produkto

1. 1.Background

Ang Nitrofurans ay sintetikong malawak na spectrum na antibiotic, na kadalasang ginagamit sa produksyon ng hayop para sa mahusay na antibacterial at pharmacokinetic na katangian nito.Ginamit din sila bilang mga promoter ng paglago sa produksyon ng baboy, manok at tubig.Sa pangmatagalang pag-aaral sa mga hayop sa lab, ipinahiwatig na ang mga gamot ng magulang at ang kanilang mga metabolite ay nagpakita ng mga carcinogenic at mutagenic na katangian.Ito ay humantong sa isang pagbabawal ng nitrofurans para sa paggamot ng mga hayop na ginagamit para sa produksyon ng pagkain.Ang mga nitrofuran na gamot na furaltadone, nitrofurantoin at nitrofurazone ay pinagbawalan mula sa paggamit sa produksyon ng mga hayop sa pagkain sa EU noong 1993, at ang paggamit ng furazolidone ay ipinagbabawal noong 1995.

Ang pagsusuri ng mga nitrofuran na nalalabi sa mga gamot ay kailangang batay sa pagtuklas ng mga tissue bound metabolites ng nitrofuran parent na gamot.Dahil ang mga magulang na gamot ay napakabilis na na-metabolize, at ang tissue bound nitrofuran metabolites ay mananatili sa mahabang panahon, ang mga metabolite na ito ay ginagamit bilang target sa pagtuklas ng pang-aabuso ng nitrofurans, na kinabibilangan ng Furazolidone metabolite (AOZ), Furaltadone metabolite (AMOZ). ), Nitrofurantoin metabolite (AHD) at Nitrofurazone metabolite (SEM).

Ang mga AOZ-residu ay kadalasang tinutukoy ng LC-MS o LC-MS/MS.Ang mga enzyme immunoassay, kumpara sa mga chromatographic na pamamaraan, ay nagpapakita ng malaking pakinabang patungkol sa sensitivity, limitasyon sa pagtuklas, teknikal na kagamitan at kinakailangan sa oras.(Gastos sa oras: 45min)

1. 2.Prinsipyo ng Pagsubok

Ang ELISA kit na ito ay idinisenyo upang matukoy ang AOZ batay sa prinsipyo ng indirect-competitive enzyme immunoassay.Ang mga balon ng microtiter ay pinahiran ng capture BSA-linked antigen.Ang AOZ sa sample ay nakikipagkumpitensya sa antigen na pinahiran sa microtiter plate para sa idinagdag na antibody.Pagkatapos ng pagdaragdag ng enzyme conjugate, ang chromogenic substrate ay ginagamit at ang signal ay sinusukat ng isang spectrophotometer.Ang pagsipsip ay inversely proportional sa konsentrasyon ng AOZ sa sample.

1. 3.Mga aplikasyon

Ang kit na ito ay maaaring gamitin sa quantitative at qualitative analysis ng AOZ residue inmga tissue ng anima(kalamnan, atay atbp), pulot.

1. 4.Mga cross-reaksyon

Furazolidone metabolite (AOZ)………………………………..100%

Furaltadone metabolite (AMOZ)……………………<0.1%

Nitrofurantoin metabolite (AHD)……………………<0.1%

Nitrofurazone metabolite (SEM)……………………………<0.1%

Furazolidone…………………………………………………..…16.3%

Furaltadone……………………………………………………<1%

Nitrofurantoin……………………………………………….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………..…<1%

1. 5.Mga Materyales na Kinakailangan

5.1Mga kagamitan

----Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)

----Rotary evaporator o nitrogen drying instruments

----Homogenizer /tiyan

----Kalog

----Vortex mixer

----Centrifuge

----Analytical na balanse (inductance: 0.01g)

----Nagtapos na pipette: 10ml

----Goma pipette bombilya

----Volumetric flask: 100ml

----Glass flask: 10ml

----Polystyrene centrifuge tube: 2ml, 50ml

----Micropipettes: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Mga reagents

----Ethyl acetate (AR)

----n-hexane (o n-heptane) (AR)

----Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Concentrated hydrochloric acid (HCl, AR)

-----Methanol

----Sodium hydroxide (NaOH, AR)

