پيداوار

ٽيسٽ اصول

هي کٽ اڻ سڌي طرح مقابلي واري ELISA ٽيڪنالاجي تي ٻڌل آهي.مائڪروٽيٽر ويلز کي ملائيندڙ اينٽيجن سان گڏ ڪيو ويو آهي.فلوميڪائننموني ۾ باقي بچيل اينٽي باڊي لاءِ مائڪروٽيٽر پليٽ تي ٺهيل اينٽيجن سان مقابلو ڪري ٿو.اينزائم ليبل ٿيل اينٽي باڊي جي اضافي کان پوء، رنگ ڏيکارڻ لاء TMB سبسٽٽ استعمال ڪيو ويندو آهي.نموني جي جذب منفي طور تي ان ۾ رهندڙ tetracycline سان لاڳاپيل آهي، معياري وکر سان مقابلو ڪرڻ کان پوء، ڊيليشن گھڻن سان ضرب ڪيو ويو، نموني ۾ Flumequine residue مقدار کي حساب ڪري سگهجي ٿو.

درخواستون

هي ڪٽ ماکيءَ ۾ موجود فلوميڪائن جي باقيات جي مقداري ۽ معيار جي تجزيي ۾ استعمال ٿي سگهي ٿو.

ڪراس رد عمل

فلوميڪائن ……………………………………… 100٪

مواد گهربل

سامان

┅┅Microtiter پليٽ spectrophotometer (450nm/630nm)

┅┅Homogenizer يا ٻوٽو پيدا ڪندڙ

┅┅شيڪر

┅┅Vortex ميڪر

┅┅Centrifuge

┅┅ تجزياتي توازن (انڊڪٽنس: 0.01g)

┅┅گريجوئيٽ ٿيل پائپٽ: 15ml

┅┅ رٻڙ جي پائيپٽ بلب

┅┅Polystyrene Centrifuge ٽيوب: 15ml، 50ml

┅┅ گلاس ٽيسٽ ٽيوب: 10ml

┅┅Micropipettes: 20ml-200ml, 100ml -10000ml,

250ml - گھڻائي

ريجنٽس

┅┅n-هيڪسين (AR)

┅┅ميٿيلين ڪلورائڊ (AR)

┅┅Acetonitrile (AR)

┅┅ Deionized پاڻي

----- مرڪوز هائيڊروڪلوڪ اسيد (AR)

ڪٽ اجزاء

● مائڪروٽيٽر پليٽ 96 ويلز سان گڏ اينٽيجن سان گڏ

● معياري حل (6 بوتلون × 1ml/بوتل)

0ppb، 0.3ppb، 1.2ppb، 4.8ppb، 19.2ppb، 76.8ppb

● اعلي ڪنسنٽريشن معياري ڪنٽرول: (1ml/بوتل)

………………………………………………………100 پي بي

● Enzyme conjugate 12ml…………………………… ڳاڙهي ڪيپ

● اينٽي باڊي جو حل 7ml …………………………………..گرين ڪيپ

● حل A 7ml………………………………………..سفيد ڪيپ

● حل B 7ml …………………………………… ڳاڙهي ڪيپ

● اسٽاپ حل 7ml ……………………………… زرد ڪيپ

● 20XConcentrated ڌوئڻ حل 40ml

……………………………………………….. شفاف ٽوپي

●2X ڪڍڻ جو حل 50ml……………………… نيري ڪيپ

Reagents جي تياري

7.1 ماکي جو نمونو

حل 1: 0.2 ايم هائڊروڪلورڪ ايسڊ حل

وزن 41.5ml ڪنسنٽريڊ هائڊروڪلورڪ ايسڊ، ڊيونائيز ٿيل پاڻي سان 500 ml تائين.

حل 2: حل ڌوئڻ

1:19 جي مقدار جي تناسب ۾ ڊيونائيز ٿيل پاڻي سان مرڪوز واش حل کي ٿلهو ڪريو، جيڪو پليٽ کي ڌوئڻ لاء استعمال ڪيو ويندو.ٺهيل حل 4 ℃ تي 1 مهيني لاء محفوظ ڪري سگهجي ٿو.

