өнім

Сынақ принципі

Бұл жинақ жанама бәсекеге қабілетті ELISA технологиясына негізделген.Микротитр ұңғымалары байланыстырушы антигенмен қапталған.Флюмекинүлгідегі қалдық антидене үшін микротитр пластинасында қапталған антигенмен бәсекелеседі.Антидене таңбаланған ферментті қосқаннан кейін түсті көрсету үшін TMB субстраты қолданылады.Үлгінің абсорбциясы ондағы тетрациклин резиденциясына теріс байланысты, сұйылту еселігімен көбейтілген Стандартты қисықпен салыстырғаннан кейін үлгідегі флюмекин қалдығының мөлшерін есептеуге болады.

Қолданбалар

Бұл жинақты балдағы флумекин қалдықтарының сандық және сапалық талдауында қолдануға болады.

Айқас реакциялар

Флюмекин ……………………………………………… 100%

Қажетті материалдар

Жабдықтар

┅┅Микротитр пластинасының спектрофотометрі (450нм/630нм)

┅┅Гомогенизатор немесе асқазан

┅┅Шейкер

┅┅Құйынды араластырғыш

┅┅Центрифуга

┅┅Аналитикалық тепе-теңдік (индуктивтілік: 0,01г)

┅┅Тәуелді тамшуыр: 15 мл

┅┅Резеңке тамшуыр шамы

┅┅Полистирол центрифуга түтігі: 15мл, 50мл

┅┅Шыны пробирка: 10мл

┅┅Микропипеттер: 20мл-200мл, 100мл -10000мл,

250 мл - мультипипетка

Реагенттер

┅┅n-гексан(AR)

┅┅Метиленхлориді(AR)

┅┅Ацетонитрил(AR)

┅┅Деиондандырылған су

----- Концентрлі тұз қышқылы (AR)

Жинақтың құрамдас бөліктері

● Антигенмен қапталған 96 шұңқыры бар микротитр тақтасы

● Стандартты ерітінділер (6 бөтелке×1 мл/бөтелке)

0ppb, 0,3ppb, 1,2ppb, 4,8ppb, 19,2ppb, 76,8ppb

● Жоғары концентрацияны стандартты бақылау: (1 мл/бөтелке)

……………………………………………………100бб

● Фермент конъюгаты 12мл……………………… қызыл қалпақ

● Антидене ерітіндісі 7 мл …………..……..….….. жасыл қалпақ

● А ерітіндісі 7мл……..…………………..………..ақ қақпақ

● В ерітіндісі 7мл …………….…………..………… қызыл қалпақ

● Тоқтату ерітіндісі 7 мл ………………………………………сары қалпақ

● 20X Шоғырландырылған жуу ерітіндісі 40 мл

………………………………………………..мөлдір қалпақ

●2X Экстракция ерітіндісі 50мл…………………… көк қақпақ

Реагенттерді дайындау

7.1 Бал үлгісі

1-ерітінді: 0,2 М тұз қышқылы ерітіндісі

Салмағы 41,5 мл Концентрлі тұз қышқылы, ионсыздандырылған сумен 500 мл дейін сұйылтылған.

2-шешім: ерітіндіні жуу

Концентрлі жуу ерітіндісін 1:19 көлемдік қатынасында ионсыздандырылған сумен сұйылтыңыз, ол пластиналарды жуу үшін қолданылады.сұйылтылған ерітіндіні 4°C температурада 1 ай бойы сақтауға болады.

Шешім3: экстракциялық ерітінді

2 × концентрлі экстракциялық ерітіндіні сынама алу үшін қолданылатын 1:1 көлемдік қатынасында (немесе талапқа байланысты) деиондандырылған сумен сұйылтыңыз.Бұл сұйылтылған ерітіндіні 4°C температурада 1 ай бойы сақтауға болады.

Дайындау үлгілері

8.1 Пайдаланушыларға пайдалану алдында ескертулер мен сақтық шаралары

(a) Тәжірибе барысында бір реттік кеңестерді пайдаланыңыз және әртүрлі реагентті сіңірген кезде кеңестерді өзгертіңіз.

(b) Барлық эксперименттік құралдардың таза екеніне көз жеткізіңіз, әйтпесе бұл талдау нәтижесіне әсер етеді.

