продукт

1. 1.Фон

Нитрофураннар - синтетик киң спектрлы антибиотиклар, алар бик яхшы антибактериаль һәм фармакокинетик үзенчәлекләре өчен хайваннар җитештерүдә кулланыла.Алар шулай ук ​​дуңгыз, кошчылык һәм су җитештерүдә үсешне пропагандалаучы буларак кулланылганнар.Лаборатория хайваннары белән озак вакытлы тикшеренүләр күрсәткәнчә, төп препаратлар һәм аларның метаболитлары карсиноген һәм мутагеник үзенчәлекләрне күрсәткән.Бу азык җитештерү өчен кулланылган хайваннарны дәвалау өчен нитрофураннарны тыюга китерде.Нитрофуран препаратлары фуралтадон, нитрофурантоин һәм нитрофуразон 1993 елда Европа Берлегендә азык хайваннары җитештерүдә тыелган, һәм 1995-нче елда фуразолидон куллану тыелган.

Нитрофуран препаратларының калдыкларын анализлау нитрофуран ата-аналарының препаратларының тукымалар белән бәйләнгән метаболитларын ачыклауга нигезләнергә тиеш.Ата-аналар препаратлары бик тиз метаболизацияләнә, һәм тукымалар белән бәйләнгән нитрофуран метаболитлары озак сакланачак, бу метаболитлар Нитрофураннарны куллануны ачыклауда кулланыла, алар арасында Фуразолидон метаболиты (AOZ), Фуралтадон метаболиты (AMOZ) бар. ), Нитрофурантоин метаболиты (AHD) һәм Нитрофуразон метаболиты (SEM).

AOZ калдыклары гадәттә LC-MS яки LC-MS / MS белән билгеләнә.Фермент иммуноассалары, хроматографик ысуллар белән чагыштырганда, сизгерлек, ачыклау лимиты, техник җиһаз һәм вакыт таләпләренә карата зур өстенлекләрне күрсәтәләр.(Вакыт бәясе: 45мин)

1. 2.Тест принцибы

Бу ELISA комплекты турыдан-туры көндәшлеккә сәләтле фермент иммуноассай принцибы нигезендә AOZны ачыклау өчен эшләнгән.Микротитер скважиналары BSA белән бәйләнгән антиген белән капланган.AOZ үрнәгендә кушылган антитела өчен микротитер тәлинкәсендә капланган антиген белән ярыша.Ферм конжугаты кушылганнан соң, хромоген субстрат кулланыла һәм сигнал спектропотометр белән үлчәнә.Сүндерү үрнәктә AOZ концентрациясенә капма-каршы пропорциональ.

1. 3.Кушымталар

Бу комплект AOZ калдыкларын сан һәм сыйфат анализында кулланырга мөмкинанима тукымалары(мускул, бавыр һ.б.), бал.

1. 4.Кросс реакцияләр

Фуразолидон метаболиты (AOZ) …………………… ..100%

Фуралтадон метаболиты (AMOZ) …………………… <0,1%

Нитрофурантоин метаболиты (AHD) …………………… <0,1%

Нитрофуразон метаболиты (SEM) ………………… ...… <0,1%

Фуразолидон …………………………………….… ..… 16,3%

Фуралтадон ……………………………………….… <1%

Нитрофурантоин ……………………………………. …….… <1%

Нитрофуразон …………………………………… ..… <1%

1. 5.Материаллар кирәк

5.1Equиһазлар

---- Микротитер тәлинкә спектропотометры (450нм / 630нм)

---- Әйләнүче парга әйләндергеч яки азот киптерү кораллары

---- Гомогенизатор / стомахер

---- Шейкер

---- Вортекс миксеры

---- Centентрифуга

---- Аналитик баланс (индуктивлык: 0.01г)

---- Чыгарылган пипетка: 10мл

---- Резина пипетка лампасы

---- Күләмле фласс: 100мл

---- Пыяла савыт: 10мл

---- Полистирол центрифуга трубасы: 2мл, 50мл

---- Микропипетлар: 20ул-200ул, 100ул-1000ул,

250ул-мультипипетта

5.2Реагентлар

---- Этил asetat (AR)

---- n-гексан (яки n-гептан) (AR)

---- Дипотасий водород фосфат трихидрат

(K₂HPO₄.3Х₂O) (AR)