حل3: ڪڍڻ جو حل

1:1 جي مقدار جي راشن ۾ ڊيونائيزڊ پاڻي سان 2×مرڪوز ڪڍڻ واري حل کي ٿلهو ڪريو (يا ضرورت تي منحصر آهي)، جيڪو نموني ڪڍڻ لاء استعمال ڪيو ويندو.اهو حل ٿيل حل 1 مهيني لاء 4 ℃ تي محفوظ ڪري سگهجي ٿو.

نموني تياريون

8.1 آپريشن کان اڳ صارفين لاء نوٽيس ۽ احتياط

(a) مھرباني ڪري تجربن جي عمل ۾ ھڪڙي-بند ٽوٽڪا استعمال ڪريو، ۽ ٽوٽڪا تبديل ڪريو جڏھن مختلف ريجينٽ جذب ڪريو.

(b) پڪ ڪريو ته سڀئي تجرباتي اوزار صاف آهن، ٻي صورت ۾ اهو امتحان جي نتيجن کي متاثر ڪندو.

8.2ماکي جو نمونو

----- وزن 2g±0.05g ماکي جو نمونو 50ml پولسٽريئر سينٽريفيوج ٽيوب ۾،

----- 2ml 0.2 M Hydrochloric acid محلول (حل 1) شامل ڪريو، ان کي مڪمل طور تي ملائڻ لاءِ vortex، پوءِ 8ml ميٿيلين ڪلورائڊ شامل ڪريو، مڪمل طور تي گھلڻ لاءِ 5 منٽ لاءِ شيڪر سان ملايو؛

-----10 منٽ لاءِ سينٽرفيوج، گهٽ ۾ گهٽ 3000g ڪمري جي حرارت تي (20-25℃)؛

------ سپرنيٽنٽ مرحلي کي هٽايو، 2 مليل سبسٽرٽ نامياتي محلول کي 10 مليل شيشي جي ٽيوب ۾ وٺو. نائيٽروجن جي وهڪري (50-60℃) جي پاڻي جي غسل هيٺ سبسٽٽ کي خشڪ ڪريو.

----- شامل ڪريو 1 ml n-hexane، vortex 30s لاءِ، پوءِ شامل ڪريو 1ml extraction solution(solution 3) , vortex وري 1min لاءِ.5 منٽ لاء سينٽرفيوج، گهٽ ۾ گهٽ 3000 گرام ڪمري جي حرارت تي (20-25 ℃)؛

----- supernatant مرحلي کي هٽائي ڇڏيو، 50ml وٺي assay لاء؛

9. امتحاني عمل

9.1 امتحان کان اڳ نوٽيس

9.1.1 پڪ ڪريو ته سڀئي ريجينٽ ۽ مائڪرو ويلز سڀ ڪمري جي حرارت تي آهن (20-25 ℃).

9.1.2 استعمال ڪرڻ کان پوءِ فوري طور تي 2-8 ℃ تائين باقي سڀئي ريجنٽس واپس ڪريو.

9.1.3 مائڪرو ويلز کي صحيح طريقي سان ڌوئڻ امتحان جي عمل ۾ هڪ اهم قدم آهي.اهو ELISA تجزيي جي ورهاڱي لاء اهم عنصر آهي.

9.1.4 روشني کان پاسو ڪريو ۽ انڪيوبيشن دوران مائڪرو ويلز کي ڍڪيو.

9.2 امتحان جا مرحلا

9.2.1 30 منٽ کان وڌيڪ ڪمري جي گرمي پد (20-25 ℃) تي سڀئي ريجنٽ ڪڍيو، استعمال ڪرڻ کان اڳ هڪجهڙائي ڪريو.

9.2.2 گھربل مائيڪرو ويلز حاصل ڪريو ۽ باقي کي فوري طور تي 2-8℃ تي زپ لاڪ ٿيلھي ۾ واپس ڪريو.

