продукт

1. 1.Фон

Нітрофурани є синтетичними антибіотиками широкого спектру дії, які часто використовуються у тваринництві завдяки своїм відмінним антибактеріальним і фармакокінетичним властивостям.Вони також використовувалися як стимулятори росту у свинарстві, птахівництві та водному виробництві.Довгі дослідження на лабораторних тваринах показали, що вихідні препарати та їхні метаболіти мають канцерогенні та мутагенні властивості.Це призвело до заборони нітрофуранів для лікування тварин, які використовуються для виробництва продуктів харчування.Нітрофуранові препарати фуралтадон, нітрофурантоїн і нітрофуразон були заборонені до використання в харчовому тваринництві в ЄС у 1993 році, а використання фуразолідону було заборонено в 1995 році.

Аналіз залишків нітрофуранових лікарських засобів повинен ґрунтуватися на виявленні зв’язаних із тканинами метаболітів вихідних нітрофуранових лікарських засобів.Оскільки вихідні препарати дуже швидко метаболізуються, а зв’язані з тканинами метаболіти нітрофурану зберігаються протягом тривалого часу, ці метаболіти використовуються як мішень для виявлення зловживання нітрофуранами, які включають метаболіт фуразолідону (AOZ), метаболіт фуралтадону (AMOZ). ), метаболіт нітрофурантоїну (AHD) і метаболіт нітрофуразону (SEM).

Залишки AOZ визначають найчастіше методом LC-MS або LC-MS/MS.Імуноферментні аналізи порівняно з хроматографічними методами демонструють значні переваги щодо чутливості, межі виявлення, технічного оснащення та вимог часу.(Вартість часу: 45 хв.)

1. 2.Принцип тестування

Цей набір ELISA призначений для виявлення AOZ на основі принципу непрямо-конкурентного імуноферментного аналізу.Лунки мікротитратора покриті антигеном, пов’язаним із BSA.AOZ у зразку конкурує з антигеном, покритим пластиною для мікротитрації, за додане антитіло.Після додавання ферментного кон'югату використовують хромогенний субстрат і сигнал вимірюють спектрофотометром.Поглинання обернено пропорційне концентрації AOZ у зразку.

1. 3.Додатки

Цей набір можна використовувати для кількісного та якісного аналізу залишків AOZ втваринні тканини(м'язи, печінка тощо), мед.

1. 4.Перехресні реакції

Метаболіт фуразолідону (AOZ)……………………..100%

Метаболіт фуралтадону (AMOZ)……………………<0,1%

Метаболіт нітрофурантоїну (AHD)……………………<0,1%

Метаболіт нітрофуразону (SEM)…………………...…<0,1%

Фуразолідон……………………………………….…..…16,3%

Фуралтадон…………………………………………….…<1%

Нітрофурантоїн……………………………………….…….…<1%

Нітрофуразон…………………………………………..…<1%

1. 5.Необхідні матеріали

5.1Обладнання

----Спектрофотометр мікротитраційної пластини (450 нм/630 нм)

---- Ротаційний випарник або прилади для сушіння азотом

----Гомогенізатор / стомашник

----Шейкер

----Вихровий змішувач

---- Центрифуга

----Аналітичні ваги (індуктивність: 0,01 г)

---- Градуйована піпетка: 10 мл

----Гумова піпетка

---- Мірна колба: 100 мл

---- Скляна колба: 10 мл

---- Полістирольна центрифужна пробірка: 2 мл, 50 мл

---- Мікропіпетки: 20 мкл-200 мкл, 100 мкл-1000 мкл,

250 мкл-мультипіпетка

5.2Реагенти

----Етилацетат (AR)

---- н-гексан (або н-гептан) (AR)

---- Дикалію гідрофосфат тригідрат

(K₂HPO₄.3H₂O) (AR)

----Концентрована соляна кислота (HCl, AR)

