์ส่วนเกิน 2.5 มล. ลงในหลอดแก้วสะอาด 10 มล. แห้งด้วยก๊าซไนโตรเจน 50-60 ℃หรือเครื่องระเหยแบบหมุน

----ละลายของแห้งที่เหลือด้วย 1ml n-hexane (หรือ n-heptane) กระแสน้ำวนเป็นเวลา 30 วินาที เติมสารละลายสกัด 1ml (สารละลาย5), น้ำวน 1 นาที ผสมให้เข้ากัน

----ปั่นแยกที่อุณหภูมิห้อง (20-25^oC) เป็นเวลา 10 นาที อย่างน้อย 3000g;

----ลบเฟสสารอินทรีย์ส่วนเกินออกใช้ 50μl ของเฟสน้ำซับสเตรตสำหรับการทดสอบ

1. 9.กระบวนการทดสอบ

9.1แจ้งให้ทราบล่วงหน้าก่อนการทดสอบ

9.1.1 ตรวจสอบให้แน่ใจว่ารีเอเจนต์และไมโครเวลล์ทั้งหมดอยู่ที่อุณหภูมิห้อง (20-25°C)

9.1.2 คืนรีเอเจนต์ที่เหลือทั้งหมดไปที่ 2-8 ℃ทันทีหลังจากใช้งาน

9.1.3 การล้างไมโครเวลล์อย่างถูกต้องเป็นขั้นตอนที่สำคัญในกระบวนการวิเคราะห์เป็นปัจจัยสำคัญต่อความสามารถในการทำซ้ำของการวิเคราะห์ ELISA

9.1.4 หลีกเลี่ยงแสงและปิดหลุมไมโครระหว่างการบ่ม

9.2 ขั้นตอนการทดสอบ

9.2.1 นำรีเอเจนต์ทั้งหมดออกมาที่อุณหภูมิห้อง (20-25℃) นานกว่า 30 นาที ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันก่อนใช้งาน

9.2.2 นำไมโครเวลล์ที่ต้องการออกและนำส่วนที่เหลือใส่ถุงซิปล็อคทันทีที่อุณหภูมิ 2-8 ℃

9.2.3 ควรอุ่นน้ำยาล้างเข้มข้นและน้ำยาสกัดเข้มข้นให้อยู่ในอุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน

9.2.4ตัวเลข:ระบุหมายเลขตำแหน่งไมโครเวลล์ทุกตำแหน่ง และมาตรฐานและตัวอย่างทั้งหมดควรทำซ้ำกันบันทึกมาตรฐานและตำแหน่งตัวอย่าง

9.2.5การเจือจางสารละลายแอนติบอดีเข้มข้น: เจือจางสารละลายเอนไซม์เข้มข้นด้วยสารเจือจางเอนไซม์คอนจูเกตในอัตราส่วนปริมาตร 1:10 (สารละลายเอนไซม์เข้มข้น 1 เท่า: สารเจือจางเอนไซม์คอนจูเกต 10 เท่า)

9.2.6เติมสารละลายมาตรฐาน/ตัวอย่างและสารละลายคอนจูเกตของเอนไซม์: เติมสารละลายมาตรฐานหรือตัวอย่างที่เตรียมไว้ 50µl ลงในหลุมที่เกี่ยวข้อง เติมสารละลายคอนจูเกตของเอนไซม์ 50µlผสมเบา ๆ โดยการเขย่าจานด้วยมือและบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 25 ℃พร้อมฝาปิด

9.2.7ล้าง: ค่อยๆ ถอดฝาครอบออกแล้วเทของเหลวออกจากหลุม และล้างไมโครเวลด้วยน้ำยาล้างเจือจาง 250µl (สารละลาย6) ในช่วงเวลา 10 วินาทีเป็นเวลา 4-5 ครั้งดูดซับน้ำที่เหลือด้วยกระดาษซับ (สามารถกำจัดฟองอากาศที่เหลือได้ด้วยปลายที่ไม่ได้ใช้)

9.2.8สี: เติมสารละลายซับสเตรต A 50µl และสารละลายซับสเตรต B 50µl ลงในแต่ละหลุมผสมเบา ๆ โดยการโยกจานด้วยมือและบ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 25 ℃ พร้อมฝาปิด (ดูข้อ 12.8)

9.2.11วัด: เติมสารละลายหยุด 50µl ลงในแต่ละหลุมผสมเบา ๆ โดยการโยกจานด้วยมือแล้ววัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร (แนะนำให้วัดด้วยความยาวคลื่นคู่ที่ 450/630 นาโนเมตร อ่านผลภายใน 5 นาทีหลังจากเติมสารละลายหยุด)

