pruduttu

Principiu di prova

Stu kit hè basatu annantu à a tecnulugia ELISA cumpetitiva indiretta.I pozzi di microtitre sò rivestiti cù l'antigenu di accoppiamentu.Flumequineu residuu in a mostra compete cù l'antigenu rivestitu nantu à u microtiter plate per l'anticorpu.Dopu l'aghjunzione di l'anticorpu marcatu di l'enzima, u sustrato TMB hè utilizatu per vede u culore.Absorbance di u campionu hè negativu ligati à u tetracycline residenu in lu, dopu à paragunà cù u Standard Curve, multiplicate da a multiplicità dilution, quantità Flumequine residue in u campionu pò esse calculatu.

Applicazioni

Stu kit pò esse usatu in l'analisi quantitativa è qualitativa di u residu di flumequine in u meli.

Reazioni incruciate

Flumequine ………………………………………………… 100%

Materiali necessarii

Attrezzature

┅┅Spettrofotometru di piastra di microtitru (450nm / 630nm)

┅┅Homogenizer o stomacher

┅┅Shaker

┅┅Vortex mixer

┅┅Centrifuga

┅┅Balance analitica (induttanza: 0,01 g)

┅┅Pipetta graduata: 15ml

┅┅Ampoule à pipette en gomma

┅┅Tubo da centrifuga in polistirene: 15ml, 50ml

┅┅Tubu di vetru: 10ml

┅┅Micropipette: 20ml-200ml, 100ml -10000ml,

250ml -multippette

Reagenti

┅┅n-esano (AR)

┅┅Cloruro di metilene (AR)

┅┅Acetonitrile (AR)

┅┅Acqua deionizzata

-----Acidu cloridicu cuncentratu (AR)

Cumpunenti di u kit

● Microtiter plate cù pozzi 96 rivestiti cù antigenu

● Soluzioni standard (6 buttigli × 1 ml / buttiglia)

0 ppb, 0,3 ppb, 1,2 ppb, 4,8 ppb, 19,2 ppb, 76,8 ppb

● Control standard di alta concentrazione: (1 ml / buttiglia)

……………………………………………………………100 ppb

● Enzyme conjugate 12ml………………………………... cappucciu rossu

● Soluzione di anticorpi 7ml …………..……..….…..cap verde

● Soluzione A 7ml……..…………………..………..tappa bianca

● Soluzione B 7ml …………….…………..………… cappucciu rossu

● Stop solution 7ml ……………………..……capu giallu

● 20XConcentrated lavare suluzione 40ml

……………………………………………………..…..capu trasparente

●2X Soluzione d'estrazione 50ml…………………… cap blu

Preparazione di reagenti

7.1 Campione di miele

Soluzione 1: Soluzione di l'acidu cloridicu 0,2 M

Pesu 41,5 ml Acidu cloridicu cuncentratu, dilute cù acqua deionizzata à 500 ml.

Soluzione 2: Lavare a suluzione

Dilute a suluzione di lavà cuncentrata cù acqua deionizzata in u rapportu di voluminu di 1: 19, chì serà utilizatu per lavà i piatti.a suluzione diluita pò esse guardatu à 4 ℃ per 1 mesi.

Soluzione3: suluzione d'estrazzioni

Dilute the 2×concentrated extraction solution with deionized water in the volume ratio of 1: 1 (o dipende da esigenza), chì serà utilizatu per l'estrazione di mostra.Questa suluzione diluita pò esse cunservata per 1 mese à 4 ℃.

Preparazioni di mostra

8.1 Avvisu è precautions per l'utilizatori prima di l'operazione

(a) Per piacè aduprate punte una volta in u prucessu di l'esperimentu, è cambiate i cunsiglii quandu assorbe diversi reagenti.

(b) Assicuratevi chì tutti i strumenti sperimentali sò puliti, altrimenti effettuerà u risultatu di l'analisi.

8.2Campione di miele

-----Pesà 2g±0.05g di campione di miele in un tubu di centrifuga di polistirene da 50ml,

-----Add 2ml 0.2 M Soluzione di l'acidu cloridicu (Solution 1), vortex to mix it full, and then add 8ml methylene chloride, shake with shaker for 5min to dissolve completamente;

-----Centrifuga per 10 min, almenu 3000g à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃);

-----Eliminà a fase supernatant, pigliate 2 ml di a suluzione organica di sustrato à un tubu di vetru di 10 ml. Asciugà u substatu sottu u bagnu di acqua di flussu di azotu (50-60 ℃)

-----Aggiungere 1 ml di n-esano, vortex per 30s, poi aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione (soluzione 3), vortex di nuovo per 1 min.Centrifuga per 5 minuti, almenu 3000 g à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃);

-----Eliminà a fase supernatante, pigliate 50ml per l'analisi;

9. Prucessu d'assay

9.1 Avvisu prima di analisi

9.1.1 Assicuratevi chì tutti i reagenti è i microwells sò tutti à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃).

9.1.2 Ritorna tutti i reagenti di u restu à 2-8 ℃ immediatamente dopu l'usu.

9.1.3 Lavà i microwells currettamente hè un passu impurtante in u prucessu di analisi;hè u fattore vitale per a ripetitività di l'analisi ELISA.

9.1.4 Evite u lume è copre i microwells durante l'incubazione.

9.2 Passi di analisi

9.2.1 Pigliate tutti i reagenti à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃) per più di 30 min, homogenize prima di l'usu.