-----Метанол

----Натрій гідроксид (NaOH, АР)

----Деіонізована вода

1. 6.Компоненти набору

l Мікропланшет, покритий антигеном, 96 лунок

l Стандартні розчини (6 пляшок, 1 мл/пляшка)

0ppb,0,025ppb,0,075ppb,0,225ppb,0,675ppb,2,025ppb

l Стандартний контроль: (1 мл/пляшка)....….100ppb

l Концентрований ензимний кон'югат 1 мл.......червоний ковпачок

l Розріджувачі ферментного кон’югату 10 мл………..зелений ковпачок

l Субстрат A 7 мл………..............…....…..…..білий ковпачок

l Субстрат B 7 мл………............................………….…..червоний ковпачок

l Стоп розчин 7 мл……………………………жовтий ковпачок

l 20×концентрований миючий розчин 40 мл

…………………………………….……прозорий ковпачок

l 2 × концентрований екстракційний розчин 60 мл… синя кришка

l 2-нітробензальдегід 15,1 мг………………білий ковпачок

1. 7.Приготування реагентів

Рішення 1: похідний реагент:

Додайте 10 мл метанолу в пляшку з 2-нітробензальдегідом і розчиніть.(у концентрації 10мМ).

Рішення 2: 0,1МК₂HPO₄рішення:

Вага 22,8 г K₂HPO₄.3H₂O до 1 л деіонізованої води для розчинення.

Рішення 3: 1М розчин HCl

Розчиніть 8,3 мл концентрованої соляної кислоти з деіонізованою водою до 100 мл.

Рішення 4:1М розчин NaOH

Розчиніть 4 г NaOH у 100 мл деіонізованої води.

Рішення 5: екстракційний розчин:

Розведіть 2× концентрований екстракційний розчин деіонізованою водою в об’ємному співвідношенні 1:1.Цей розчин можна зберігати протягом 1 місяця при 4 ℃, який буде використано для вилучення зразків.

Рішення 6: промивний розчин:

Розведіть 20× концентрований промивний розчин деіонізованою водою в об’ємному співвідношенні 1:19, який буде використовуватися для промивання пластин.Цей розведений розчин можна зберігати протягом 1 місяця при 4 ℃.

1. 8.Приготування зразків

8.1Примітка та запобіжні заходи перед початком роботи:

a) Будь ласка, використовуйте одноразові наконечники в експерименті та змінюйте наконечники під час поглинання іншого реагенту.

b) Переконайтеся, що всі експериментальні інструменти чисті.

c) похідний реагент можна зберігати при 2-8 ℃ протягом трьох місяців;

г) Розчин HCl можна зберігати при кімнатній температурі протягом 3 місяців;

д) Розчин NaOH можна зберігати 3 місяці при кімнатній температурі;

f) Зберігайте необроблені зразки в замороженому стані (-20 ℃);

g) Оброблені зразки можна зберігати протягом 24 годин при 2-8 ℃ у темряві.

8.2 Зразки тканин і печінки тварин:

---- Гомогенізуйте зразки гомогенізатором;

---- Зважте 1,0±0,05 г гомогенізованого зразка тканини в полістирольну центрифужну пробірку на 50 мл.Додайте 4 мл деіонізованої води, 0,5 мл 1 М розчину HCl і 100 мкл похідного реагенту (див. розчин 1).Струсіть протягом 2 хв.

---- Інкубуйте при 37 ℃ протягом ночі (приблизно 16 годин);

---- Додайте 5мл 0,1МК₂HPO₄ (рішення2), 0,4 мл 1М NaOH (рішення4) і 5 мл етилацетату.Сильно струшуйте протягом 30 секунд;

---- Центрифуга при кімнатній температурі (20-25 ℃) протягом 10 хвилин, принаймні 3000 г;

---- Візьміть 2,5 мл супернатанту органічної фази в чисту скляну пробірку на 10 мл, висушіть газоподібним азотом при 50-60 ℃ або на роторному випарнику;

---- Розчиніть сухий залишок 1 мл н-гексану (або н-гептану), перемішайте протягом 30 секунд, додайте 1 мл екстракційного розчину (рішення5), перемішайте протягом 1 хвилини, повністю перемішайте.