----Deionized na tubig

1. 6.Mga Bahagi ng Kit

l Microtiter plate na pinahiran ng antigen, 96 na balon

l Mga karaniwang solusyon(6 na bote,1ml/bote)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Spiking standard control : (1ml/bote)........100ppb

l Concentrated enzyme conjugate 1ml........pulang takip

l Enzyme conjugate diluents 10ml...........berdeng takip

l Substrate A 7ml……………………………………………………..puting takip

l Substrate B 7ml………………………………………………..pulang takip

l Stop solution 7ml…………………………………dilaw na takip

l 20×concentrated wash solution 40ml

………………………………….……transparent na takip

l 2×concentrated extraction solution 60ml….asul na takip

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg………………white cap

1. 7.Paghahanda ng mga Reagents

Solusyon 1: derivative reagent:

Magdagdag ng 10ml ng methanol sa bote na may 2-Nitrobenzaldehyde at matunaw.(sa konsentrasyon ng 10mM).

Solusyon 2: 0.1MK₂HPO₄solusyon:

Timbang ng 22.8g K₂HPO₄.3H₂O hanggang 1L ng deionized na tubig upang matunaw.

Solusyon 3: 1M HCl solusyon

I-dissolve ang 8.3ml Concentrated hydrochloric acid na may deionized na tubig hanggang 100ml.

Solusyon 4:1M NaOH solusyon

I-dissolve ang 4g NaOH na may 100ml na deionized na tubig.

Solusyon 5: solusyon sa pagkuha:

Dilute ang 2×concentrated extraction solution na may deionized na tubig sa volume ratio na 1:1.Ang solusyon na ito ay maaaring mapanatili sa loob ng 1 buwan sa 4 ℃, na gagamitin sa mga nakuhang sample.

Solusyon 6: solusyon sa paghuhugas:

Dilute ang 20×concentrated wash solution na may deionized na tubig sa dami ng rasyon na 1:19, na gagamitin sa paghuhugas ng mga plato.Ang diluted na solusyon na ito ay maaaring mapanatili sa loob ng 1 buwan sa 4 ℃.

1. 8.Mga Halimbawang Paghahanda

8.1Paunawa at pag-iingat bago ang operasyon:

a) Mangyaring gumamit ng mga one-off na tip sa eksperimento, at baguhin ang mga tip kapag sumisipsip ng ibang reagent.

b) Tiyaking malinis ang lahat ng mga instrumentong pang-eksperimento.

c) ang derivative reagent ay maaaring mapanatili sa 2-8 ℃ sa loob ng tatlong buwan;

d) Ang solusyon ng HCl ay maaaring mapanatili sa temperatura ng silid sa loob ng 3 buwan;

e) Ang solusyon ng NaOH ay maaaring mapanatili sa loob ng 3 buwan sa temperatura ng silid;

f) Panatilihin ang hindi ginagamot na mga sample sa freeze (-20 ℃);

g) Ang mga na-treated na sample ay maaaring i-conserve nang 24h sa 2-8 ℃ sa dilim .

8.2 Mga sample ng tissue at atay ng hayop:

----I-homogenize ang mga sample gamit ang homogenizer;

----Timbang 1.0±0.05g ng homogenized na sample ng tissue sa 50ml polystyrene centrifuge tube.Magdagdag ng 4ml deionized water, 0.5ml 1M HCl solution at 100ul derivative reagent (tingnan ang solusyon 1).Iling ito ng 2min.

---- Incubate sa 37 ℃ magdamag ( mga 16h);

---- Magdagdag ng 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solusyon2), 0.4ml 1M NaOH (solusyon4) at 5ml ethyl acetate.Iling nang malakas sa loob ng 30s;

---- Centrifuge sa temperatura ng silid (20-25 ℃) sa loob ng 10min, hindi bababa sa 3000g;

---- Dalhin ang 2.5ml ng supernatant organic phase sa isang 10ml na malinis na glass tube, tuyo gamit ang 50-60℃ nitrogen gas o rotary evaporator;

---- I-dissolve ang tuyong tira na may 1ml n-hexane (o n-heptane), vortex para sa 30s, magdagdag ng 1ml extraction solution (solusyon5), puyo ng tubig 1min, ihalo nang buo.

---- Centrifuge sa temperatura ng silid (20-25^oC) para sa 5min, hindi bababa sa 3000g;

---- Alisin ang supernatant organic phase;kumuha ng 50μl ng substrate water phase para sa assay.

