ürün

1. 1.Arka fon

Nitrofuranlar, mükemmel antibakteriyel ve farmakokinetik özellikleri nedeniyle hayvansal üretimde sıklıkla kullanılan sentetik geniş spektrumlu antibiyotiklerdir.Ayrıca domuz, kümes hayvanları ve su ürünleri üretiminde büyüme destekleyicileri olarak kullanılmışlardır.Laboratuar hayvanları ile yapılan uzun süreli çalışmalarda, ana ilaçların ve metabolitlerinin kanserojen ve mutajenik özellikler gösterdiği belirtilmiştir.Bu, gıda üretimi için kullanılan hayvanların tedavisinde nitrofuranların yasaklanmasına yol açmıştır.Nitrofuran ilaçları furaltadon, nitrofurantoin ve nitrofurazone 1993 yılında AB'de hayvan yemi üretiminde yasaklandı ve 1995 yılında furazolidon kullanımı yasaklandı.

Nitrofuran ilaç kalıntılarının analizi, nitrofuran ana ilaçların dokuya bağlı metabolitlerinin saptanmasına dayanmalıdır.Ana ilaçlar çok hızlı metabolize olduğundan ve dokuya bağlı nitrofuran metabolitleri uzun süre tutulacağından, Furazolidon metaboliti (AOZ), Furaltadon metaboliti (AMOZ) dahil olmak üzere bu metabolitler, nitrofuranların kötüye kullanımının tespitinde hedef olarak kullanılır. ), Nitrofurantoin metaboliti (AHD) ve Nitrofurazone metaboliti (SEM).

AOZ kalıntıları en yaygın olarak LC-MS veya LC-MS/MS ile belirlenir.Enzim immünoassayleri, kromatografik yöntemlerle karşılaştırıldığında, duyarlılık, tespit limiti, teknik ekipman ve zaman gereksinimi açısından önemli avantajlar göstermektedir.(Zaman maliyeti: 45dk)

1. 2.Test Prensibi

Bu ELISA kiti, indirekt-rekabetçi enzim immunoassay ilkesine dayalı olarak AOZ'yi saptamak için tasarlanmıştır.Mikrotiter oyukları, yakalama BSA bağlantılı antijen ile kaplanır.Numunedeki AOZ, eklenen antikor için mikrotitre plakası üzerinde kaplanmış antijen ile rekabet eder.Enzim konjugatı eklendikten sonra kromojenik substrat kullanılır ve sinyal bir spektrofotometre ile ölçülür.Absorpsiyon, numunedeki AOZ konsantrasyonu ile ters orantılıdır.

1. 3.Uygulamalar

Bu kit, AOZ kalıntısının kantitatif ve kalitatif analizinde kullanılabilir.hayvan dokuları(kas, karaciğer vb), tatlım.

1. 4.çapraz reaksiyonlar

Furazolidon metaboliti (AOZ)……………………..100%

Furaltadon metaboliti (AMOZ)……………………<0,1%

Nitrofurantoin metaboliti (AHD)……………………<0,1%

Nitrofurazon metaboliti (SEM)………………...…<0,1%

Furazolidon…………………………………….…..…%16,3

Furaltadon………………………………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazon…………………………………………..…<1%

1. 5.Gerekli malzemeler

5.1Ekipmanlar

----Mikrotiter plaka spektrofotometresi (450nm/630nm)

---- Döner buharlaştırıcı veya nitrojen kurutma aletleri

----Homojenleştirici/mide açıcı

----Shaker

---- Vorteks karıştırıcı

----Santrifüj

----Analitik terazi (endüktans: 0.01g)

---- Dereceli pipet: 10ml

---- Kauçuk pipet ampulü

---- Hacimsel şişe: 100ml

----Cam şişe: 10ml

----Polistiren santrifüj tüpü: 2ml, 50ml

---- Mikropipetler: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-çoklu pipet

5.2reaktifler

----Etil asetat (AR)

----n-heksan (veya n-heptan) (AR)

---- Dipotasyum hidrojen fosfat trihidrat

(K₂HPO₄.3H₂Ç) (AR)

----Konsantre hidroklorik asit (HCl, AR)

-----Metanol

----Sodyum hidroksit (NaOH, AR)