---- Центрифуга при кімнатній температурі (20-25^oВ) протягом 5 хв не менше 3000 г;

---- Видаліть надосадову органічну фазу;візьміть 50 мкл водної фази субстрату для аналізу.

8.4 Мед

---- зважте 1,0±0,05 г гомогенізованого зразка меду в центрифужну пробірку з полістиролу на 50 мл;

---- Додайте 4 мл деіонізованої води, 0,5 мл 1 М HCl (рішення3) і 100 мкл похідного реагенту (рішення1);повністю струшувати протягом 2 хв;

----Інкубуйте при 37 ℃ протягом ночі (приблизно 16 годин);

----Додати 5мл 0,1МК₂HPO₄ (рішення2), 0,4 мл 1М NaOH (рішення4) і 5 мл етилацетату, сильно струшуйте протягом 30 секунд;

---- Центрифуга при кімнатній температурі (20-25 ℃) протягом 10 хвилин, щонайменше 3000 г;

---- Візьміть 2,5 мл супернатанту органічної фази в чисту скляну пробірку на 10 мл, висушіть газоподібним азотом при 50-60 ℃ або на роторному випарнику;

----Розчиніть сухий залишок 1 мл н-гексану (або н-гептану), перемішайте протягом 30 секунд, додайте 1 мл екстракційного розчину (рішення5), перемішайте протягом 1 хвилини, повністю перемішайте.

---- Центрифуга при кімнатній температурі (20-25^oВ) за 10 хв не менше 3000 г;

----Видалити надосадову органічну фазу;візьміть 50 мкл водної фази субстрату для аналізу.

1. 9.Процес аналізу

9.1Зверніть увагу перед аналізом

9.1.1 Переконайтеся, що всі реагенти та мікролунки мають кімнатну температуру (20-25 ℃).

9.1.2 Одразу після використання поверніть усі інші реагенти до 2-8 ℃.

9.1.3 Правильне промивання мікролунок є важливим етапом у процесі аналізу;це життєво важливий фактор для відтворюваності аналізу ELISA.

9.1.4 Уникайте світла та накривайте мікролунки під час інкубації.

9.2 Етапи аналізу

9.2.1 Вийміть усі реагенти при кімнатній температурі (20-25 ℃) більше ніж на 30 хвилин, гомогенізуйте перед використанням.

9.2.2 Вийміть необхідні мікролунки та негайно помістіть решту в мішок на блискавці при 2-8 ℃.

9.2.3 Концентрований промивний розчин і концентрований екстракційний розчин слід нагріти до кімнатної температури перед використанням.

9.2.4номер:Пронумеруйте кожну мікролунку, а всі стандарти та зразки повинні бути використані в двох примірниках.Запишіть положення стандартів і зразків.

9.2.5Розведення концентрованого розчину антитіл: розведіть концентрований розчин ферменту розріджувачами ферментного кон’югату в об’ємному співвідношенні 1:10 (1-кратний концентрований розчин ферменту: 10-кратний розчинник ферментного кон’югату).

9.2.6Додайте стандартний розчин / зразок і розчин ферментного кон'югату: додайте 50 мкл стандартного розчину або підготовленого зразка у відповідні лунки, додайте 50 мкл розчину кон’югату ферменту.Обережно перемішайте, струшуючи планшет вручну, і інкубуйте протягом 30 хвилин при 25 ℃ під кришкою.

9.2.7мити: Обережно зніміть кришку, вилийте рідину з лунок і промийте мікролунки 250 мкл розведеного промивного розчину (рішення6) з інтервалом 10с по 4-5 разів.Вбирайте залишки води абсорбуючим папером (залишки бульбашок повітря можна видалити невикористаним наконечником).