9.2.3 استعمال ڪرڻ کان اڳ ٺهيل ڌوئڻ واري حل کي ڪمري جي حرارت تي ٻيهر گرم ڪيو وڃي.

9.2.4نمبر:هر مائڪرو ويل پوزيشن کي نمبر ۽ سڀني معيارن ۽ نمونن کي نقل ۾ هلائڻ گهرجي.معيار ۽ نمونن جي پوزيشن کي رڪارڊ ڪريو.

9.2.5معياري حل / نمونو شامل ڪريو:50 µl معياري حل يا تيار ڪيل نموني کي لاڳاپيل کوهن ۾ شامل ڪريو.50µl اينٽي باڊي حل شامل ڪريو.دستي طور پليٽ کي ھلائيندي ھلڪو ڪريو ۽ 30 منٽ لاءِ 25 ℃ تي ڍڪ سان گڏ ڪريو.

9.2.6ڌوئڻ:ڍڪ کي نرميءَ سان هٽايو ۽ کوهه مان مائع کي صاف ڪريو ۽ 250µl ڊليٽ ٿيل واش محلول (حل 2) سان 10 سيڪنڊن جي وقفي تي 4-5 ڀيرا مائڪرو ويلز کي ڌوئي ڇڏيو.رهجي ويل پاڻي کي جاذب پيپر سان جذب ڪريو (باقي ايئر بلبل کي غير استعمال ٿيل ٽپ سان ختم ڪري سگهجي ٿو).

9.2.8.Enzyme conjugate:انزائيم ڪنجوگيٽ محلول 100ml هر کوھ ۾ شامل ڪريو، پليٽ کي دستي طور ھلائيندي ھلڪو ڪريو ۽ 30 منٽ لاءِ 25 ℃ تي ڍڪڻ سان گڏ ڪريو.ڌوئڻ واري قدم کي ٻيهر ورجايو.

9.2.8رنگ:هر کوهه ۾ 50µl حل A ۽ 50µl حل B شامل ڪريو.دستي طور پليٽ کي ھلائڻ سان ھلڪو ڪريو ۽ 15 منٽ لاءِ 25 سينٽي گريڊ تي ڍڪيو (ڏسو 12.8).

9.2.9ماپ:شامل ڪريو 50µl اسٽاپ حل هر کوهه ۾.دستي طور پليٽ کي ھلائيندي ھٿ سان ملايو ۽ جذب کي ماپ ڪريو 450nm تي ھوائي خالي جي مقابلي ۾ (ان جي تجويز ڪيل ماپ 450/630nm جي ڊبل ويولٿ سان ڪئي وئي آھي. اسٽاپ سلوشن جي اضافي کان پوءِ 5 منٽ اندر نتيجو پڙھو.) (اسان ڏسڻ سان پڻ ماپي سگھون ٿا. ELIASA اوزار جي مختصر ۾ اسٽاپ حل کان سواء)

نتيجا

10.1 سيڪڙو جذب

معيار ۽ نمونن لاءِ حاصل ڪيل جاذب قدرن جا اوسط قدر پهرين معيار (صفر معيار) جي جذبي قدر سان ورهايل آهن ۽ 100٪ سان ضرب ڪيا ويا آهن.صفر معيار اهڙيءَ طرح 100٪ جي برابر ڪيو ويو آهي ۽ جذبي جا قدر فيصد ۾ بيان ڪيا ويا آهن.

جذب (٪) = B/B0 × 100٪

بي --- جاذب معيار (يا نمونو)

B0 - جذب صفر معيار

10.2 معياري وکر

معياري وکر ٺاھڻ لاءِ: معيار جي جذبي قدر کي y-axis جي طور تي وٺو، flumequine معيارن جي حل (ppb) جي ڪنسنٽريشن جي سيمي لاگارٿمڪ جيئن x-axis.