---- Концентрацияләнгән гидрохлор кислотасы (HCl, AR)

----- Метанол

---- Натрий гидроксиды (NaOH, AR)

---- Дионлаштырылган су

1. 6.Комплект компонентлары

l Микротитер тәлинкәсе антиген белән капланган, 96 кое

l Стандарт карарлар (6 шешә, 1мл / шешә)

0ppb, 0.025ppb, 0.075ppb, 0.225ppb, 0.675ppb, 2.025ppb

l Стандарт контроль: (1мл / шешә) ....….100ppb

l Концентрат фермент конжугаты 1мл ...… ..ред капка

l Фермент коньугат эремчекләре 10мл ……… .. яшел капка

l 7мл субстрат ……… ..............… ....… ..… .. ак капка

l В 7мл субстрат ……… ..............… ........….… ..ред капка

l 7мл чишелешне туктатыгыз …………………………… сары капка

l 20 × концентрацияләнгән юу эремәсе 40мл

……………………………………. …… ачык капка

l 2 × концентрацияләнгән чыгару эремәсе 60мл…

l 2-Нитробензальдегид 15.1мг ……………… ак капка

1. 7.Реагентлар әзерләү

Чишелеш 1: тудыргыч реагент:

2-Нитробензалдегид булган шешәгә 10мл метанол кушыгыз һәм эрегез.(10мМ концентрациясендә).

Чишелеш 2: 0,1МК₂HPO₄чишелеш:

Авырлыгы 22,8г К.₂HPO₄.3Х₂Одан 1Л деонизацияләнгән су эрер өчен.

Чишелеш 3: 1M HCl чишелеше

8.3мл концентрат гидрохлор кислотасын эрегез деонизацияләнгән су белән 100мл.

Чишелеш 4:1M NaOH чишелеше

4м NaOHны 100мл деонизацияләнгән су белән эрегез.

Чишелеш 5: чыгару чишелеше:

2 × концентрацияләнгән чыгару эремәсен 1: 1 күләмендә деонизацияләнгән су белән эретегез.Бу чишелеш 1 айга 4 at сакланырга мөмкин, ул алынган үрнәкләр өчен кулланылачак.

Чишелеш 6: юу эремәсе:

Тәлинкәләрне юу өчен кулланылачак 20 × концентрацияләнгән юу эремәсен 1:19 күләмендәге рационда деонизацияләнгән су белән эретегез.Бу эретелгән эремә 1 айда 4 at сакланырга мөмкин.

1. 8.Ampleрнәк әзерлек

8.1Эш алдыннан искәрмәләр һәм саклык чаралары:

а) Зинһар, экспериментта бер тапкыр бирелгән киңәшләрне кулланыгыз, төрле реагентны сеңдергәндә киңәшләрне үзгәртегез.

б) Барлык эксперимент коралларының да чиста булуына инаныгыз.

в) туем реагенты 3-8 ай эчендә 2-8 at сакланырга мөмкин;

г) HCl эремәсе бүлмә температурасында 3 ай сакланырга мөмкин;

д) NaOH эремәсе 3 ай бүлмә температурасында сакланырга мөмкин;

е) эшкәртелмәгән үрнәкләрне туңдырмада саклагыз (-20 ℃);

g) эшкәртелгән үрнәкләр караңгыда 2-8 at тә 24 сәгатькә сакланырга мөмкин.

8.2 Хайваннар тукымасы һәм бавыр үрнәкләре:

---- Гомогенизатор белән үрнәкләрне гомогенизацияләгез;

---- Гомогенизацияләнгән тукыманың 1,0 ± 0,05г авырлыгы 50мл полистирол центрифуга трубасына.4мл деонизацияләнгән су, 0,5мл 1М HCl эремәсе һәм 100ул туемлы реагент өстәргә (1 чишелешне карагыз).2 минутка селкетегез.

---- Төнлә 37 at инкубация (якынча 16с);

---- 5мл 0,1МК өстәргә₂HPO₄ (чишелеш2), 0,4мл 1М NaOH (чишелеш4) һәм 5мл этил asetat.30-нчы елларга каты селкетегез;

---- 10 минут эчендә бүлмә температурасында центрифуга (20-25 ℃), ким дигәндә 3000г;

---- 2,5мл гадәттән тыш органик фазаны 10мл чиста пыяла торбага алыгыз, 50-60 ℃ азот газы яки әйләнүче парга әйләндерегез;

---- Коры калдыкны 1мл n-гексан (яки n- гептан) белән эретегез, 30-нчы ел өчен вортекс, 1мл чыгару эремәсе кушыгыз (чишелеш5), вортекс 1мин, тулысынча кушыгыз.