10 ผล

10.1เปอร์เซ็นต์การดูดกลืนแสง

ค่าเฉลี่ยของค่าการดูดกลืนแสงที่ได้จากมาตรฐานและตัวอย่างจะหารด้วยค่าการดูดกลืนแสงของมาตรฐานแรก (มาตรฐานศูนย์) และคูณด้วย 100%ดังนั้น ค่ามาตรฐานศูนย์จึงเท่ากับ 100% และค่าการดูดกลืนแสงจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์

=

B —— มาตรฐานการดูดซับ (หรือตัวอย่าง)

B0 —— ค่าการดูดซับเป็นศูนย์มาตรฐาน

10.2เส้นโค้งมาตรฐาน

----ในการวาดเส้นโค้งมาตรฐาน: นำค่าการดูดกลืนแสงของมาตรฐานเป็นแกน y ซึ่งเป็นค่ากึ่งลอการิทึมของความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐาน AOZ (ppb) เป็นแกน x

----ความเข้มข้น AOZ ของแต่ละตัวอย่าง (ppb) ซึ่งสามารถอ่านได้จากเส้นโค้งการสอบเทียบ จะถูกคูณด้วยปัจจัยการเจือจางที่สอดคล้องกันของแต่ละตัวอย่างตามนั้น และจะได้ความเข้มข้นที่แท้จริงของตัวอย่าง

โปรดสังเกต:

ซอฟต์แวร์พิเศษได้รับการพัฒนาสำหรับการลดข้อมูลทั้งหมด ซึ่งสามารถจัดเตรียมให้ตามคำขอ

ปัจจัยการเจือจาง………………………………………..……2

10.ความไว ความแม่นยำ และความแม่นยำ

ความไว: 0.025ppb

ขีดจำกัดการตรวจจับ:

เนื้อเยื่อ (กล้ามเนื้อ ตับ)…………………………0.1ppb

น้ำผึ้ง------------------------------------------------- -0.1ppb

ความแม่นยำ:

เนื้อเยื่อสัตว์ (กล้ามเนื้อและตับ)……...…………100±20%

น้ำผึ้ง………………………………..………….... 100±20%

ความแม่นยำ:CV ของชุด ELISA น้อยกว่า 10%

11.สังเกต

12.1 ค่าเฉลี่ยของค่าการดูดกลืนแสงที่ได้สำหรับมาตรฐานและตัวอย่างจะลดลง ถ้ารีเอเจนต์และตัวอย่างไม่ได้รับการควบคุมที่อุณหภูมิห้อง (20-25°C)

12.2 ห้ามปล่อยให้หลุมขนาดเล็กแห้งระหว่างขั้นตอนต่างๆ เพื่อหลีกเลี่ยงความสามารถในการทำซ้ำที่ไม่สำเร็จ และดำเนินการขั้นตอนต่อไปทันทีหลังจากแตะที่ยึดหลุมขนาดเล็ก

12.3 เขย่าน้ำยาแต่ละตัวเบา ๆ ก่อนใช้

12.4 ระวังผิวหนังของคุณให้ห่างจากสารละลายหยุดเพราะมันคือ 0.5MH₂SO₄สารละลาย.

12.5 อย่าใช้ชุดอุปกรณ์ที่ล้าสมัยอย่าแลกเปลี่ยนรีเอเจนต์ของชุดต่างๆ มิฉะนั้นจะทำให้ความไวลดลง

12.6 สภาพการเก็บรักษา: เก็บชุด ELISA ที่อุณหภูมิ 2-8 ℃ ห้ามแช่แข็งปิดผนึกแผ่นไมโครเวลล์ที่เหลือ หลีกเลี่ยงการถูกแสงแดดโดยตรงระหว่างการบ่มทั้งหมดแนะนำให้ปิดแผ่นไมโครไทเทอร์

12.7 ควรทิ้งสารละลายพื้นผิวหากเปลี่ยนสีรีเอเจนต์อาจเสื่อมสภาพหากค่าการดูดกลืนแสง (450/630nm) ของมาตรฐานศูนย์น้อยกว่า 0.5 (A450nm<0.5)

12.8 ปฏิกิริยาการเกิดสีต้องใช้เวลา 15 นาทีหลังจากเติมสารละลายตั้งต้นคุณสามารถยืดเวลาการบ่มให้นานขึ้นเป็น 20 นาทีหรือมากกว่านั้นหากสีอ่อนเกินไปที่จะกำหนดได้ ห้ามเกิน 25 นาที ในทางกลับกัน ให้ลดระยะเวลาการบ่มให้สั้นลงอย่างเหมาะสม

12.9 อุณหภูมิในการทำปฏิกิริยาที่เหมาะสมคือ 25℃อุณหภูมิที่สูงขึ้นหรือต่ำลงจะทำให้ค่าความไวแสงและค่าการดูดกลืนแสงเปลี่ยนไป

12.สภาพการเก็บรักษาและระยะเวลาการเก็บรักษา

สภาพการเก็บรักษา: 2-8 ℃

ระยะเวลาการเก็บรักษา: 12 เดือน.