sản phẩm

1. 1.Lý lịch

Nitrofurans là kháng sinh phổ rộng tổng hợp, thường được sử dụng trong chăn nuôi vì đặc tính kháng khuẩn và dược động học tuyệt vời của nó.Chúng cũng đã được sử dụng làm chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi lợn, gia cầm và thủy sản.Trong các nghiên cứu dài hạn với động vật thí nghiệm chỉ ra rằng thuốc gốc và các chất chuyển hóa của chúng cho thấy các đặc tính gây ung thư và gây đột biến.Điều này đã dẫn đến việc cấm sử dụng nitrofurans để điều trị động vật dùng làm thực phẩm.Các loại thuốc nitrofuran furaltadone, nitrofurantoin và nitrofurazone đã bị cấm sử dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi ở EU vào năm 1993 và việc sử dụng furazolidone cũng bị cấm vào năm 1995.

Việc phân tích dư lượng thuốc nitrofuran cần dựa trên việc phát hiện các chất chuyển hóa liên kết mô của thuốc gốc nitrofuran.Do các thuốc gốc được chuyển hóa rất nhanh và các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết với mô sẽ giữ lại trong một thời gian dài, nên các chất chuyển hóa này được sử dụng làm mục tiêu phát hiện việc lạm dụng nitrofuran, bao gồm chất chuyển hóa Furazolidone (AOZ), chất chuyển hóa Furaltadone (AMOZ) ), chất chuyển hóa Nitrofurantoin (AHD) và chất chuyển hóa Nitrofurazone (SEM).

Dư lượng AOZ được xác định phổ biến nhất bằng LC-MS hoặc LC-MS/MS.Xét nghiệm miễn dịch enzyme, so với phương pháp sắc ký, cho thấy những ưu điểm đáng kể về độ nhạy, giới hạn phát hiện, thiết bị kỹ thuật và yêu cầu về thời gian.(Thời gian: 45 phút)

1. 2.Nguyên tắc kiểm tra

Bộ ELISA này được thiết kế để phát hiện AOZ dựa trên nguyên tắc xét nghiệm miễn dịch enzym cạnh tranh gián tiếp.Các giếng microtiter được phủ bằng kháng nguyên liên kết với BSA bắt giữ.AOZ trong mẫu cạnh tranh với kháng nguyên được phủ trên tấm microtiter để giành kháng thể được thêm vào.Sau khi bổ sung chất liên hợp enzyme, cơ chất tạo màu được sử dụng và tín hiệu được đo bằng máy đo quang phổ.Độ hấp thụ tỷ lệ nghịch với nồng độ AOZ trong mẫu.

1. 3.Các ứng dụng

Bộ kit này có thể được sử dụng trong phân tích định lượng và định tính dư lượng AOZ trongmô động vật(cơ, gan, v.v.), mật ong.

1. 4.phản ứng chéo

Chất chuyển hóa furazolidone (AOZ)……………………..100%

Chất chuyển hóa furaltadone (AMOZ)……………………<0,1%

Chất chuyển hóa Nitrofurantoin (AHD)……………………<0,1%

Chất chuyển hóa Nitrofurazone (SEM)…………………...…<0,1%

Furazolidone…………………………………….…..…16,3%

Furaltadone…………………….…<1%

Nitrofurantoin…………………………………….…….…<1%

Nitrofurazone…………………………………………..…<1%

1. 5.Vật liệu thiết yếu

5.1thiết bị

----Máy quang phổ tấm microtiter (450nm/630nm)

---- Thiết bị bay hơi quay hoặc dụng cụ sấy nitơ

---- Homogenizer / dạ dày

---- Máy lắc

----Máy trộn vortex

---- Máy ly tâm

----Cân phân tích (độ tự cảm: 0,01g)

---- Pipet chia độ: 10ml

---- Bóng pipet cao su

----Bình định mức: 100ml

---- Bình thủy tinh: 10ml

---- Ống ly tâm Polystyrene: 2ml, 50ml

----Micropipette: 20ul-200ul, 100ul-1000ul,

250ul-multipipette

5.2Thuốc thử

----Etyl axetat (AR)

----n-hexan (hoặc n-heptan) (AR)

---- Dikali hydro photphat trihydrat

(K₂HPO₄.3H₂Ô) (AR)

---- Axit clohydric đậm đặc (HCl, AR)