---- Бүлмә температурасында центрифуга (20-25^oВ) 5 минутка, ким дигәндә 3000г;

---- Гадәттән тыш органик фазаны бетерегез;анализ өчен субстрат су фазасының 50μл алыгыз.

8.4 Бал

---- авырлыгы 1,0 ± 0,05г гомогенизацияләнгән бал үрнәген 50мл полистирол центрифуга трубасына салыгыз;

---- 4мл деонизацияләнгән су өстәргә, 0,5мл 1М HCl (чишелеш3) һәм 100μл туемлы реагент (чишелеш1);2 минутка тулысынча селкетү;

---- Төнлә 37 at инкубация (якынча 16с);

---- 5мл 0,1МК өстәргә₂HPO₄ (чишелеш2), 0,4мл 1М NaOH (чишелеш4) һәм 5мл этил asetat, 30-нчы елларга каты селкетегез;

---- 10 минут эчендә бүлмә температурасында центрифуга (20-25 ℃), ким дигәндә 3000г;

---- 2,5мл гадәттән тыш органик фазаны 10мл чиста пыяла торбага алыгыз, 50-60 ℃ азот газы яки әйләнүче парга әйләндерегез;

---- Коры калдыкны 1мл n-гексан (яки n- гептан) белән эретегез, 30-нчы ел өчен вортекс, 1мл чыгару эремәсе кушыгыз (чишелеш5), вортекс 1мин, тулысынча кушыгыз.

---- Бүлмә температурасында центрифуга (20-25^oВ) 10 минутка, ким дигәндә 3000г;

---- Гадәттән тыш органик фазаны бетерегез;анализ өчен субстрат су фазасының 50μл алыгыз.

1. 9.Тикшерү процессы

9.1Анализ алдыннан игътибар итегез

9.1.1 Барлык реагентлар һәм микродулкыннар бүлмә температурасында булуына инаныгыз (20-25 ℃).

9.1.2 Калган барлык реагентларны кулланганнан соң 2-8 toгә кайтарыгыз.

9.1.3 Микроэлементларны дөрес юу - анализлау процессында мөһим адым;ул ELISA анализының репродуктивлыгы өчен мөһим фактор.

9.1.4 Яктылыктан сакланыгыз һәм инкубация вакытында микродулкыннарны каплагыз.

9.2

9.2.1 Барлык реагентларны бүлмә температурасында (20-25 ℃) 30 минуттан артык алыгыз, кулланганчы гомогенизацияләгез.

9.2.2 Микроэлементларны чыгарып, калганнарын шунда ук 2-8 at капчык капчыгына кайтарыгыз.

9.2.3 Концентрацияләнгән юу эремәсе һәм концентрацияләнгән чыгару эремәсе куллану алдыннан бүлмә температурасында булырга тиеш.

9.2.4Сан:Micәр микроэлемтә позициясе номерланган, барлык стандартлар һәм үрнәкләр икеләтә эшләнергә тиеш.Стандартларны һәм үрнәк позицияләрен язып алыгыз.

9.2.5Концентрацияләнгән антитела эремәсен эретү: концентрацияләнгән фермент эремәсен 1:10 күләмендә фермент коньжуат эремәләре белән эретегез (1 тапкыр концентрацияләнгән фермент эремәсе: 10 тапкыр фермент конжугат эремәләре).

9.2.6Стандарт чишелеш / үрнәк һәм фермент коньугат эремәсе өстәргә: тиешле скважиналарга 50µл стандарт эремә яки әзерләнгән үрнәк өстәргә, 50µл фермент коньжуат эремәсе өстәргә.Тәлинкәне кул белән селкетеп йомшак кына кушыгыз һәм 30 минутка 25 at каплагыз.

9.2.7Washу: Капкачны йомшак кына алып, сыеклыкны коедан куегыз һәм микроэлемтәләрне 250µл эретелгән юу эремәсе белән юыгыз (чишелеш6) 10с аралыгында 4-5 тапкыр.Калдык суны сеңдергеч кәгазь белән сеңдерегез (калган һава күпере кулланылмаган оч белән бетерелергә мөмкин).