----Deiyonize su

1. 6.Kit Bileşenleri

l Antijenle kaplanmış mikrotitre plakası, 96 kuyucuk

l Standart çözümler (6 şişe, 1 ml/şişe)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Ekleme standart kontrolü: (1ml/şişe)....….100ppb

l Konsantre enzim konjugatı 1ml...…..kırmızı kapak

l Enzim eşlenik seyrelticiler 10ml………..yeşil kapak

l Substrat A 7ml……………………....…..…..beyaz kapak

l Yüzey B 7ml……………………………….…..kırmızı kapak

l Stop solüsyonu 7ml…………………………sarı kapak

l 20×konsantre yıkama solüsyonu 40ml

…………………………………….……şeffaf kapak

l 2×konsantre ekstraksiyon solüsyonu 60ml….mavi kapak

l 2-Nitrobenzaldehit 15.1mg………………beyaz kapak

1. 7.Reaktiflerin Hazırlanması

Çözüm 1: türev reaktif:

2-Nitrobenzaldehit içeren şişeye 10 ml metanol eklenir ve çözülür.(10 mM konsantrasyonda).

Çözüm 2: 0.1MK₂HPO₄çözüm:

22.8g K ağırlığı₂HPO₄.3H₂0 ila 1 L deiyonize su çözündürülür.

Çözüm 3: 1M HCI çözeltisi

8.3ml Konsantre hidroklorik asidi çözün 100 ml'ye deiyonize su ile.

Çözüm 4:1M NaOH çözeltisi

4g NaOH'yi 100ml deiyonize su ile çözün.

Çözüm 5: ekstraksiyon çözümü:

2xkonsantre ekstraksiyon solüsyonunu 1:1 hacim oranında deiyonize su ile seyreltin.Bu solüsyon 4°C'de 1 ay süreyle saklanabilir ve bu, numuneleri çıkarmak için kullanılacaktır.

Çözüm 6: yıkama solüsyonu:

20×konsantre yıkama solüsyonunu, plakaları yıkamak için kullanılacak olan 1:19 hacim oranında deiyonize suyla seyreltin.Bu seyreltilmiş solüsyon 4°C'de 1 ay saklanabilir.

1. 8.Numune Hazırlamalar

8.1Çalıştırmadan önce uyarı ve önlemler:

a) Lütfen deneyde tek seferlik uçlar kullanın ve farklı reaktifleri emerken uçları değiştirin.

b) Tüm deney aletlerinin temiz olduğundan emin olun.

c) türev reaktifi 2-8°C'de üç ay saklanabilir;

d) HCl solüsyonu oda sıcaklığında 3 ay saklanabilir;

e) NaOH çözeltisi oda sıcaklığında 3 ay saklanabilir;

f) İşlenmemiş numuneleri dondurun (-20°C);

g) İşlem görmüş numuneler karanlıkta 2-8°C'de 24 saat saklanabilir.

8.2 Hayvan dokusu ve karaciğer örnekleri:

----Numuneleri homojenleştirici ile homojenleştirin;

---- 1,0±0,05 g homojenleştirilmiş doku örneğini 50 ml polistiren santrifüj tüpüne koyun.4ml deiyonize su, 0.5ml 1M HCI solüsyonu ve 100ul türev reaktif ekleyin (bkz. solüsyon 1).2 dakika çalkalayın.

---- Gece boyunca 37°C'de inkübe edin (yaklaşık 16 saat);

---- 5ml 0.1MK ekleyin₂HPO₄ (çözüm2), 0.4ml 1M NaOH (çözüm4) ve 5ml etil asetat.30 saniye şiddetle sallayın;

---- Oda sıcaklığında (20-25°C) 10 dakika, en az 3000g santrifüjleyin;

---- Süpernatant organik fazın 2,5 ml'sini 10 ml'lik temiz bir cam tüpe alın, 50-60°C nitrojen gazı veya döner buharlaştırıcı ile kurutun;

---- Kuru kalıntıyı 1 ml n-heksan (veya n-hektan) ile çözün, 30 saniye vorteksleyin, 1 ml ekstraksiyon solüsyonu ekleyin (çözüm5), 1 dakika vorteksleyin, tamamen karıştırın.