----- Metanol

----Natri hydroxit (NaOH, AR)

----Nước khử ion

1. 6.Thành phần bộ

l Đĩa microtiter phủ kháng nguyên, 96 giếng

l Dung dịch chuẩn (6 chai, 1ml/chai)

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

l Kiểm soát tiêu chuẩn tăng vọt : (1ml/chai)....….100ppb

l Enzym liên hợp đậm đặc 1ml……..nắp đỏ

l Dung dịch pha loãng liên hợp enzyme 10ml………..nắp xanh

l Chất nền A 7ml………...............…....…..…..nắp trắng

l Chất nền B 7ml………..............…........….…..nắp đỏ

l Dung dịch dừng 7ml……………………………nắp màu vàng

l Dung dịch rửa đậm đặc 20×40ml

…………………………………….……nắp trong suốt

l Dung dịch chiết cô đặc 2×60ml….nắp xanh

l 2-Nitrobenzaldehyde 15.1mg……………….nắp trắng

1. 7.Chuẩn bị thuốc thử

Dung dịch 1: thuốc thử dẫn xuất:

Thêm 10ml metanol vào chai có 2-Nitrobenzaldehyde và hòa tan.(ở nồng độ 10mM).

Dung dịch 2: 0,1MK₂HPO₄giải pháp:

Cân 22,8g K₂HPO₄.3H₂O đến 1L nước khử ion để hòa tan.

Dung dịch 3: Dung dịch HCl 1M

Hòa tan 8,3ml Axit clohydric đậm đặc với nước khử ion đến 100ml.

Giải pháp 4:dung dịch NaOH 1M

Hòa tan 4g NaOH với 100ml nước khử ion.

Giải pháp 5: dung dịch chiết:

Pha loãng dung dịch chiết cô đặc 2× với nước khử ion theo tỷ lệ thể tích 1:1.Dung dịch này có thể được bảo quản trong 1 tháng ở 4℃, dung dịch này sẽ được sử dụng để chiết xuất các mẫu.

Dung dịch 6: dung dịch rửa:

Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc 20× với nước khử ion theo tỷ lệ thể tích 1:19, sẽ được sử dụng để rửa các tấm.Dung dịch pha loãng này có thể được bảo quản trong 1 tháng ở 4℃.

1. số 8.Chuẩn bị mẫu

8.1Thông báo và biện pháp phòng ngừa trước khi hoạt động:

a) Vui lòng sử dụng các mẹo một lần trong thí nghiệm và thay đổi các mẹo khi hấp thụ các thuốc thử khác nhau.

b) Đảm bảo các dụng cụ thí nghiệm sạch sẽ.

c) thuốc thử phái sinh có thể được bảo quản ở 2-8℃ trong ba tháng;

d) Dung dịch HCl có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 3 tháng;

e) Dung dịch NaOH có thể bảo quản được 3 tháng ở nhiệt độ thường;

f) Giữ các mẫu chưa xử lý ở trạng thái đông lạnh (-20℃);

g) Các mẫu đã xử lý có thể được bảo quản trong 24 giờ ở nhiệt độ 2-8℃ trong bóng tối .

8.2 Mẫu mô và gan động vật:

---- Đồng nhất các mẫu bằng máy đồng nhất;

---- Cân 1,0 ± 0,05g mẫu mô đã đồng nhất vào ống ly tâm polystyrene 50ml.Thêm 4ml nước khử ion, 0,5ml dung dịch HCl 1M và 100ul thuốc thử dẫn xuất (xem dung dịch 1).Lắc nó trong 2 phút.

---- Ủ ở 37℃ qua đêm (khoảng 16h);

---- Thêm 5ml 0,1MK₂HPO₄ (giải pháp2), 0,4ml NaOH 1M (giải pháp4) và 5ml etyl axetat.Lắc mạnh trong 30s;

---- Ly tâm ở nhiệt độ phòng (20-25℃) trong 10 phút, ít nhất 3000g;

---- Lấy 2,5ml pha hữu cơ nổi phía trên cho vào ống thủy tinh sạch 10ml, làm khô bằng khí nitơ 50-60℃ hoặc máy cô quay;

---- Hoà tan cặn khô còn lại với 1ml n-hexan (hoặc n-heptan), vortex 30s, thêm 1ml dung dịch chiết (giải pháp5), vortex 1 phút, trộn hoàn toàn.