9.2.2 Scuprite i micropozzi necessarii è rinviate u restu in u saccu zip-lock à 2-8 ℃ immediatamente.

9.2.3 A suluzione di lavare diluted deve esse rinfriscata per esse à a temperatura di l'ambienti prima di l'usu.

9.2.4numeru:Numerari ogni pusizioni di micropozzetti è tutti i standard è i campioni duveranu esse eseguiti in duplicate.Registrate i standard è e pusizioni di campioni.

9.2.5Aghjunghje suluzione standard / campione:Aggiungere 50 µl di soluzione standard o campione preparato ai pozzetti corrispondenti.Aggiungere 50 µl di soluzione di anticorpi.Imbulighjate delicatamente scuzzulate a piastra manualmente è incubate per 30 minuti à 25 ℃ cù a tappa.

9.2.6Lavà:Eliminate a tappa delicatamente è purificà u liquidu fora di i pozzi è sciacquate i micropozzetti cù 250 µl di soluzione di lavaggio diluita (soluzione 2) à intervalli di 10 s per 4-5 volte.Assorbe l'acqua residuale cù carta assorbente (a bolla di l'aire di restu pò esse eliminata cù una punta inutilizata).

9.2.8.Enzyme conjugate:Aghjunghjite 100 ml di soluzione di conjugatu enzimaticu à ogni pozzu, mischjendu delicatamente scuzzulate a piastra manualmente è incubate per 30 minuti à 25 ℃ cù a tappa.Repetite u passu di lavatu di novu.

9.2.8Culorazione:Aggiungere 50 µl di soluzione A e 50 µl di soluzione B a ciascun pozzetto.Imbulighjate delicatamente scuzzulate a piastra manualmente è incubate per 15 min à 25 ℃ cù una coperta (vede 12.8).

9.2.9Misura:Aggiungere 50 µl di soluzione stop a ogni pozzetto.Imbulighjate delicatamente scuzzulate a piastra manualmente è misurà l'assorbanza à 450nm contr'à un spaziu di aria (Hè suggeritu misura cù a doppia lunghezza d'onda di 450/630nm. Leghjite u risultatu in 5 minuti dopu l'aghjunzione di a suluzione di stop.) (Pudemu ancu misurà à vista). sans solution d'arrêt en dehors de l'instrument ELIASA)

Risultati

10.1 Assorbanza percentuale

I valori medii di i valori di assorbanza ottenuti per i standard è i campioni sò divisi da u valore di assorbanza di u primu standard (standard zero) è multiplicate da 100%.U standard zero hè dunque fattu uguali à 100% è i valori di assorbanza sò citati in percentuali.

Assorbanza (%) = B/B0 × 100%

B - standard di assorbanza (o campione)

B0 ——assorbanza zero standard

10.2 Standard Curve

Per disegnà una curva standard: Pigliate u valore di assorbanza di i standard cum'è l'asse y, semi logaritmicu di a cuncentrazione di a suluzione standard flumequine (ppb) cum'è l'assi x.

--- Uflumequinea cuncentrazione di ogni mostra (ppb), chì pò esse lettu da a curva di calibrazione, hè multiplicata da a multiplicità di diluzione currispondente di ogni mostra seguita, è a cuncentrazione attuale di mostra hè ottenuta.

Per a riduzione di dati di i kit ELISA, hè statu sviluppatu un software speciale, chì pò esse furnitu nantu à dumanda.

11. Sensibilità, accuratezza è precisione

Pruvate a sensibilità:0,3 ppb

Fattore di diluzione di Campione di Miele: 2

Limite di rilevazione

Campione di miele------------------------------------------------- - 1 ppb

Accuratezza

Campione di miele -------------------------------------------- 90±20 %

Precisione

U coefficient di variazione di u kit ELISA hè menu di 10%.

12. Avvisu

12.1 I valori medii di i valori di assorbanza ottenuti per i standard è i campioni seranu ridotti se i reagenti è i campioni ùn sò micca stati regulati à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃).

12.2 Ùn permettenu micca chì i microwells si seccanu trà i passi per evità una ripetitività senza successu è operate u prossimu passu immediatamente dopu à toccu u titularu di microwells.

12.3.Omogeneizà ogni reagentu prima di usà.

12.4.Mantene a vostra pelle luntanu da a suluzione di stop, perchè hè a 2M H₂SO₄suluzione.

12.5 Ùn aduprate micca i kit obsoleti.Ùn scambiate micca i reagenti di diversi lotti, perchè abbandunà a sensibilità.

12.6 Condizioni di almacenamento:

Mantene i kit ELISA à 2-8 ℃, ùn congelate micca.Sigillate i piatti di micropozzetti di riposu Evitate a luce diretta di u sole durante tutte l'incubazioni.Hè ricumandemu di copre i platti di microtitre.

12.7 Indicazioni per i reagenti chì andanu male:

A suluzione di u sustratu deve esse abbandunatu s'ellu cambia i culori.

I reagenti pò esse turnati male se u valore di assorbanza (450/630nm) di u standard zero hè menu di 0,5 (A450nm <0,5).

12.8 A reazione di colorazione hà bisognu di 15min dopu l'aghjunzione di a Soluzione A è a Soluzione B. È pudete allargà u tempu d'incubazione varieghja da 20min à più se u culore hè troppu chjaru per esse determinatu.Ùn mai più di 25min, à u cuntrariu, accurtà u tempu d'incubazione bè.

12.9 A temperatura di reazione ottima hè 25 ℃.A temperatura più alta o più bassa porta à i cambiamenti di i valori di sensibilità è di assorbanza.

13. Storage

Cundizione di almacenamentu: 2-8 ℃.

Periudu di almacenamiento: 12 mesi.