8.4 Honey

---- timbangin ang 1.0±0.05g ng homogenized honey sample sa isang 50ml polystyrene centrifuge tube;

----Magdagdag ng 4ml deionized na tubig, 0.5ml 1M HCl (solusyon3) at 100μl derivative reagent (solusyon1);iling ganap para sa 2 min;

---- Incubate sa 37 ℃ magdamag ( mga 16h);

----Magdagdag ng 5ml 0.1MK₂HPO₄ (solusyon2), 0.4ml 1M NaOH (solusyon4) at 5ml ethyl acetate, iling nang malakas sa loob ng 30s;

----Centrifuge sa temperatura ng kuwarto (20-25 ℃) para sa 10min, hindi bababa sa 3000g;

----Dalhin ang 2.5ml ng supernatant organic phase sa isang 10ml na malinis na glass tube, tuyo gamit ang 50-60℃ nitrogen gas o rotary evaporator;

----I-dissolve ang tuyong tira na may 1ml n-hexane (o n-heptane), vortex para sa 30s, magdagdag ng 1ml extraction solution (solusyon5), puyo ng tubig 1min, ihalo nang buo.

----Centrifuge sa temperatura ng silid (20-25^oC) para sa 10min, hindi bababa sa 3000g;

----Alisin ang supernatant organic phase;kumuha ng 50μl ng substrate water phase para sa assay.

1. 9.Proseso ng pagsusuri

9.1Pansinin bago ang pagsusuri

9.1.1 Siguraduhin na ang lahat ng reagents at microwell ay nasa temperatura ng kwarto (20-25 ℃).

9.1.2 Ibalik ang lahat ng natitirang reagents sa 2-8 ℃ kaagad pagkatapos gamitin.

9.1.3 Ang wastong paghuhugas ng mga microwell ay isang mahalagang hakbang sa proseso ng pagsusuri;ito ang mahalagang kadahilanan sa muling paggawa ng pagsusuri ng ELISA.

9.1.4 Iwasan ang liwanag at takpan ang mga microwell sa panahon ng pagpapapisa ng itlog.

9.2 Mga Hakbang sa Pagsusuri

9.2.1 Ilabas ang lahat ng reagents sa temperatura ng silid (20-25 ℃) nang higit sa 30min, i-homogenize bago gamitin.

9.2.2 Ilabas ang mga microwell na kailangan at ibalik kaagad ang natitira sa zip-lock bag sa 2-8 ℃.

9.2.3 Ang concentrated wash solution at concentrated extraction solution ay dapat painitin muli upang nasa temperatura ng silid bago gamitin.

9.2.4Numero:Nilagyan ng bilang ang bawat posisyon ng microwell at lahat ng mga pamantayan at sample ay dapat patakbuhin nang doble.Itala ang mga pamantayan at mga sample na posisyon.

9.2.5Dilution ng puro antibody solution: palabnawin ang puro enzyme solution na may enzyme conjugate diluents sa volume ratio na 1:10(1 fold concentrated enzyme solution: 10 folds enzyme conjugate diluents).

9.2.6Magdagdag ng karaniwang solusyon / sample at enzyme conjugate solution: magdagdag ng 50µl ng karaniwang solusyon o inihandang sample sa mga katumbas na balon, magdagdag ng 50µl enzyme conjugate solution.Malumanay na paghaluin sa pamamagitan ng mano-manong pag-alog ng plato at i-incubate ng 30min sa 25 ℃ na may takip.

9.2.7Hugasan: Dahan-dahang tanggalin ang takip at ibuhos ang likido mula sa mga balon at banlawan ang mga microwell ng 250µl na diluted na wash solution (solusyon6) sa pagitan ng 10s para sa 4-5 beses.Sipsipin ang natitirang tubig gamit ang sumisipsip na papel (ang natitirang bula ng hangin ay maaaring alisin gamit ang hindi nagamit na tip).

9.2.8Pangkulay: Magdagdag ng 50µl substrate solution A at 50ul substrate solution B sa bawat balon.Dahan-dahang paghaluin sa pamamagitan ng pag-ikot ng plato nang manu-mano at i-incubate ng 15min sa 25 ℃ na may takip (tingnan ang 12.8).