---- Ly tâm ở nhiệt độ phòng (20-25^oC) trong 5 phút, ít nhất 3000g;

---- Loại bỏ pha hữu cơ nổi phía trên;lấy 50μl pha nước cơ chất để xét nghiệm.

8.4 Mật ong

---- cân 1,0 ± 0,05g mẫu mật ong đã đồng nhất cho vào ống ly tâm polystyrene 50ml;

----Thêm 4ml nước khử ion, 0,5ml HCl 1M (giải pháp3) và thuốc thử dẫn xuất 100μl (giải pháp1);lắc hoàn toàn trong 2 phút;

----Ủ ở 37℃ qua đêm (khoảng 16h);

----Thêm 5ml 0,1MK₂HPO₄ (giải pháp2), 0,4ml NaOH 1M (giải pháp4) và 5ml ethyl acetat, lắc mạnh trong 30s;

---- Ly tâm ở nhiệt độ phòng (20-25℃) trong 10 phút, ít nhất 3000g;

----Lấy 2,5ml pha hữu cơ nổi phía trên vào ống thủy tinh sạch 10ml, làm khô bằng khí nitơ 50-60oC hoặc máy bay hơi quay;

----Hòa tan phần khô còn lại với 1ml n-hexan (hoặc n-heptan), vortex trong 30 giây, thêm 1ml dung dịch chiết (giải pháp5), vortex 1 phút, trộn hoàn toàn.

---- Ly tâm ở nhiệt độ phòng (20-25^oC) trong 10 phút, ít nhất 3000g;

---- Loại bỏ pha hữu cơ nổi trên bề mặt;lấy 50μl pha nước cơ chất để xét nghiệm.

1. 9.quy trình xét nghiệm

9.1Lưu ý trước khi xét nghiệm

9.1.1 Đảm bảo tất cả thuốc thử và giếng vi thể đều ở nhiệt độ phòng (20-25℃).

9.1.2 Đưa tất cả thuốc thử còn lại về 2-8℃ ngay sau khi sử dụng.

9.1.3 Rửa vi giếng đúng cách là một bước quan trọng trong quy trình xét nghiệm;nó là yếu tố quan trọng đối với khả năng tái tạo của phân tích ELISA.

9.1.4 Tránh ánh sáng và đậy nắp vi giếng trong quá trình ủ.

9.2 Các bước xét nghiệm

9.2.1 Lấy tất cả thuốc thử ra ngoài ở nhiệt độ phòng (20-25℃) trong hơn 30 phút, đồng nhất hóa trước khi sử dụng.

9.2.2 Lấy các giếng vi sóng cần thiết ra ngoài và cho phần còn lại vào túi khóa zip ở 2-8℃ ngay lập tức.

9.2.3 Dung dịch rửa cô đặc và dung dịch chiết cô đặc phải được hâm nóng lại ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

9.2.4Con số:Đánh số mọi vị trí vi giếng và tất cả các tiêu chuẩn và mẫu phải được chạy trùng lặp.Ghi lại các tiêu chuẩn và vị trí mẫu.

9.2.5Pha loãng dung dịch kháng thể đậm đặc: pha loãng dung dịch enzyme đậm đặc với dịch pha loãng liên hợp enzyme theo tỷ lệ thể tích 1:10 (1 lần dung dịch enzyme đậm đặc: 10 lần dịch pha loãng liên hợp enzyme).

9.2.6Thêm dung dịch chuẩn/mẫu và dung dịch liên hợp enzyme: cho 50µl dung dịch chuẩn hoặc mẫu đã chuẩn bị vào các giếng tương ứng, thêm 50µl dung dịch cộng hợp enzym.Trộn nhẹ bằng cách lắc đĩa bằng tay và ủ trong 30 phút ở 25℃ có đậy nắp.

9.2.7Rửa: Nhẹ nhàng tháo nắp và đổ chất lỏng ra khỏi giếng và rửa sạch các giếng siêu nhỏ bằng 250µl dung dịch rửa đã pha loãng (giải pháp6) trong khoảng thời gian 10 giây trong 4-5 lần.Thấm nước còn lại bằng giấy thấm (có thể loại bỏ bọt khí còn lại bằng đầu chưa sử dụng).