--- جيفلوميڪائنهر نموني جي ڪنسنٽريشن (ppb)، جنهن کي ڪليبريشن وکر مان پڙهي سگهجي ٿو، هر نموني جي ملندڙ جلندڙ گھڻن سان ضرب ڪيو ويندو آهي، ۽ نموني جي حقيقي ڪنسنٽريشن حاصل ڪئي ويندي آهي.

ELISA ڪٽ جي ڊيٽا گھٽائڻ لاءِ، خاص سافٽ ويئر تيار ڪيو ويو آھي، جيڪو درخواست تي مهيا ڪري سگھجي ٿو.

11. حساسيت، درستگي ۽ درستگي

ٽيسٽ حساسيت:0.3 پي بي بي

ماکي جو نمونو گھٽائڻ وارو عنصر: 2

معلوم ڪرڻ جي حد

ماکي جو نمونو ------------------------------------------------ -1 پي بي

درستگي

ماکي جو نمونو ------------------------------------------- 90±20 %

سڌائي

ELISA ڪٽ جي تبديلي جي کوٽائي 10٪ کان گهٽ آهي.

12. نوٽيس

12.1 معيارن ۽ نمونن لاءِ حاصل ڪيل جاذب قدرن جا اوسط قدر گھٽجي ويندا جيڪڏھن ريگينٽس ۽ نمونن کي ڪمري جي حرارت (20-25 ℃) تي ضابطو نه ڪيو ويو آھي.

12.2 ناڪامي ورجائي کان بچڻ لاءِ قدمن جي وچ ۾ مائڪرو ويلز کي سڪي وڃڻ نه ڏيو ۽ مائڪرو ويلز هولڊر کي ٽيپ ڪرڻ کان پوءِ فوري طور تي ايندڙ قدم کي هلائڻ.

12.3.استعمال ڪرڻ کان اڳ هر reagent کي homogenize.

12.4.پنهنجي چمڙي کي اسٽاپ حل کان پري رکو ان لاءِ 2M H آهي₂SO₄حل.

12.5 پراڻا ڪٽ استعمال نه ڪريو.مختلف بيچ جي ريجنٽ کي تبديل نه ڪريو، ڇاڪاڻ ته اهو حساسيت کي ڇڏي ڏيندو.

12.6 اسٽوريج حالت:

ELISA ڪٽ کي 2-8 ℃ تي رکو، منجمد نه ڪريو.سيل باقي مائڪرو ويل پليٽ سڀني انڪيوبيشن دوران سڌي سج جي روشني کان پاسو ڪريو.مائڪروٽيٽر پليٽ کي ڍڪڻ جي سفارش ڪئي وئي آهي.

12.7 خراب ٿيڻ واري ريجنٽس لاءِ اشارا:

Substrate حل ڇڏڻ گهرجي جيڪڏهن اهو رنگ بدلجي وڃي.

ريجينٽ خراب ٿي سگھي ٿو جيڪڏھن صفر معيار جي جذبي قدر (450/630nm) 0.5 (A450nm＜0.5) کان گھٽ آھي.

12.8 حل A ۽ حل B شامل ڪرڻ کان پوءِ رنگن جي رد عمل کي 15 منٽ جي ضرورت پوندي. ۽ توھان انڪيوبيشن جي وقت جي حد کي 20 منٽ کان وڌيڪ ڊگھو ڪري سگھو ٿا جيڪڏھن رنگ ايترو ھلڪو آھي جو اندازو لڳايو وڃي.ڪڏهن به 25 منٽ کان وڌيڪ نه ڪريو، ان جي برعڪس، انڪيوبيشن جو وقت صحيح طرح سان ننڍو ڪريو.

12.9 بهترين ردعمل جي درجه حرارت 25 ℃ آهي.اعلي يا گهٽ درجه حرارت حساسيت ۽ جذباتي قدرن جي تبديلين کي ڏسندي.

13. اسٽوريج

اسٽوريج حالت: 2-8 ℃.

اسٽوريج جي مدت: 12 مهينا.