8.2Бал үлгісі

----- 2 г ± 0,05 г бал үлгісін 50 мл полистирол центрифугалық түтікке өлшеңіз,

-----2мл 0,2 М тұз қышқылы ерітіндісін (1-ерітінді) қосыңыз, оны толығымен араластыру үшін құйыңыз, содан кейін 8 мл метилен хлоридін қосыңыз, толығымен ерігенше шайқағышпен 5 минут шайқаңыз;

-----Бөлме температурасында (20-25℃) 10 минут, кем дегенде 3000 г центрифугалау;

----- Жоғарғы фазаны алып тастаңыз, субстраттың 2 мл органикалық ерітіндісін 10 мл шыны түтікке алыңыз. Субстатты азот ағынының (50-60 ℃) су моншасында құрғатыңыз.

-----1 мл н-гексан қосыңыз, 30 секунд құйыңыз, содан кейін 1 мл экстракция ерітіндісін (3-ерітінді) қосыңыз, қайтадан 1 мин.Бөлме температурасында (20-25℃) кем дегенде 3000 г 5 мин центрифугалау;

-----Су үсті фазасын алып тастаңыз, талдау үшін 50 мл алыңыз;

9. Талдау процесі

9.1 Талдау алдында ескерту

9.1.1 Барлық реагенттер мен шағын түтіктердің барлығы бөлме температурасында (20-25℃) екеніне көз жеткізіңіз.

9.1.2 Қалған реагенттерді қолданғаннан кейін бірден 2-8℃ температурасына қайтарыңыз.

9.1.3 Микроқұдықтарды дұрыс жуу талдау процесіндегі маңызды қадам болып табылады;бұл ELISA талдауының қайталануының маңызды факторы болып табылады.

9.1.4 Инкубация кезінде жарықтан аулақ болыңыз және шағын түтіктерді жабыңыз.

9.2 Талдау қадамдары

9.2.1 Барлық реагенттерді бөлме температурасында (20-25℃) 30 минуттан астам уақытқа алыңыз, қолданар алдында гомогенизациялаңыз.

9.2.2 Қажетті шағын шұңқырларды алыңыз да, қалғандарын 2-8℃ температурада дереу құлыпталатын қапшыққа салыңыз.

9.2.3 Қолданар алдында сұйылтылған жуу ерітіндісін бөлме температурасында қайта жылыту керек.

9.2.4Саны:Әрбір микроқұдық орнын нөмірлеңіз және барлық стандарттар мен үлгілер екі данада орындалуы керек.Стандарттар мен үлгілердің позицияларын жазып алыңыз.

9.2.5Стандартты шешім/үлгі қосу:Сәйкес ұңғымаларға 50 мкл стандартты ерітінді немесе дайындалған үлгі қосыңыз.50 мкл антидене ерітіндісін қосыңыз.Пластинаны қолмен шайқау арқылы ақырын араластырыңыз және қақпағымен 25°C температурада 30 минут бойы инкубациялаңыз.

9.2.6Жуу:Қақпақты ақырын алып тастаңыз және сұйықтықты ұңғымалардан тазалаңыз және шағын түтіктерді 250 мкл сұйылтылған жуу ерітіндісімен (2-ерітінді) 10 секунд аралығымен 4-5 рет шайыңыз.Қалған суды сіңіргіш қағазбен сорыңыз (қалған ауа көпіршігі пайдаланылмаған ұшымен жойылуы мүмкін).

9.2.8.Фермент конъюгаты:Әрбір ұңғымаға 100 мл фермент конъюгат ерітіндісін қосыңыз, пластинаны қолмен шайқау арқылы ақырын араластырыңыз және қақпағымен 25 ° C температурада 30 минут бойы инкубациялаңыз.Жуу қадамын қайтадан қайталаңыз.

9.2.8Түсі:Әрбір ұңғымаға 50 мкл А ерітіндісін және 50 мкл B ерітіндісін қосыңыз.Пластинаны қолмен шайқау арқылы ақырын араластырыңыз және қақпақпен 25°C температурада 15 минут инкубациялаңыз (12.8 қараңыз).