9.2.8tô màu: Thêm 50µl dung dịch chất nền A và 50ul dung dịch chất nền B vào mỗi giếng.Trộn nhẹ nhàng bằng cách lắc đĩa bằng tay và ủ trong 15 phút ở 25℃ có đậy nắp (xem 12.8).

9.2.11Đo lường: Thêm 50µl dung dịch dừng vào mỗi giếng.Trộn nhẹ nhàng bằng cách lắc đĩa thủ công và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450nm (Đề xuất đo với bước sóng kép 450/630nm. Đọc kết quả trong vòng 5 phút sau khi thêm dung dịch dừng.)

10 Kết quả

10.1phần trăm độ hấp thụ

Giá trị trung bình của các giá trị độ hấp thụ thu được đối với các tiêu chuẩn và các mẫu được chia cho giá trị độ hấp thụ của tiêu chuẩn đầu tiên (chuẩn không) và nhân với 100%.Do đó, tiêu chuẩn không được thực hiện bằng 100% và các giá trị độ hấp thụ được trích dẫn theo tỷ lệ phần trăm.

=

B ——tiêu chuẩn hấp thụ (hoặc mẫu)

B0 ——tiêu chuẩn hấp thụ bằng không

10.2Đường cong tiêu chuẩn

----Cách vẽ đường chuẩn: Lấy giá trị độ hấp thụ của chất chuẩn làm trục y, bán logarit nồng độ của dung dịch chuẩn AOZ (ppb) làm trục x.

----Nồng độ AOZ của từng mẫu (ppb), có thể đọc được từ đường chuẩn, được nhân với hệ số pha loãng tương ứng của từng mẫu sau đó và thu được nồng độ thực tế của mẫu.

Xin hãy chú ý:

Phần mềm đặc biệt đã được phát triển để giảm tất cả dữ liệu, có thể được cung cấp theo yêu cầu.

Nhân tố………………………………………..……2

10.Độ nhạy, độ chính xác và độ chính xác

Nhạy cảm: 0,025ppb

Giới hạn phát hiện:

Mô (cơ, gan)…………………………0.1ppb

Mật ong------------------------------------------------- -0,1ppb

Sự chính xác:

Mô động vật (cơ và gan)……...…………100±20%

Mật ong ………………………………..………….... 100±20%

Độ chính xác:CV của bộ ELISA nhỏ hơn 10%.

11.Lưu ý

12.1 Giá trị trung bình của các giá trị độ hấp thụ thu được đối với chất chuẩn và mẫu sẽ bị giảm nếu thuốc thử và mẫu không được điều chỉnh ở nhiệt độ phòng (20-25℃).

12.2 Không để các giếng vi thể khô giữa các bước để tránh khả năng tái tạo không thành công và vận hành bước tiếp theo ngay sau khi chạm vào giá đỡ vi giếng.

12.3 Lắc nhẹ từng thuốc thử trước khi sử dụng.

12.4 Giữ da của bạn tránh xa dung dịch dừng vì nó là 0,5MH₂SO₄giải pháp.

12.5 Không sử dụng bộ dụng cụ đã lỗi thời.Không trao đổi thuốc thử của các lô khác nhau, nếu không sẽ làm giảm độ nhạy.

12.6 Điều kiện bảo quản: Giữ bộ dụng cụ ELISA ở nhiệt độ 2-8℃, không để đông lạnh.Đậy kín các đĩa vi giếng còn lại, Tránh ánh nắng trực tiếp trong suốt quá trình ủ.Nên che phủ các tấm microtiter.

12.7 Dung dịch chất nền nên được loại bỏ nếu nó đổi màu.Thuốc thử có thể bị giảm chất lượng nếu giá trị độ hấp thụ (450/630nm) của chuẩn 0 nhỏ hơn 0,5 (A450nm<0,5).

12.8 Phản ứng tạo màu cần 15 phút sau khi thêm dung dịch cơ chất;Bạn có thể kéo dài thời gian ủ lên 20 phút hoặc hơn nếu màu quá nhạt không thể xác định được. Không bao giờ vượt quá 25 phút. Ngược lại, hãy rút ngắn thời gian ủ đúng cách.

12.9 Nhiệt độ phản ứng tối ưu là 25℃.Nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn sẽ dẫn đến sự thay đổi giá trị độ nhạy và độ hấp thụ.

12.Điều kiện bảo quản và thời gian bảo quản

Điều kiện bảo quản: 2-8℃.

Thời gian lưu trữ: 12 tháng.