9.2.11Sukatin: Magdagdag ng 50µl na stop solution sa bawat balon.Dahan-dahang paghaluin sa pamamagitan ng pag-ikot ng plato nang manu-mano at sukatin ang absorbance sa 450nm (Iminungkahi nitong sukatin na may dalawahang wavelength na 450/630nm. Basahin ang resulta sa loob ng 5min pagkatapos magdagdag ng stop solution. )

10 Mga resulta

10.1Porsiyento ng pagsipsip

Ang ibig sabihin ng mga halaga ng absorbance na nakuha para sa mga pamantayan at ang mga sample ay hinati sa halaga ng absorbance ng unang pamantayan (zero standard) at pinarami ng 100%.Ang zero standard ay ginawang katumbas ng 100% at ang mga halaga ng absorbance ay sinipi sa mga porsyento.

=

B ——pamantayang pagsipsip (o sample)

B0 ——absorbance zero standard

10.2Standard Curve

----Upang gumuhit ng karaniwang curve: Kunin ang absorbance value ng mga pamantayan bilang y-axis, semi logarithmic ng konsentrasyon ng AOZ standard solution (ppb) bilang x-axis.

----Ang AOZ na konsentrasyon ng bawat sample (ppb), na mababasa mula sa calibration curve, ay pinarami ng katumbas na dilution factor ng bawat sample na sinusundan, at ang aktwal na konsentrasyon ng sample ay nakuha.

Mangyaring mapansin:

Ang espesyal na software ay binuo para sa lahat ng pagbabawas ng data, na maaaring ibigay kapag hiniling.

Salik ng pagbabanto…………………………………………………2

10.Sensitivity, katumpakan at katumpakan

Pagkamapagdamdam: 0.025ppb

Limitasyon sa pagtuklas:

Tissue (kalamnan, atay)………………………………0.1ppb

Honey------------------------------------------------- -0.1ppb

Katumpakan:

Tissue ng hayop (kalamnan at atay)…………………………100±20%

Honey…………………………………………………… 100±20%

Katumpakan:Ang CV ng ELISA kit ay mas mababa sa 10%.

11.Pansinin

12.1 Ang ibig sabihin ng mga halaga ng mga halaga ng absorbance na nakuha para sa mga pamantayan at ang mga sample ay mababawasan kung ang mga reagents at sample ay hindi na-regulate sa temperatura ng silid ( 20-25 ℃).

12.2 Huwag hayaang matuyo ang mga microwell sa pagitan ng mga hakbang upang maiwasan ang hindi matagumpay na muling paggawa at patakbuhin ang susunod na hakbang kaagad pagkatapos i-tap ang lalagyan ng microwells.

12.3 Malumanay na kalugin ang bawat reagent bago gamitin.

12.4 Ilayo ang iyong balat sa stop solution dahil ito ang 0.5MH₂SO₄solusyon.

12.5 Huwag gamitin ang mga kit na luma na.Huwag ipagpalit ang mga reagents ng iba't ibang mga batch, kung hindi, ibababa nito ang sensitivity.

12.6 Kondisyon sa imbakan: Panatilihin ang ELISA kit sa 2-8 ℃, huwag mag-freeze.Seal rest microwell plates, Iwasan ang direktang sikat ng araw sa lahat ng incubation.Inirerekomenda na takpan ang mga plato ng microtiter.

12.7 Ang substrate na solusyon ay dapat na iwanan kung ito ay nagiging kulay.Ang mga reagents ay maaaring lumala kung ang absorbance value (450/630nm) ng zero standard ay mas mababa sa 0.5 (A450nm<0.5).

12.8 Ang reaksyon ng kulay ay nangangailangan ng 15min pagkatapos ng pagdaragdag ng substrate solution;Maaari mong pahabain ang oras ng pagpapapisa ng itlog sa 20min o higit pa kung ang kulay ay masyadong magaan upang matukoy., huwag lumampas sa 25min. Sa kabilang banda, paikliin ang oras ng pagpapapisa ng itlog nang maayos.

12.9 Ang pinakamainam na temperatura ng reaksyon ay 25 ℃.Ang mas mataas o mas mababang temperatura ay hahantong sa mga pagbabago ng sensitivity at absorbance value.

12.Kondisyon ng imbakan at panahon ng imbakan

Kondisyon ng imbakan: 2-8 ℃.

Panahon ng imbakan: 12 buwan.