9.2.9Өлшем:Әрбір ұңғымаға 50 мкл тоқтату ерітіндісін қосыңыз.Пластинаны қолмен шайқау арқылы ақырын араластырыңыз және ауа дайындамасына қарсы 450 нм сіңіру қабілетін өлшеңіз (Бұл 450/630 нм қос толқын ұзындығымен өлшеу ұсынылады. Нәтижені тоқтату ерітіндісін қосқаннан кейін 5 минут ішінде оқыңыз. ) (Көру арқылы да өлшей аламыз. ELIASA құралының қысқаша тоқтаусыз ерітіндісі)

Нәтижелер

10.1 Пайыздық сіңіру

Стандарттар мен үлгілер үшін алынған сіңіру мәндерінің орташа мәндері бірінші эталонның (нөлдік эталон) сіңіру мәніне бөлінеді және 100% көбейтіледі.Осылайша, нөлдік стандарт 100% тең етіп жасалады және сіңіру мәндері пайызбен белгіленеді.

Абсорбция (%) = B/B0 ×100%

B —— сіңіру стандарты (немесе үлгі)

B0 —— жұтылу нөлдік стандарты

10.2 Стандартты қисық

Стандартты қисық сызу үшін: y осі ретінде эталондардың жұтылу мәнін, х осі ретінде флумекиндік стандарт ерітіндісінің (ppb) концентрациясының жартылай логарифмдік мәнін алыңыз.

--- Theфлумекинкалибрлеу қисық сызығынан оқуға болатын әрбір үлгінің концентрациясы (ppb) әрбір кейінгі үлгінің сәйкес сұйылту еселігімен көбейтіледі және үлгінің нақты концентрациясы алынады.

ELISA жинақтарының деректерін азайту үшін сұраныс бойынша ұсынылуы мүмкін арнайы бағдарламалық қамтамасыз ету әзірленді.

11. Сезімталдық, дәлдік және дәлдік

Сынақ сезімталдығы:0,3бб

Бал Үлгісінің сұйылту коэффициенті: 2

Анықтау шегі

Бал үлгісі------------------------------------------------- -1бб

Дәлдік

Бал үлгісі --------------------------------------------- 90±20 %

Дәлдік

ELISA жинағының вариация коэффициенті 10%-дан аз.

12. Ескерту

12.1 Стандарттар мен үлгілер үшін алынған сіңіру мәндерінің орташа мәндері, егер реагенттер мен үлгілер бөлме температурасына (20-25℃) дейін реттелмесе, төмендейді.

12.2 Сәтсіз қайталануды болдырмау үшін қадамдар арасында шағын түтіктердің кептірілуіне жол бермеңіз және шағын түтік ұстағышын түрткеннен кейін бірден келесі қадамды орындаңыз.

12.3.Қолданар алдында әрбір реагентті гомогенизациялаңыз.

12.4.Теріңізді тоқтату ерітіндісінен алшақ ұстаңыз, себебі ол 2M H₂SO₄шешім.

12.5 Ескірген жинақтарды пайдаланбаңыз.Әртүрлі партиялардың реагенттерін алмастырмаңыз, өйткені ол сезімталдықты төмендетеді.

12.6 Сақтау жағдайы:

ELISA жинақтарын 2-8℃ температурада ұстаңыз, қатып қалмаңыз.Шағын түтік тақтайшаларын жабыңыз Барлық инкубация кезінде тікелей күн сәулесінен аулақ болыңыз.Микротитрлік тақталарды жабу ұсынылады.

12.7 Реагенттердің нашарлау көрсеткіштері:

Субстрат ерітіндісі түске айналса, оны тастау керек.

Нөлдік стандарттың сіңіру мәні (450/630нм) 0,5 (A450nm＜0,5) төмен болса, реагенттер нашар болуы мүмкін.

12.8 А және В ерітіндісін қосқаннан кейін бояу реакциясына 15 минут қажет. Түс анықтау үшін тым ашық болса, инкубация уақытын 20 минуттан одан да көп уақытқа дейін ұзартуға болады.Ешқашан 25 минуттан асырмаңыз, керісінше инкубация уақытын дұрыс қысқартыңыз.

12.9 Оңтайлы реакция температурасы 25℃.Жоғары немесе төмен температура сезімталдық пен сіңіру мәндерінің өзгеруіне әкеледі.

13. Сақтау

Сақтау жағдайы: 2-8℃.

Сақтау мерзімі: 12 ай.