---- Oda sıcaklığında santrifüjleyin (20-25^oC) 5 dakika, en az 3000g;

---- Süpernatan organik fazı çıkarın;tahlil için 50μl substrat su fazı alın.

8.4 Bal

---- 1,0±0,05 g homojenleştirilmiş bal örneğini 50 ml'lik bir polistiren santrifüj tüpüne tartın;

----4ml deiyonize su, 0.5ml 1M HCI (çözüm3) ve 100μl türev reaktif (çözüm1);2 dakika tamamen çalkalayın;

---- 37°C'de bir gece inkübe edin (yaklaşık 16 saat);

---- 5ml 0.1MK ekleyin₂HPO₄ (çözüm2), 0.4ml 1M NaOH (çözüm4) ve 5 ml etil asetat, 30 sn şiddetle çalkalayın;

----Oda sıcaklığında (20-25°C) 10 dakika, en az 3000g santrifüjleyin;

---- Süpernatant organik fazın 2,5 ml'sini 10 ml'lik temiz bir cam tüpe alın, 50-60°C nitrojen gazı veya döner buharlaştırıcı ile kurutun;

----Kuru artığı 1 ml n-heksan (veya n-heptan) ile çözün, 30 saniye vorteksleyin, 1 ml ekstraksiyon solüsyonu ekleyin (çözüm5), 1 dakika vorteksleyin, tamamen karıştırın.

----Oda sıcaklığında santrifüjleyin (20-25^oC) 10 dakika, en az 3000g;

----Yüzerdeki organik fazı uzaklaştırın;tahlil için 50μl substrat su fazı alın.

1. 9.Tahlil süreci

9.1Tahlilden önce dikkat edin

9.1.1 Tüm reaktiflerin ve mikrokuyuların oda sıcaklığında (20-25°C) olduğundan emin olun.

9.1.2 Geri kalan tüm reaktifleri kullanımdan hemen sonra 2-8°C'ye getirin.

9.1.3 Mikrokuyuların doğru şekilde yıkanması, tahlil sürecinde önemli bir adımdır;ELISA analizinin tekrarlanabilirliği için hayati bir faktördür.

9.1.4 Işıktan kaçının ve inkübasyon sırasında mikrokuyucukları kapatın.

9.2 Tahlil Adımları

9.2.1 Tüm reaktifleri oda sıcaklığında (20-25°C) 30 dakikadan fazla çıkarın, kullanmadan önce homojenleştirin.

9.2.2 Gerekli mikrokuyucukları çıkarın ve geri kalanını hemen 2-8°C'de fermuarlı poşete koyun.

9.2.3 Konsantre yıkama solüsyonu ve konsantre ekstraksiyon solüsyonu kullanımdan önce oda sıcaklığına gelmesi için yeniden ısıtılmalıdır.

9.2.4Sayı:Her mikrokuyu pozisyonu numaralandırılır ve tüm standartlar ve numuneler iki kopya halinde çalıştırılmalıdır.Standartları ve numune konumlarını kaydedin.

9.2.5Konsantre antikor çözeltisinin seyreltilmesi: Konsantre enzim solüsyonunu enzim konjugat seyrelticilerle 1:10 hacim oranında seyreltin (1 kat konsantre enzim solüsyonu: 10 kat enzim konjugat seyreltici).

9.2.6Standart solüsyon / numune ve enzim konjugat solüsyonu ekleyin: karşılık gelen kuyucuklara 50µl standart solüsyon veya hazırlanmış numune ekleyin, 50µl enzim konjugat solüsyonu ekleyin.Plakayı elle sallayarak hafifçe karıştırın ve 30 dakika 25°C'de kapakla inkübe edin.

9.2.7Yıkamak: Kapağı yavaşça çıkarın ve kuyucuklardaki sıvıyı boşaltın ve mikrokuyucukları 250µl seyreltilmiş yıkama solüsyonu ile durulayın (çözüm6) 4-5 kez 10 sn aralıklarla.Artık suyu emici kağıtla emdirin (kalan hava kabarcığı kullanılmayan uç ile giderilebilir).