9.2.8Төсләр: Eachәр скважинага 50µл субстрат эремәсе А һәм 50ул субстрат эремәсе кушыгыз.Тәлинкәне кул белән селкетеп, йомшак кына катнашыгыз һәм 15 минутта 25 at каплагыз (12,8 карагыз).

9.2.11Asureлчәү: Eachәр скважинага тукталыш чишелешен 50µл кушыгыз.Тәлинкәне кул белән селкетеп йомшак кына кушыгыз һәм сеңдерүне 450нм үлчәгез (Бу ике дулкын озынлыгы 450 / 630нм белән үлчәргә тәкъдим итте. Нәтиҗәне туктау эремәсе кушылганнан соң 5 минут эчендә укыгыз.)

10 Нәтиҗәләр

10.1Процент үзләштерү

Стандартлар һәм үрнәкләр өчен алынган үзләштерү кыйммәтләренең уртача кыйммәтләре беренче стандартның (нуль стандарты) үзләштерү кыйммәтенә бүленә һәм 100% ка тапкырлана.Нуль стандарты шулай итеп 100% тәшкил итә һәм үзләштерү кыйммәтләре процентларда китерелә.

=

В —— абсорбция стандарты (яки үрнәк)

B0 —— абсорбанс нуль стандарты

10.2Стандарт сызык

---- Стандарт сызык сызу өчен: стандартларның үзләштерү кыйммәтен y күчәре итеп алыгыз, AOZ стандарт эремәсе концентрациясенең ярым логарифмикасын (ppb) х күчәре итеп алыгыз.

---- Калибрлау сызыгыннан укып була торган һәр үрнәкнең AOZ концентрациясе, һәрбер үрнәкнең тиешле эретү факторы белән тапкырлана, һәм үрнәкнең концентрациясе алына.

Зинһар, игътибар итегез:

Барлык мәгълүматны киметү өчен махсус программа эшләнде, алар сорау буенча бирелә ала.

Эретү факторы………………………………… .. …… 2

10.Сәнгатьчәнлек, төгәллек һәм төгәллек

Сәнгатьчәнлек: 0.025ppb

Ачыклау лимиты:

Кисем (мускул, бавыр) ………………………… 0.1ppb

Бал ------------------------------------------------- -0.1ppb

Төгәллек:

Хайван тукымасы (мускул һәм бавыр) …… ... ………… 100 ± 20%

Бал ……………………………… .. ………… .... 100 ± 20%

Төгәллек:ELISA комплектының резюме 10% тан кимрәк.

11.Игътибар итегез

12.1 Стандартлар һәм үрнәкләр өчен алынган үзләштерү кыйммәтләренең уртача кыйммәтләре реагентлар һәм үрнәкләр бүлмә температурасына көйләнмәгән булса (20-25 ℃) кимиячәк.

12.

12.3 useәр реагентны кулланганчы әкрен генә селкетегез.

12.4 Тереңне тукталыш эремәсеннән ерак тот, чөнки ул 0,5МХ₂SO₄чишелеш.

12.5 Комплектларны искермәгез.Төрле партияләрнең реагентларын алыштырмагыз, югыйсә ул сизгерлекне төшерер.

12.6 Саклау торышы: ELISA комплектларын 2-8 at саклагыз, туңмагыз.Ял микродулкынлы плиталарны мөһерләгез, барлык инкубация вакытында туры кояш нурларыннан сакланыгыз.Микротитер тәлинкәләрен капларга киңәш ителә.

12.7 Субстрат эремәсе төскә әйләнсә, ташланырга тиеш.Әгәр дә нуль стандартының үзләштерү бәясе (450 / 630nm) 0,5 (A450nm <0,5) ким булса, реагентлар начарланырга мөмкин.

12.8 Төсле реакция субстрат эремәсе кушылганнан соң 15мин.Әгәр дә төс билгесез булса, инкубация вакытын 20мин яки аннан да озайта аласыз.

12.9 Оптималь реакция температурасы 25 is.Higherгары яки түбән температура сизгерлек һәм сеңдерү кыйммәтләренең үзгәрүенә китерәчәк.

12.Саклау торышы һәм саклау вакыты

Саклау торышы: 2-8 ℃.

Саклау вакыты: 12 ай.