9.2.8Забарвлення: Додайте 50 мкл розчину субстрату A та 50 мкл розчину субстрату B до кожної лунки.Обережно перемішайте, похитуючи планшет вручну, і інкубуйте протягом 15 хвилин при 25 ℃ під кришкою (див. 12.8).

9.2.11Виміряти: Додайте 50 мкл стоп-розчину в кожну лунку.Обережно перемішайте, похитуючи пластину вручну, і виміряйте абсорбцію при 450 нм (пропонується вимірювання з подвійною довжиною хвилі 450/630 нм. Прочитайте результат протягом 5 хвилин після додавання стоп-розчину.)

10 Результати

10.1Відсоткове поглинання

Середні значення значень абсорбції, отримані для стандартів і зразків, ділять на значення абсорбції першого стандарту (нульового стандарту) і множать на 100%.Таким чином, нульовий стандарт дорівнює 100%, а значення абсорбції наводяться у відсотках.

=

B — стандарт абсорбції (або зразок)

B0 ——нульовий стандарт абсорбції

10.2Стандартна крива

----Щоб намалювати стандартну криву: Візьміть значення абсорбції стандартів як вісь ординат, напівлогарифмічне значення концентрації стандартного розчину AOZ (ppb) як вісь х.

---- Концентрація AOZ кожного зразка (ppb), яку можна прочитати з калібрувальної кривої, множиться на відповідний коефіцієнт розведення кожного зразка, який слідує, і отримується фактична концентрація зразка.

Зверніть увагу:

Для редагування всіх даних розроблено спеціальне програмне забезпечення, яке надається за запитом.

Коефіцієнт розведення………………………………………..……2

10.Чутливість, точність і точність

Чутливість: 0,025ppb

Межа виявлення:

Тканина (м'язи, печінка)…………………………0,1ppb

Мед ------------------------------------------------- -0,1ppb

Точність:

Тканини тварин (м'язи та печінка)…………………100±20%

Мед…………………………………..………….... 100±20%

Точність:CV набору ELISA менше 10%.

11.Повідомлення

12.1 Середні значення значень поглинання, отриманих для стандартів і зразків, будуть зменшені, якщо реагенти і зразки не були доведені до кімнатної температури (20-25 ℃).

12.2 Не дозволяйте мікролункам висихати між кроками, щоб уникнути невдалої відтворюваності, і виконуйте наступний етап відразу після постукування тримача мікролунок.

12.3 Обережно струсіть кожен реагент перед використанням.

12.4 Тримайте шкіру подалі від стоп-розчину, оскільки це 0,5MH₂SO₄рішення.

12.5 Не використовуйте прострочені комплекти.Не міняйте реагенти різних партій, інакше це знизить чутливість.

12.6 Умови зберігання: Зберігайте набори ELISA при 2-8 ℃, не заморожуйте.Закрийте мікролункові планшети, уникайте прямого сонячного світла під час усіх інкубацій.Рекомендовано накривати мікропланшети.

12.7 Від розчину субстрату слід відмовитися, якщо він змінить колір.Реагенти можуть погіршитися, якщо значення абсорбції (450/630 нм) нульового стандарту менше 0,5 (A450 нм <0,5).

12.8 Реакція забарвлення повинна тривати 15 хвилин після додавання розчину субстрату;Ви можете продовжити час інкубації до 20 хвилин або більше, якщо колір занадто світлий для визначення. Ніколи не перевищуйте 25 хвилин. Навпаки, належним чином скоротіть час інкубації.

12.9 Оптимальна температура реакції становить 25 ℃.Вища або нижча температура призведе до змін чутливості та значень поглинання.

12.Умови та термін зберігання

Умови зберігання: 2-8 ℃.

Термін зберігання: 12 місяців.