9.2.8renklendirme: Her kuyucuğa 50ul substrat solüsyonu A ve 50ul substrat solüsyonu B ekleyin.Plakayı elle sallayarak hafifçe karıştırın ve 25°C'de kapakla birlikte 15 dakika inkübe edin (bkz. 12.8).

9.2.11Ölçüm: Her kuyucuğa 50µl stop solüsyonu ekleyin.Plakayı manuel olarak sallayarak hafifçe karıştırın ve 450nm'de absorbansı ölçün (450/630nm'lik çift dalga boyu ile ölçüm önerilir. Durdurma solüsyonu eklendikten sonra sonucu 5 dakika içinde okuyun.)

10 Sonuçlar

10.1Yüzde absorbans

Standartlar ve numuneler için elde edilen absorbans değerlerinin ortalama değerleri birinci standardın (sıfır standart) absorbans değerine bölünerek %100 ile çarpılır.Böylece sıfır standardı %100'e eşit yapılır ve soğurma değerleri yüzde olarak belirtilir.

=

B ——absorbans standardı (veya numune)

B0 ——absorbans sıfır standardı

10.2Standart eğri

----Standart bir eğri çizmek için: Standartların absorbans değerini y ekseni olarak, AOZ standart çözeltisinin (ppb) konsantrasyonunun yarı logaritmik x ekseni olarak alın.

---- Kalibrasyon eğrisinden okunabilen her numunenin AOZ konsantrasyonu (ppb), takip edilen her numunenin karşılık gelen seyreltme faktörü ile çarpılır ve numunenin gerçek konsantrasyonu elde edilir.

Lutfen dikkat ediniz:

Talep üzerine sağlanabilen tüm veri azaltma için özel yazılım geliştirilmiştir.

Seyreltme faktörü………………………………………..……2

10.Hassasiyet, doğruluk ve kesinlik

Duyarlılık: 0,025ppb

Algılama sınırı:

Doku (kas, karaciğer)…………………………0.1ppb

Bal------------------------------------------------- -0.1ppb

Kesinlik:

Hayvan dokusu (kas ve karaciğer)……...…………100±20%

Tatlım………………………………..………….... %100±20

Hassas:ELISA kitinin CV'si %10'dan az.

11.Farkına varmak

12.1 Standartlar ve numuneler için elde edilen absorbans değerlerinin ortalama değerleri, reaktifler ve numuneler oda sıcaklığına (20-25°C) ayarlanmamışsa düşecektir.

12.2 Başarısız tekrarlanabilirliği önlemek için mikrokuyuların adımlar arasında kurumasına izin vermeyin ve mikrokuyu tutucuya dokunduktan hemen sonra bir sonraki adımı çalıştırın.

12.3 Kullanmadan önce her reaktifi hafifçe çalkalayın.

12.4 0.5MH olduğu için cildinizi stop solüsyonundan uzak tutun₂SO₄çözüm.

12.5 Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın.Farklı partilerin reaktiflerini değiştirmeyin, aksi takdirde hassasiyet düşer.

12.6 Saklama koşulu: ELISA kitlerini 2-8°C'de tutun, dondurmayın.Dinlenme mikrokuyu plakalarını kapatın, Tüm inkübasyonlar sırasında doğrudan güneş ışığından kaçının.Mikrotitre plakalarının kaplanması tavsiye edilir.

12.7 Yüzey solüsyonu renk değiştirirse bırakılmalıdır.Sıfır standardının absorbans değeri (450/630nm) 0,5'ten (A450nm<0,5) düşükse reaktifler bozulabilir.

12.8 Renklenme reaksiyonu, substrat solüsyonunun eklenmesinden sonra 15 dakikaya ihtiyaç duyar;Kuluçka süresini 20 dakika veya daha fazla uzatabilirsiniz, renk belirlenemeyecek kadar açıksa, asla 25 dakikayı geçmeyin. Aksine, kuluçka süresini uygun şekilde kısaltın.

12.9 Optimum reaksiyon sıcaklığı 25°C'dir.Daha yüksek veya daha düşük sıcaklık, hassasiyet ve absorbans değerlerinin değişmesine yol açacaktır.

12.Saklama koşulu ve saklama süresi

Saklama koşulu: 2-8°C.

Depolama süresi: 12 ay.